一种检测伏马毒素b1的试纸卡及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用胶体金免疫层析法检测伏马毒素B1的试纸卡及其应用。试纸卡包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有伏马毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫喷涂有伏马毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述伏马毒素试纸卡检测谷物及饲料中伏马毒素B1残留的方法。本发明所提供的试纸卡具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。
【专利说明】-种检测伏马毒素 B1的试纸卡及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测伏马毒素 B1的试纸卡及其应用，具体涉及一种用于检测伏 马毒素 B1的胶体金试纸卡，其特别适用于黄豆、玉米等谷物及饲料样本中伏马毒素 B1残留 的检测。
【背景技术】
[0002] 伏马毒素 B1 (Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素，目前已知有28种衍 生物，分为A、B、C、P四类。其中以FBI最为常见，在自然污染的玉米中，以伏马毒素 B1量 最多，约占伏马毒素总量的70%。伏马毒素 B1与马脑白质软化症、猪的肺水肿症侯群以及人 类食道癌等人畜疾病有关。另外，伏马毒素 B1还是一种慢性促癌剂，能引起灵长类动物的 动脉粥样硬化样改变。
[0003] 国内外已建立了多种伏马毒素的检测方法，已经应用的有高效液相色谱法 (HPLC)、毛细管气相色谱法（GC)、毛细管电泳技术（CE)、液质联用（LC/MS)、气质联用（GC/ MS)及酶联免疫吸附检测（ELISA)等方法。其中高效液相色谱法（HPLC)，灵敏度高，在全球 范围内的玉米及其制品的调查中，90%以上的实验室用的都是HPLC法，其检测限可以达到 0.05、. 1 mg/kg。但是，该法需要对检测样品进行严格的预处理，仪器化程度高且价格昂 贵，分析速度慢，同时要求有专业的操作人员，不利于在基层推广使用及大量样本筛选。免 疫学技术具有敏感、特异、简便的特点，近年来已被应用于伏马毒素 B1残留检测。胶体金免 疫层析法检测时间短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于 进行现场快速筛选。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的伏马毒素 B1 残留检测试纸卡。
[0005] 本发明所提供的检测伏马毒素 B1的试纸卡，包括样本吸收垫（1)、结合物释放垫 (2)、反应膜（3)、吸水垫（4)和底板（7);所述反应膜上具有包被有伏马毒素 B1半抗原-载 体蛋白偶联物的检测线（5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6)，所述结合物释放垫（2)喷 涂有伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物。
[0006] 所述伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物是由伏马毒素 B1半抗原与载体蛋白 偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、甲状腺蛋 白。
[0007] 所述伏马毒素 B1单克隆抗体是以伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫 原免疫动物获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。
[0008] 所述样本吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反应膜（3)、吸水垫（4)依次粘贴在底板 (7)上，所述结合物释放垫1/2~2/3被覆盖于样本吸收垫下。
[0009] 所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样本吸收垫为玻璃棉或聚酯 材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸卡的方法，其包括步骤：
[0011] 1)制备喷涂有伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0012] 2)制备具有包被有伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗 鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0013] 3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和底板组装成 试纸卡。
[0014] 具体地说，步骤包括：
[0015] 1)半抗原制备：将伏马毒素 B1与对苯二甲醛反应得到伏马毒素 B1半抗原；
[0016] 2)将伏马毒素 B1半抗原与载体蛋白偶联，得到伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶 联物；
[0017] 3)用伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠,将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞 通过融合、筛选，得到伏马毒素 B1单克隆抗体杂交瘤细胞株；
[0018] 4)提取小鼠 IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0019] 5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0020] 6)将步骤3)制备的伏马毒素 B1单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到伏 马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物；
[0021] 7)将伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37°C烘 60min后取出，置于干燥环境中保存备用；
[0022] 8)将伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，并将羊抗 鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；
[0023] 9)将样本吸收垫用含0. 5%牛血清白蛋白（体积百分含量)、pH为7. 2、0. lmol/L磷 酸盐缓冲液浸泡2h，37°C下烘干2h ;
[0024] 10)在底板上按顺序粘贴上样本吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样本吸收 垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30°C条件下可保存 12个月。
[0025] 本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸卡检测黄豆、玉米等谷物及饲料 (原料、配合料、浓缩料）样本中伏马毒素 B1残留的方法，它包括步骤：
[0026] ( 1)样本前处理；
[0027] (2)用试纸卡进行检测；
[0028] (3)分析检测结果。
[0029] 本发明的伏马毒素 B1快速检测试纸卡采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层 析分析技术，将伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样本中的 伏马毒素 B1在流动过程中，与结合物释放垫上的伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物 结合，形成毒素-抗体-胶体金标记物。样本中的毒素与反应膜检测线上的伏马毒素 B1半 抗原-载体蛋白偶联物竞争结合伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色 条带有无来判断待测样本液中是否含有伏马毒素 B1残留。
[0030] 检测时，样本经处理后滴入试纸卡卡孔内，当伏马毒素 B1在样本中的浓度低于检 测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T)和质控线（C)内各出现一条红色条带；如果 伏马毒素 B1在样本中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与伏马毒素 B1全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物结合 而不出现红色条带。如图4所示。
[0031] 阴性：当质控线（C)显示出红色条带，检测线（T)同时也显示出红色条带，判为阴 性。
[0032] 阳性：当质控线（C)显示出红色条带，而检测线（T )不显色，判为阳性。
[0033] 无效：当质控线（C)不显示出红色条带，则无论检测线（T)显示出红色条带与否， 该试纸卡均判为无效。
[0034] 本发明的试纸卡具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各 种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸卡检测伏马毒素 B1残留的方法简 便、快速、直观、准确、成本低、易推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1为伏马毒素 B1半抗原合成图。
[0036] 图2为伏马毒素 B1半抗原核磁共振氢谱图。
[0037] 图3为试纸卡剖面结构示意图。
[0038] 图4a、4b、4c为试纸卡检测结果判定图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0040] 实施例1伏马毒素 B1检测试纸卡的制备
[0041] 该试纸卡的制备方法主要包括以下步骤：
[0042] 1)制备喷涂有伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0043] 2)制备具有包被有伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗 鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0044] 3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和底板组装成 试纸卡。
[0045] 下面分步详细叙述：
[0046] 1、伏马毒素 B1半抗原的制备
[0047] 36mg伏马毒素和lml二甲基亚砜（DMS0)的混合液，室温下缓慢滴加入到14mg对 苯二甲醛的lml DMS0溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2-4小时，除去溶剂，柱层析纯化 得到伏马毒素对苯二甲醛单缩合物，合成路线如图1。
[0048] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，核磁图谱说明：8. 0 ppm附近增加 的芳环信号峰以及9. 9 ppm附近增加的醛基信号峰，说明半抗原合成成功。
[0049] 2、免疫原的制备
[0050] 取半抗原13mg溶解于0. 8ml二甲基甲酰胺（DMF冲得到溶液I ;取牛血清白蛋白 (BSA) 36mg使之充分溶解在3. 2ml 0. lmol/L的CB (pH9. 6)溶液中得到溶液II，将溶液I 逐滴缓慢滴加到溶液II中，并于室温搅拌反应24h，用0. Olmol/L的PBS在4°C下透析三天， 每天更换三次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。
[0051] 3、包被原的制备
[0052] 将BSA换为卵清蛋白（0VA)按上述方法制备得到包被原。
[0053] 4、单克隆抗体的制备方法
[0054] ( 1)动物免疫
[0055] 将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100 μ g/只，使其产生 抗血清。
[0056] (2)细胞融合和克隆化
[0057] 取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1 (数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采 用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化， 直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0058] (3)细胞冻存和复苏
[0059] 将杂交瘤细胞用冻存液制成IX 106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏 时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0060] (4)单克隆抗体的制备与纯化
[0061] 将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ml/只，7天后腹腔注射伏马毒素 B1的 单克隆杂交瘤细胞株5X 106个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯 化，-20°C保存。
[0062] 5、羊抗鼠抗抗体的制备
[0063] 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗 抗体。
[0064] 6、单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0065] (1)胶体金的制备
[0066] 用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0. 01% (质量百分含量)，取100ml置于锥形瓶 中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1. 25ml 1%柠檬酸三钠， 继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积， 4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
[0067] (2)金标抗体的制备
[0068] 在磁力搅拌下，用0. 2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7. 0,按每毫升胶体金 溶液中加入2(Γ50 μ g抗体的标准向胶体金溶液中加入伏马毒素 B1单克隆抗体，继续搅拌 混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置lOmin。 12000r/min、4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗漆两次，用体积为初始胶体金 体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。
[0069] 复溶缓冲液：含酪蛋白0· 029Γ0. 1%、吐温-20 0· 059Γ0. 2% (质量百分含量)、ρΗ7· 2 的0· 02mol/L磷酸盐缓冲液。
[0070] 7、结合物释放垫的制备
[0071] 将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（BSA在缓冲液中的浓度为0. 5%)、 ρΗ7· 2,0· 5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿lh，37°C烘3h备用。用Isof low喷膜仪将制备 好的伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每lcm结合物释 放垫喷涂0. 01ml伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37°C环境中(湿度< 30%) 60min后取出，置于干燥环境(湿度< 30%)中保存备用。
[0072] 8、反应膜的制备
[0073] 将伏马毒素 B1半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗 抗体包被在反应膜上构成质控线。
[0074] 包被过程：用磷酸缓冲液将伏马毒素 B1半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线)，包被量为0. 8 μ 1/cm ;用 0· 01mol/L、ρΗ7· 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200 μ g/ml，用Isoflow点膜仪 将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线)，包被量为1. 0 μ 1/cm。将包被好的反应膜置于 37°C条件下干燥2h，备用。
[0075] 9、样本吸收垫的制备
[0076] 将样本吸收垫置于含0. 5%牛血清白蛋白（体积百分含量)、pH7. 2、0. lmol/L磷酸 盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。
[0077] 10、试纸卡的组装
[0078] 将样本吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结 合物释放垫从起始端有2/3区域被样本吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端 连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样本吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水 垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T线)和质控线 (C线）均为与所述试纸卡的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一 侦h质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸卡用机器切成3_宽的小条，装在 特制的塑料制卡中，形成试纸卡，4~30°C条件下可保存12个月。
[0079] 实施例2样本中伏马毒素 B1残留的检测
[0080] 1、样本的前处理
[0081] 称取4. 0g±0. 05g粉碎的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入3g NaCl，5ml甲醇 和5ml去离子水，用涡旋仪涡动3min ;室温（20-25°C)3000g以上离心5min ;移取100μ 1上 清液与200 μ 1样本复溶液（0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液）混匀后待检。
[0082] 2、用试纸卡进行检测
[0083] 用吸管吸取待检样本溶液垂直滴加2-3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应 7?10min，判定结果。其他时间判定无效。
[0084] 3、分析检测结果
[0085] 阴性（_) :C线显色，T线显色，无论颜色深浅，均表示样本中伏马毒素 B1浓度低于 检测限，如图4a。
[0086] 阳性（ + ): C线显色，T线不显色，表示样本中伏马毒素 B1浓度等于或高于检测限， 如图4b。
[0087] 无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效，如图4c。在此情 况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。
[0088] 实施例3样本检测实例
[0089] 1、检测限试验
[0090] 取空白谷物(黄豆、玉米)及饲料，在其中分别添加伏马毒素 B1至终浓度为10、20、 40 μ g/kg，取试纸卡进行检测，每个样本重复测定三次。
[0091] 用试纸卡检测黄豆、玉米、饲料样本时，当其中伏马毒素 B1添加浓度为10 μ g/kg 时，试纸卡上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中伏马毒素 B1添加浓度为20、 40 μ g/kg时，试纸卡质控线显色，但检测线不显色，呈阳性，表明本试纸卡对谷物、饲料样本 中伏马毒素 B1的检测限为20 μ g/kg。
[0092] 2、假阳性率、假阴性率试验
[0093] 取阳性黄豆、玉米、饲料样本各20份和阴性黄豆、玉米、饲料样本各20份，用三批 试纸卡进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。
[0094] 表1检测阳性样本结果
[0095]
【权利要求】
1. 一种检测伏马毒素 B1的试纸卡，包括样品吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反应膜 (3)、吸水垫（4)和底板（7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有伏马毒素 B1半抗原-载 体蛋白偶联物的检测线（5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6)，所述结合物释放垫（2)喷 涂有伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物。
2. 如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于所述样品吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反 应膜（3 )、吸水垫（4 )依次粘贴在底板（7 )上。
3. 如权利要求1-2任一项所述的试纸卡，其特征在于所述结合物释放垫1/2~2/3被覆 盖于样品吸收垫下。
4. 如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于所述伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物 由伏马毒素 B1半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、 血蓝蛋白、人血清白蛋白、甲状腺蛋白。
5. 如权利要求1或4任一项所述的试纸卡，其特征在于所述伏马毒素 B1半抗原分子结 构式为：
6. 如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于所述伏马毒素 B1单克隆抗体是以伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊 得到的。
7. -种制备权利要求1-6任一项所述试纸卡的方法，其包括步骤： 1) 制备喷涂有伏马毒素 B1单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫； 2) 制备具有包被有伏马毒素 B1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗 抗体的质控线的反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸 卡。
8. -种检测谷物和饲料中伏马毒素 B1残留的方法，其包括步骤： 1) 样本前处理； 2) 用权利要求1-6任一项所述的试纸卡进行检测； 3) 分析检测结果。
【文档编号】G01N33/558GK104251907SQ201310254506
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月25日 优先权日:2013年6月25日
【发明者】万宇平, 冯才茂, 扶胜, 冯静, 聂雯莹, 彭鸽, 孙震 申请人:北京勤邦生物技术有限公司