一种傅立叶红外法测定微藻生物大分子含量的方法
【专利摘要】发明涉及一种傅立叶红外法测定微藻生物大分子含量的方法；从自然水体采集纯培养的藻株，培养到OD680达到1.0，将藻液离心，去清液，浓缩加入丙三醇；采用FTIR ReactIRTM45m傅立叶红外光谱仪对待测样品进行1000-3000cm-1的连续检测分析；FT-IR检测本底：利用软件iC QuantTM对结果进行统计分析的生物大分子的实际含量；将测定结果代入公式计算油脂AL、蛋白质Ap与碳本水化合物Ac的生物大分子的含量TL(mg)、TP(mg)、TC(mg)；本方法可以对细胞无伤害的同时快速检测出微藻油脂含量，蛋白质和碳水化合物的含量。
【专利说明】一种傅立叶红外法测定微藻生物大分子含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微藻生物工程【技术领域】。具体地涉及微藻油脂含量，蛋白质和碳水化合物的测量方法，尤其针对处于生长培养中的微藻细胞进行非侵入式的快速筛选、检测和/或分离。
【背景技术】
[0002]微藻是一类尺寸极其微小(0.2?500 μ m)、数量巨大、在占地球面积71%的海洋中无所不在的浮游生物，是海洋生态体系中的初级生产者，它们生产着海洋其它一切异养生物赖以生存的有机物质。微藻含有叶绿素a，并能进行光合作用。由于其个体小、比表面积大、代谢活性高、生长繁殖快、倍增时间短、易于培养，因可获得大量的藻体；并且其生物多样性极高，在世界上水生微藻的总种类数超过10万种,其中海洋微藻的总种类数可能多达几万种(目前已被确认的有4000?5000种)，可供筛选的含特异功能物质的微藻种类繁多；目前应用生物技术进行大量培养或生产的微藻分属于4个藻门:蓝藻门、绿藻门、金藻门和红藻门。在形形色色的微藻中，可供人类利用的生物活性物质的类别很多。目前世界上虽已开发利用的微藻种类很少，但它们在人类所需求的保健食品、医药品、化妆品、水产养殖动物幼体的开口饵料、化工、能源、农业、环保等方面已显示出其广阔的开发应用前景。
[0003]生物柴油是一种已经得到证明的燃料，以其为可再生性的环保燃料能源而得到世界的广泛关注。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生资源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕榈油、椰子油、回收烹饪油、动物油以及微生物油脂等)为原料而制成，具备与化石燃料，石油、柴油相近的性能。生产和使用生物柴油的技术已经存在50余年，与石油柴油相比，生物柴油的某些性能更加优良。主要表现在:
[0004]1.生物柴油具有相对较高的运动粘度，这使得生物柴油在不影响燃油雾化的情况下，更容易在汽缸内壁形成一层油膜，从而提高运动机件的润滑性，降低机件的磨损。
[0005]2.生物柴油的闪点较石化柴油高，有利于安全运输、储存。
[0006]3.十六烧值较高,一般大于50,抗爆性能优于石化柴油。
[0007]4.生物柴油含氧量高于石化柴油，可达10%，在燃烧过程中所需的氧气量较石化柴油少，燃烧、点火性能优于石化柴油。
[0008]5.无毒性，而且生物分解性良好(98%可降解)，健康环保性能良好。除了供公交、卡车等柴油机作替代燃料外，也可作海洋运输、水域动力设备、地底矿业设备，燃油发电厂等非道路用柴油机的替代燃料。
[0009]6.基本不含芳香族烃类成分，因此不具致癌性，而且硫、铅、卤族元素等有害物质含量极少。
[0010]7.既可作为添加剂促进燃烧效果，又是燃料，具有双重效果。
[0011]8.生物柴油以一定的比例与石化柴油调和使用，可以降低油耗、提高动力特性，降低排放污染率。研究发现，用生物柴油和2#柴油1:1混合，可以达到最佳的燃烧工况。
[0012]9.环境友好，采用生物柴油的燃烧生成物中，有毒有机物排放量仅为普通柴油1/10，颗粒物为石化柴油20%，CO2和CO排放量仅为石化柴油的10%，混和生物柴油可将含硫排放从500ppm降低到5ppm。
[0013]面对植物原料生产生物柴油的诸多问题，利用微藻产油具有不与农业争地的明显优势，而且可用海水作为天然培养基进行大量繁殖。跟植物一样，微藻也是利用光照产油，但却比植物光合效率高10倍，微藻生长迅速快，而且含有极其丰富的油脂。大多数微藻的产油量为油料作物的10-200倍，远远超过了最好的油料作物的产油量。
[0014]油脂含量所占藻细胞干重(以下简称微藻油脂含量)是评价微藻作为生物柴油原料潜力的关键指标之一。传统油脂含量测定方法主要是有机溶剂称量法，如用氯仿/甲醇或乙醚提取、挥干溶剂称重测定油脂含量，这种方法需要大量的微藻干粉，步骤复杂，时间久，能耗大，同时在称重法操作流程中，利用有机溶剂(氯仿和甲醇)超声萃取藻体油脂成分，大量叶绿素溶解于甲醇溶剂可能导致称重法测得油脂含量有所偏差，影响其准确性，因而不适合实验室层面的微藻筛选。目前快速检测微藻油脂含量的方法主要是荧光染料法，染料通过侵入藻细胞内部，通过油脂与染料结合后定量测定微藻油脂含量，其中目前最常用的荧光染料是尼罗红(Nile Red)。但该方法因染料对细胞的毒副作用造成很多检测细胞死亡，同时因该法检测灵敏度高，背景干扰严重，对实验操作人员水平和实验条件要求高，同时，尼罗红荧光染色法分析时，因藻体荧光强度与油脂含量的线性关系是基于称重法建立的，因此荧光法分析结果也有一定程度偏差，进而影响该检测方法的准确度。从上世纪70年代末开始，国内外科研人员致力于高产油微藻的筛选培育，但因缺乏一种实用快速简便的微藻油脂含量的检测方法，造成筛选周期长，耗费大量人力物力，到目前为止仍未筛选到适合微藻产油产业化发展需要的优良藻种。因此建立简便快捷的油脂含量检测方法已成为限制产油微藻筛选培育发展的关键因素，也是制约微藻生物柴油产业化的原因之一。由于微藻油脂含量(％)与藻种，生长周期，培养条件及生产工艺密切相关，因此建立快速简便，非侵入，对细胞无伤害的，测定微藻油脂，蛋白质和碳水化合物含量的方法无论对于藻种筛选还是培养条件优化，以及采收时期的确定都有十分重要的意义。目前，利用傅立叶红外法(FT-1R)快速测量微藻油脂含量，蛋白质和碳水化合物的研究报告和相关专利技术国内外报道较少，而且FT-1R检测均需将生物样品做成固体粉末，过程耗时，样品需要量大，因此迫切需要开发一种高效、准确、原位、快速、全程跟踪、高通量的检测微藻产油能力，同时还可检测蛋白质和碳水化合物的含量的技术和方法体系。
【发明内容】
[0015]本发明的目的在于提供一种非侵入式，对处于生长培养中的微藻细胞内油脂含量，蛋白质和碳水化合物进行快速测量的方法，以克服公知技术中存在的缺陷。例如称重法耗时长，需要大量样品以及尼罗红荧光染色法毒副作用大，干扰严重，只能测定微藻油脂含量等问题。
[0016]本发明采用FT-1R法对微藻细胞油脂、蛋白质与碳水化合物含量进行定量分析，其原理是油脂分子中的甲基与亚甲基，蛋白质分子中的酰胺基以及碳水化合物分子中的C-OH 与 C-O-C 分别在红外光谱的 2800-3000011' 1500-1700cm_1 和 1000-1200CHT1 处有特征吸收峰，再经过特征峰面积的计算便可求得三种生化组分的含量。
[0017]利用FTIR ReactIR?45m 傅立叶红外光谱仪(METTLER TOLEDO Switzerland)检测微藻细胞生物大分子的含量，可以省去微藻干燥的过程，省时，能耗低，可实现原位实时在线的全程检测，能够监测微藻细胞生长过程中生物大分子的变化情况。本专利研究发现通过加入抗干扰剂丙三醇可以减少待测样品中水的影响。利用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪检测样品之后使用软件iC Quant?对油脂(\)、蛋白质(Ap)与碳水化合物(A。)的特征峰面积积分,并按以下公式计算三种生物大分子的含量IY(mg)、Tp (mg)、Tc (mg)。
[0018]Al=-2.30+78.96 X Tl
[0019]Ap=-0.27+12.72 X Tp
[0020]Ac=0.07+2.05 X Tc
[0021]本发明的方法包含如下步骤:
[0022]I)藻种的准备:从自然水体采集的样品需要经过分离筛选获得纯培养的藻株，扩大培养(BG-11培养基)到100ml，藻株处于对数生长期，0D680达到1.0，准备FT-1R分析；如果已经是纯培养的藻株只需活化处理使藻株处于对数生长期，扩大培养(BG-11培养基)到100ml, 0D680达到0.8，准备FT-1R分析。
[0023]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0024]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0025]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0026]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0027]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0028]7)结果计算:将上述测定结果代入公式计算油脂、蛋白质与碳水化合物的总量。
[0029]本发明的优点在于:本发明的一种用傅立叶红外法(FT-1R)原位实时在线快速测量微藻液体样品中油脂含量，蛋白质和碳水化合物的含量方法，采用非侵入式，对细胞无伤害的方法可以同时快速检测微藻油脂含量，蛋白质和碳水化合物的含量。该发明可以实时检测和监控微藻油脂含量，蛋白质和碳水化合物的含量的变化。该发明省去了常规傅立叶红外法固体制片的步骤，可以在线监测液体样品。同时发明通过添加丙三醇减少液体样品中水的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为本发明的检测流程图
【具体实施方式】
[0031]实施例1
[0032]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的小球藻(Chlorella vulgaris)的油脂含量，具体的操作步骤如下:
[0033]I)以Chlorella vulgaris为对象,首先在BG-11固体培养基上活化该藻种,挑取单克隆接种到20ml BG-11液体培养基，150转，1500_2500Lux，28 °C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0034]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0035]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0036]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0037]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0038]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0039]7)结果分析:将上述测定结果代入公式\=-2.30+78.96XTl计算小球藻油脂的含量。通过上述检测方法测定小球藻的油脂含量为42.6%。
[0040]实施例2
[0041]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的小球藻(Chlorella vulgaris)的蛋白质含量，具体的操作步骤如下:
[0042]I)以Chlorella vulgaris为对象,首先在BG-1l固体培养基上活化该藻种,挑取单克隆接种到20ml BG-11液体培养基，150转，1500_2500Lux，28 °C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0043]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0044]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0045]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0046]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0047]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0048]7)结果分析:将上述测定结果代入公式Ap=-0.27+12.72XTP计算小球藻蛋白质的含量。通过上述检测方法测定小球藻的蛋白质含量为45.3%。
[0049]实施例3
[0050]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的小球藻(Chlorella vulgaris)的碳水化合物的含量，具体的操作步骤如下:
[0051]I)以Chlorella vulgaris为对象,首先在BG-11固体培养基上活化该藻种,挑取单克隆接种到20ml BG-11液体培养基，150转，1500_2500Lux，28 °C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0052]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0053]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0054]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0055]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0056]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0057]7)结果分析:将上述测定结果代入公式Αε=0.07+2.05XTc计算小球藻碳水化合物的含量。
[0058]通过上述检测方法测定小球藻的碳水化合物含量为9.72%。
[0059]实施例4
[0060]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的油脂的含量,具体的操作步骤如下:
[0061]I)以Phaeodactylum tricornutum为对象，首先在BG-11固体培养基上活化该藻种，挑取单克隆接种到20ml BG-1l液体培养基，150转，1500-2500Lux，28°C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0062]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0063]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0064]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0065]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0066]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0067]7)结果分析:将上述测定结果代入公式\=_2.30+78.96XTl计算三角褐指藻油脂的含量。
[0068]通过上述检测方法测定三角褐指藻的油脂含量为33.8%。
[0069]实施例5
[0070]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的蛋白质的含量,具体的操作步骤如下:
[0071]I)以Phaeodactylum tricornutum为对象，首先在BG-11固体培养基上活化该藻种，挑取单克隆接种到20ml BG-1l液体培养基，150转，1500-2500Lux，28°C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0072]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0073]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0074]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0075]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0076]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0077]7)结果分析:将上述测定结果代入公式Ap=-0.27+12.72XTp计算三角褐指藻蛋白质的含量。
[0078]通过上述检测方法测定三角褐指藻的蛋白质含量为36.4%。
[0079]实施例6
[0080]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的碳水化合物的含量,具体的操作步骤如下:
[0081]I)以三角褐指藻藻(Phaeodactylum tricornutum)为对象，首先在BG-11固体培养基上活化该藻种，挑取单克隆接种到20ml BG-1l液体培养基，150转，1500-2500Lux,
28°C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28 °C，1500-2500Lux,静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0082]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0083]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0084]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0085]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0086]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0087]7)结果分析:将上述测定结果代入公式Ac=0.07+2.05XTc计算小球藻碳水化合物的含量。
[0088]通过上述检测方法测定三角褐指藻的碳水化合物含量为26.1%。
[0089]实施例7
[0090]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的油脂的含量，具体的操作步骤如下:
[0091]I)以Botryococcus braunii为对象,首先在BG-11固体培养基上活化该藻种,挑取单克隆接种到20ml BG-1l液体培养基，150转，1500_2500Lux，28°C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0092]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0093]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0094]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0095]5)FT-1R检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0096]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0097]7)结果分析:将上述测定结果代入公式\=_2.30+78.96 X Tl计算布朗葡萄藻油脂的含量。
[0098]通过上述检测方法测定布朗葡萄藻的油脂含量为41.7%。
[0099]实施例8
[0100]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的蛋白质的含量，具体的操作步骤如下:
[0101]I)以Botryococcus braunii为对象,首先在BG-11固体培养基上活化该藻种,挑取单克隆接种到20ml BG-1l液体培养基，150转，1500_2500Lux，28°C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0102]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0103]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0104]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0105]5)FT_IR检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0106]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0107]7)结果分析:将上述测定结果代入公式Ap=-0.27+12.72XTp计算三角褐指藻蛋白质的含量。
[0108]通过上述检测方法测定布朗葡萄藻的蛋白质含量为17%。
[0109]实施例9
[0110]用本发明所述的检测方法测定已纯培养的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的碳水化合物的含量，具体的操作步骤如下:
[0111]I)以布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)为对象，首先在BG-11固体培养基上活化该藻种，挑取单克隆接种到20ml BG-1l液体培养基，150转，1500-2500Lux，28°C培养48-72小时，将培养好的藻液20ml转接到10ml的液体培养基中，28°C，1500_2500Lux，静止培养48-72小时，当OD达到1.0时候离心收集藻液，准备FT-1R分析。
[0112]2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基。
[0113]3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%。
[0114]4)FT_IR检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析
[0115]5)FT_IR检测本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的连续检测分析，作为对照和本底初始值。
[0116]6)数据统计分析:利用软件iC Quant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量。
[0117]7)结果分析:将上述测定结果代入公式Αε=0.07+2.05 X Tc计算小球藻碳水化合物的含量。
[0118]通过上述检测方法测定布朗葡萄藻的碳水化合物含量为32%。
【权利要求】
1.一种傅立叶红外法测定微藻生物大分子含量的方法，其特征在于:包含如下步骤: 1)藻种的准备:从自然水体采集的样品经过分离筛选获得纯培养的藻株，扩大培养到100ml，培养基为BG-1l培养基，藻株处于对数生长期，0D680达到1.0，准备FT-1R分析；如果已经是纯培养的藻株只需活化处理使藻株处于对数生长期，扩大培养到100ml，培养基为BG-1l培养基，0D680达到0.8，准备FT-1R分析； 2)浓缩藻液:将上述10ml藻液6000rpm离心5分钟，去除上清液，浓缩100倍，加入Iml的BG-1l液体培养基； 3)添加抗干扰剂:为减少水对红外吸收的影响，加入丙三醇，使其终浓度为40%； 4)FT-1R检测样品:采用FTIR ReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对上述待测样品进行1000-3000cm_1的连续检测分析； 5)FT-1R检测本底:采用FTIRReactIR?45m傅立叶红外光谱仪对含有40%丙三醇Iml的BG-1l培养基进行lOOOjOOOcnT1的连续检测分析，作为对照和本底初始值； 6)数据统计分析:利用软件iCQuant?对步骤4和步骤5的结果进行统计分析，并用步骤4的结果减去步骤5的结果即为待测样品中生物大分子的实际含量； 7)结果计算:将上述测定结果按以下公式计算油脂\、蛋白质Ap与碳水化合物A。的生物大分子的含量 Tli(Iiig)、Tp (mg)、Tc (mg)；
Al=-2.30+78.96 X Tl
Ap=-0.27+12.72 X Tp
Ac=0.07+2.05XTe。
【文档编号】G01N21/3563GK104237155SQ201310249852
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】孙洪磊, 吕静, 何皓, 傅鹏程, 齐泮仑, 兰玲, 付兴国, 胡徐腾 申请人:中国石油天然气股份有限公司