一种蛋白质定量方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用pH选择性二甲基化标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。包括：选择性二甲基化标记、使用mascot distiller软件对一级谱肽段定量、使用“force-find”程序对二级谱肽段定量。蛋白质样品首先使用胰蛋白酶进行酶解；酶解产物先于酸性条件下在反相捕集柱上进行选择性的N-端氨基二甲基化标记；然后在碱性条件下在反相捕集柱上对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；以精氨酸结尾的肽段使用mascot distiller进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用“force-find”程序进行定量。本发明的优点是与传统的基于b,y离子的两端标记二级谱定量方法相比，其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。
【专利说明】-种蛋白质定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用抑选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量 方法。其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。
【背景技术】
[0002] 定量分析蛋白质组的动态变化，是当前研究蛋白质功能、掲示细胞生物机理、寻找 疾病蛋白标记物和药物祀标的迫切需要。在过去的数十年中，基于稳定同位素标记和质谱 的蛋白质组定量方法已逐渐取代传统的基于二维凝胶电泳的定量方法。根据用于定量的谱 图的不同，可W将基于稳定同位素和质谱的蛋白质组定量方法分为基于一级质谱的定量方 法和基于二级质谱的定量方法。
[0003] 基于一级质谱的定量方法是通过比较来自不同样品的轻重标记肤段的一级质谱 峰强度或者谱峰面积来获得蛋白的比值信息。它主要包括SILAC、酶促标记、ICAT W及 二甲基化标记等方法。该些方法都存在如下缺点；1、一级质谱图充满了背景噪音及未归属 的谱峰，它们会显著地降低信噪比并限制定量的精度和动态范围；2、来自不同样品的同一 肤段经轻重标记后会在一级质谱上会出现成对的两个谱峰，该就大大增加了谱图的复杂程 度（Anal Qiem 2011;83:6026-33)。
[0004] 相比基于一级质谱的定量方法，基于二级谱的定量方法很好的解决了上述问题， 因为采用该种方法，来源于不同样品的轻重标记肤段在一级谱上质荷比相同，在二级谱上 出现成对的碎片峰（Anal. Chem. 2011，83, 4775 - 4781)。
[0005] 目前，基于二级谱的定量方法主要包括基于低质量端报告离子的iTraq、TMT等方 法和基于b，y离子的IPTL、IVTAL、QI化等方法。其中基于b，y离子的方法由于使用的成 对离子数更多因而准确度、精密度更好，是近两年兴起的一种受到广泛关注的定量方法。目 前，该种方法主要还存在如下缺陷；首先，目前报道的基于b，y离子的二级谱定量方法操作 步骤都比较繁琐；其次，目前报道的基于b，y离子的二级谱定量方法定量覆盖度都不高，且 存在较严重的低估效应（Chem. Commun.，2012, 48, 6265-6267)。
[0006] 针对基于b，y离子的二级谱定量方法存在的上述问题，我们开发了一种使用抑选 择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。该方法通过优化现有文献报道 的成本最低、且操作相对简单的抑选择性二甲基标记方法（Anal.化em.，2013, 85, 2478 -2485)，并将一级二级谱的定量信息进行有机结合，显著降低了操作复杂程度、提高了定量 的准确度、精密度和覆盖度。
【发明内容】
[0007] 本发明发展了一种使用抑选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定 量方法，其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。
[0008] 为了实现该目的，本发明的技术方案是：
[0009] 1、采用膜蛋白酶酶切蛋白样品，膜蛋白酶能酶切蛋白的精氨酸位点和赖氨酸位 点，因此会产生W精氨酸和赖氨酸结尾的肤段。
[0010] 2、将一份酶解后的蛋白样品上样至C18反相捕集柱上，于酸性条件下选择性的对 肤段氨基端进行二甲基化标记；使用A相（2%ACN+0. 1%FA+98%H20)冲洗捕集柱后用50mM的 磯酸缓冲溶液平衡捕集柱；再于碱性条件下选择性的对酶解产生的赖氨酸上的侧链氨基进 行二甲基化标记，最后使用A相（2%ACN+0. 1%FA+98%H20)冲洗捕集柱。
[0011] 3、重复上述步骤对另一份蛋白样品的酶解产物进行标记。
[0012] 4、使用B相（80%ACN+0. 1%-5%FA+20%H20)将标记后的两份蛋白样品洗脱收集下 来，出盐蒸干后进行后续的质谱分析。
[0013] 5、对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，其中鉴定出的W赖氨酸结尾的肤 段通过"force-find"程序进行基于二级谱的定量分析；鉴定出的W精氨酸结尾的肤段通 过mascot distiller软件进行基于一级谱的定量分析。
[0014] 本发明具有如下优点：
[0015] 1、标记效率高，标记选择性好；使用优化的抑选择性二甲基标记方法，其肤段N端 二甲基化和赖氨酸上氨基二甲基化的标记效率和标记选择性都能打到95% W上；
[0016] 2、操作步骤简单；整个标记过程只需要进行两步较为简单的二甲基化标记，无须 复杂的除盐蒸干等步骤；
[0017] 3、定量精密度、准确度、覆盖度高；该方法在二级谱和一级谱的定量准确度、精密 度上均与文献报道的结果相当，且由于能同时获得基于一级谱和二级谱的定量结果，通过 将它们结合能获得更好的定量准确度、精密度W及覆盖度。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1本发明方法的总反应流程图
[0019] 图2使用抑选择性二甲基标记对牛血清白蛋白酶解产物进行标记，a:对牛血清 白蛋白酶解肤段氨基端进行甲酵标记（+2細a) ;b:氨基端甲酵标记的基础上进一步进行肤 段侧链氨基気带甲酵标记（+32化）；c:对牛血清白蛋白酶解肤段氨基端进行気带甲酵标记 (+32化）；d:氨基端気带甲酵标记的基础上进一步进行肤段侧链氨基甲酵标记（+2細a)。
[0020] 图3使用抑选择性二甲基标记对1:1混合的两份酵母酶解产物进行标记，a: 1:1 混合的两份酵母酶解产物的一张一级质谱图；b: -级质谱图中质荷比为568. 34的母离子 的二级质谱图。
[0021] 图41:1混合的两份酵母酶解产物通过抑选择性二甲基标记和一级二级谱结合定 量的蛋白质定量方法所鉴定和定量到的蛋白数目。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 如图1所示，酵母蛋白由膜蛋白酶酶解产生W赖氨酸和精氨酸为駿基端的肤段， 其中蛋白质与酶用量的质量比为l/25(w/w)，温度为37C，pH=7. 5,酶解12h。将酶解产 物通入C18捕集柱化15mm i. dX50mm)，通入2%ACN除盐后。在酸性条件下对肤段的氨 基端进行选择性二甲基化标记，其中标记溶液组成为500 y 11%醋酸巧y L4%甲酵水溶液 巧y LO. 6M氯基测氨化轴溶液（溶于1%醋酸），流速50 y L/min，标记时间lOmin，标记完 成后通入A相（2%ACN+0. 1%FA+98%H20)去除过量标记溶液；再在碱性条件下对肤段的W赖 氨酸结尾的駿基端进行标记，其中标记溶液组成为500 y LSOmM磯酸缓冲液巧y L4%甲酵 水溶液巧y LO. 6M氯基测氨化轴溶液（溶于50mM磯酸缓冲液），流速50 y L/min，标记时 间lOmin，标记完成后通入A相（2%ACN+0. 1%FA+98%H20)去除过量标记溶液。最后通入B相 (80%ACN+0. 1%-5%FA+20%H20)洗脱并收集标记完成的肤段，进行后续液质联用分析(液相色 谱的分离梯度为90min，质谱采用HCD模式进行离子碎裂)。
[0024] 对质谱分析得到的结果.raw文件使用mascot distiller软件进行搜库分析，搜 库结果中鉴定出的W赖氨酸结尾的肤段通过"force-find"程序进行基于二级谱的定量分 析(对每个鉴定到的W赖氨酸结尾的肤段所对应的二级谱图所匹配的b，y离子对进行比例 分析，只有b，y离子对数大于4对的才给出相应谱图的比例结果，谱图比例结果为b，y离 子对比例结果的平均值，最后谱图的比例结果取平均值为相应肤段的比例结果）；鉴定出的 W精氨酸结尾的肤段通过mascot distiller软件进行基于一级谱的定量分析(在mascot distiller软件所导出肤段比例结果中，筛选出W精氨酸结尾的肤段结果即为相应肤段的 最终比例）。
[00幼 实施例2
[0026] 在酸性条件下对肤段的氨基端进行选择性二甲基化标记的标记溶液组成为 500 U L5mM盐酸巧U L4%甲酵水溶液巧U LO. 6M氯基测氨化轴溶液（溶于5mM盐酸），其他 过程同实施例1。
[0027] 实施例3
[0028] 在碱性条件下对肤段的W赖氨酸结尾的駿基端进行选择性二甲基化标记的标记 溶液组成换成500 U LSOmM NaAc溶液巧U L4%甲酵水溶液巧U LO. 6M氯基测氨化轴溶液 (溶于50mM NaAc溶液），其他过程同实施例1。
[0029] 表1该定量方法的定量准确度、精密度(分析样品为1:1混合的酵母蛋白）
[0030]
【权利要求】
1. 一种蛋白质定量方法，其是使用pH选择性二甲基化标记和一级二级谱结合定量的 蛋白质定量方法，包括：蛋白胰蛋白酶酶解产物在反相柱上于酸性条件下标记肽段末端氨 基，反相柱上于碱性条件下标记肽段侧链氨基；将标记完成的肽段洗脱下来进行质谱分析， 对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，使用mascot distiller软件对一级谱肽段定 量、使用文献报道的"force-find"程序对二级谱肽段定量；结合一级谱信息和二级谱信息 对蛋白进行定量分析。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，具体过程如下：将两份蛋白质样品分别 采用胰蛋白酶酶切；酶解产物分别上样到两个C18反相捕集柱上，在酸性条件（pH2. 8? 3. 2)下分别通入 4%(v/v)的 CH20 和 0· 6M 的 NaBH3CH (v/v=l: 1)或 4%(v/v)的 CD20 和4%(v/v)的NaBH3CH (v/v=l:l)，使肽段末端的氨基被二甲基化，标记完通入A相 (2%ACN+0. 1%FA+98%H20)除去过量标记试剂；然后在碱性条件（pH7. 5?8. 0)分别通入 4%(v/v)的 CD20 和 0· 6M 的 NaBH3CH (v/v=l: 1)或 4%(v/v)的 CH20 和 0· 6M 的 NaBH3CH (v/ v=l:l)下对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；标记完通入A相（2%ACN+0. 1%FA+98%H20)除 去过量标记试剂；通入B相（80%ACN+0. 1%-5%FA+20%H20)将标记完成的肽段洗脱下来进行 后续液质联用分析(液相色谱的分离梯度为90min，质谱采用HCD模式进行离子碎裂）;质谱 分析所产生的· raw文件使用mascot distiller软件进行搜库分析，搜库结果中以精氨酸 结尾的肽段直接使用mascot distiller软件进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用文献报 道的"force-find"程序进行定量。
3. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于：在C18捕集柱（0· 15mmi. dX50mm)上进行 酸性条件下二甲基标记末端氨基时间为4-10min ;碱性条件下二甲基标记侧链氨基的时间 为 15_20min〇
4. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于：使用mascot distiller软件对以精氨酸 结尾的肽段进行基于一级谱的定量，对mascot distiller软件所导出的肽段定量结果中， 提取出以精氨酸结尾的肽段的结果。
5. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于：使用"force-find"程序对以赖氨酸结尾 的肽段进行基于二级谱的定量，"￡〇1"(^-打11(1"程序是基于二级谱上成对的13, 7离子的强度 信息来进行定量的程序，成对数目4对或6对以上的肽段才给予报告。
【文档编号】G01N27/62GK104237363SQ201310240443
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】张丽华, 张珅, 吴琪, 周愿, 袁辉明, 杨开广, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所