分析试剂盒及分析方法

分析试剂盒及分析方法
【专利摘要】本发明的题目是分析试剂盒及分析方法。本发明提供一种分析试剂盒，与分析物反应，分析试剂盒包括多个反应容器以及多个微粒。各反应容器包括滤膜，且滤膜具有多个孔洞。各微粒的粒径大于各孔洞，且直接或间接与分析物或其竞争物或识别分子结合。此外，本发明亦提供一种分析方法。
【专利说明】分析试剂盒及分析方法
【技术领域】
[0001]本发明关于一种分析试剂盒及分析方法。
【背景技术】
[0002]生物感测一向是环境监控、科学研究分析、医学诊断、工业品管以及食物安全等领域中的重要方法。利用识别分子与分析物间特异性辨识的分析法已经长期且广泛地被应用于多项技术中。其中，包含微孔板分析法(microtiter plate based assay)、测流免疫层析法(lateral flow immunochromatographic assay)或微珠式分析法(bead based assay)
坐寸ο
[0003]微珠式分析法主要的优势为促使固相与液相分子混合的均匀分布性。目前微珠式分析法的应用可例如结合流式细胞仪和不同荧光标定的微珠，结合识别分子以后便可以广泛应用在目标的检测。或是利用具有磁珠的微珠分析的方法，以进行纯化的应用，其针对微珠与待分析的物质特异性结合后，并以磁性进一步将结合的待分析的磁珠分离出来。
[0004]然而，微珠式分析法要通过流式细胞仪的分析或是标定多种具有不同分析功能的微珠，使制程变得复杂且需耗费高成本，难以符合进行大量及快速分析的需求。相较于磁珠的应用，其通过磁力以达分离及纯化的方式相对具有有效的提升分析的便利性、灵敏度、特异性、快速和简便性等特性。但磁珠需通过磁力吸引以与其它物质进一步分离的过程，又难免造成步骤繁复且会因磁力不均匀或不足而有部分磁珠损失的疑虑。
[0005]因此，如何提供一种制程简单、低成本以及可快速分析大量样品的分析试剂盒及相关分析方法，已成为目前检测分析领域中的重要课题之一。

【发明内容】

[0006]有鉴于上述课题，本发明的目的为提供一种制程简单、低成本以及可快速分析大量样品的分析试剂盒及分析方法。
[0007]有鉴于上述的目的，本发明提供一种分析试剂盒，与分析物反应，分析试剂盒包括多个反应容器以及多个微粒。各反应容器分别包括滤膜，滤膜上具有多个孔洞，而各微粒的粒径大于各孔洞，且直接或间接与分析物或其竞争物或识别分子接合。
[0008]在本发明一实施例中，孔洞之一的孔径介于Inm至Icm之间。
[0009]在本发明一实施例中，微粒的材料包括玻璃、乳胶、橡胶、磁石、树脂、金属、陶瓷、多糖、塑料、或硅。
[0010]在本发明一实施例中，分析物或其竞争物或识别分子为蛋白质、肽、核酸、糖类、化合物、细胞、或微生物。
[0011]在本发明一实施例中，识别分子与分析物或其竞争物接合。
[0012]在本发明一实施例中，分析试剂盒还包括多个信号分子，分别与分析物或其竞争物或识别分子结合。
[0013]在本发明一实施例中，信号分子包括酶、酶受体、显色剂、放射性物质、纳米脂粒、或金属化合物。
[0014]在本发明一实施例中，分析试剂盒还包括封合件，设置于滤膜的流出侧。
[0015]本发明另提供一种分析方法，与分析物反应的分析试剂盒配合，分析试剂盒包括多个反应容器以及多个微粒，各反应容器包括具有多个孔洞的滤膜，分析方法包括将具有分析物或其竞争物或识别分子的溶液加入各反应容器，微粒分别与分析物或其竞争物或识别分子进行直接或间接接合、加入多个信号分子，信号分子连接至分析物或其竞争物或识别分子、滤除反应容器中的溶液以及检测信号分子所产生的信号强度。
[0016]在本发明一实施例中，各微粒的粒径大于各孔洞。
[0017]在本发明一实施例中，识别分子与分析物或其竞争物接合。
[0018]综上所述，本发明所提供的一种分析试剂盒，通过微粒的粒径大于滤膜孔洞，能快速经由滤除方式将直接或间接结合在微粒上的分析物或其竞争物或识别分子与其它物质分离，并进行定量分析。如此一来，能改善现有技术中需以提供磁性将磁珠在分离时的复杂程序。本发明的分析试剂盒还兼具分析容易且设备器材成本较低且能广泛应用于各种分析法等优势，且反应容器能依据分析所需而制成各种容积，因此还能应用于高通量的分析。另外，本发明亦提供一种分析方法，连同本发明的分析试剂盒，能实施间接型酶联免疫吸附法、竞争型酶联免疫吸附法以及夹心法酶联免疫吸附法，相较现有技术的分析方法可更为快速且更容易地检测到分析物。
【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1A至图1D为本发明的一种分析试剂盒的其中一反应容器及其变化态样示意图；
[0020]图2A为依据本发明一实施例的分析试剂盒组合剖面示意图；
[0021]图2B为依据本发明另一实施例的分析试剂盒组合俯视图；
[0022]图3为依据本发明的分析方法步骤流程图；
[0023]图4A至图4E分别为以本发明的分析试剂盒及本发明的分析方法操作流程图；以及
[0024]图5A及图5B分别为以本发明的分析试剂盒及本发明的分析方法分析庆大霉素的数据图。
【具体实施方式】
[0025]以下将参照相关附图，说明依本发明提供的制程简单、低成本以及快速分析的分析试剂盒，其能快速分析大量的样品。另外，本发明又提供一种以此分析试剂盒进行分析的分析方法，其中相同的组件将以相同的参照符号加以说明。
[0026]本发明所提供的一种分析试剂盒，能与分析物反应，以检测分析物的浓度，应用领域可包含化学检测分析以及免疫检测等分析技术。图1A为本发明一实施例的一种分析试剂盒的其中一反应容器示意图。请参照图1A所示，本发明的分析试剂盒I包括多个反应容器11以及多个微粒12。
[0027]本发明的各反应容器11包括滤膜111，滤膜111可以设置于反应容器11中间、底部或侧壁。在本发明一实施例中，滤膜111沿反应容器11底部边缘设置，且设置于反应容器11的流出侧。而本发明所使用的滤膜111材料包括乙酸纤维素(cellulose acetate)、或聚醚砜(polyester sulfone)。另外,本发明的滤膜111具有多个孔洞P,每个孔洞P的孔径大小介于约Inm至Icm之间，较佳介于0.1 μ m至100 μ m之间。各孔洞P的间距可以以一固定距离而设置，或是以不同距离相互设置于滤膜111上。
[0028]反应容器11与滤膜111围成的供操作及反应进行的容置空间，以供多个微粒12以及或分析物A的竞争者容置。在此，以各反应容器11分别具有滤膜111为例，当然，分析试剂盒I的反应容器11也可以共享滤膜111，而各反应容器11则分别对应滤膜111的其中一部分。
[0029]微粒12的粒径大于滤膜111的孔洞P的孔径大小，使得微粒12于反应容器11中能通过其粒径较孔洞P的孔径大而在过滤步骤后仍被保留在容置空间中。本发明的微粒12粒径较佳介于2nm至2cm之间。且本发明的微粒12所使用的材料包括玻璃、乳胶、橡胶、磁石、树脂、金属、陶瓷、多糖、塑料、或硅。然而，本发明的微粒12的形状不限于为球形、椭圆球形、方块、或其它不规则形状的结构。在本发明一实施例中，为使微粒12能具有较大表面积以接合分析物A，因此微粒12为一球形结构。而微粒12球状的表面积，可与含有分析物A的样品溶液充分混合，增加反应的均匀度。
[0030]本发明的微粒能直接或间接与分析物或其竞争物或识别分子接合。在此所谓”直接”指微粒与分析物或其竞争物接合时，两者间未倚靠其它组件或分子即达成连接的情况而言；而相反地”间接”指微粒与分析物或其竞争物接合时，两者间尚有其它组件或分子以连接两者的情况而言。适用于本发明的分析试剂盒的分析物或其竞争物或识别分子包括蛋白质、肽、核酸、糖类、化合物、细胞、微生物、或小分子。其中小分子可如环境激素如三聚氰胺(melamine)、二H恶英(dioxin)、莱克多巴胺(Ractopamine)(瘦肉精组成分)、邻苯二甲酸盐(phthalate)(塑化剂组成分)等；或如生理代谢产物如葡萄糖、或尿酸等；或如食品添加物等。分析物存在于任何样品中，且为待分析的标的物。
[0031]本发明依不同的分析方法进行时，组件之间的连结关系会有些许不同，例如于图1A中，进行间接型酶联免疫吸附法(indirect ELISA)时，微粒12与分析物A通过第一配体LI而间接结合；而当进行竞争型酶联免疫吸附法时(如图4A)，则除了分析物A能和微粒12间接结合以外(经由第一配体LI)，样品中与分析物A结构相似的竞争物Al也能与分析物A相竞争，而间接结合至微粒12上。竞争物Al主要是在进行分析时，为了协助间接分析分析物A浓度而加入的物质。本发明中所谓的“竞争物”指该竞争物相对于分析物，亦具有能与特异性识别该分析物的识别分子结合能力。
[0032]本发明的微粒与分析物或其竞争物或识别分子直接结合的方式可以为两者间以电荷吸引、或以结构嵌合、或微粒及/或分析物经由化学修饰具有特定官能团可相互键合等方式。在本发明一实施例中，微粒例如为带负电的树脂，而分析物例如为带有正电荷的荧光蛋白。故当含有分析物的样品溶液被置入反应容器后，分析物即会被微粒吸引，而其余物质则被滤除。由于分析物本身带有荧光，故能直接定量出分析物的浓度。
[0033]然而，本发明的微粒亦可以间接结合方式结合识别分子、分析物及其竞争物。举例来说，为增加各组件(微粒、识别分子、或分析物及其竞争物)之间结合能力，或当识别分子、分析物或其竞争物无法通过上述的结构嵌合或官能团结合手段结合到微粒上时，本发明的分析试剂盒中，能通过提供具有较佳结合亲和性或结合稳定性的配体(ligand)来达成。配体能设置于微粒、识别分子、或分析物及其竞争物的至少其中之一的表面上，以协助微粒、识别分子、或分析物及其竞争物其中任两个组件之间的结合。举例来说，能通过配体来结合两个组件；或是两组件分别结合至不相同的两个配体，再将此两个配体相互结合。需注意的是，本发明的各组件不限定只能与一种配体结合，也可以同时连接两种以上的配体(一配位组件)，以与另一组件结合，视检测分析时的目的而定。
[0034]如图1A所示，在本发明一实施例中，分析试剂盒I还包括第一配体LI。第一配体LI用以直接或间接接合分析物A或其竞争物，而使分析物A或其竞争物间接接合至微粒12上。举例来说，当分析物A或其竞争物与微粒12间的结合力较弱时，通过与微粒12具有较佳结合性的第一配体LI结合于微粒12后，同时第一配体LI又具有能与分析物A相结合的结构，因此能将分析物A稳定地间接接合至微粒12上。
[0035]如图1B所示，另外，本发明的分析试剂盒还可包括一第二配体L2，其能与第一配体LI结合。第二配体L2用以连接识别分子、分析物或其竞争物Al，以使识别分子、分析物或其竞争物Al能间接连接至微粒12上。如图中所示，第一配体LI直接接合至微粒12上，而第二配体L2与竞争物Al先接合后，由于第一配体LI与第二配体L2具有能相互嵌合的结构，因而两者之间具有较佳的结合性。当然，在本实施例中，第一配体LI及第二配体L2辅助竞争物Al接合至微粒12上的方式，还可以当第二配体L2接合竞争物Al后，再与第一配体LI接合，最后才通过第一配体LI接合至微粒12上；或是，第一配体LI结合至微粒12后加入第二配体L2，当第二配体L2与第一配体LI结合后，再加入竞争物Al ;亦或是，第一配体LI与第二配体L2先结合后，以第一配体LI的一端结合至微粒12上后，再加入竞争物Al，本发明均不设限。
[0036]在本发明的另一实施例，本发明的分析试剂盒应用于夹心法酶联免疫吸附法(sandwich ELISA)。如图1C所示，在本实施例中，识别分子13为捕捉型抗体(captureantibody),能与分析物A相结合,且识别分子13能直接结合至微粒12的表面。
[0037]同样地在另一实施例中，如图1D所示，微粒12及识别分子13可以先分别接合第一配体LI及第二配体L2，通过第一配体LI与第二配体L2结合，可使识别分子13间接结合至微粒12上。在此实施例中，第一配体LI与第二配体L2间的结合可以通过结构的互补特性或特有官能团间的键合而结合。对此，需额外说明的是，本发明的分析试剂盒在进行分析时，依据所使用的分析方法的不同或依分析的需求不同，本发明的分析试剂盒可具有一种以上的识别分子。如图1C及图1D所示，分析试剂盒还具有另一识别分子14，其为检测抗体(detection antibody)。当识别分子13与一分析物A特异性接合后,最后再由另一具特异性的识别分子14辨识分析物A，其中，识别分子13及识别分子14分别辨识分析物A结构上的两个不同部位。而本发明的夹心法酶联免疫吸附法的其它操作流程及其分析原理，为本发明所属【技术领域】中具有通常知识者所能理解，故不再赘述。
[0038]请同时参照图1A至图1D，当本发明的第一配体LI与分析物A或竞争物Al或识别分子13直接或间接结合后，为便于定量结合分析物A或竞争物Al浓度，因此本发明的分析试剂盒I还包括多个信号分子S能直接或间接结合于分析物A或竞争物Al或识别分子13，使信号分子S浓度能与分析物A浓度呈现正相关或负相关，故通过检测信号分子S的活化的信号强度，可作为检测微粒12所结合的分析物A浓度的依据。其中，信号分子S可为酶、酶受体、显色剂、放射性物质、纳米粒、或金属化合物。其中，酶可例如荧光素酶(Iuciferase)、β-半乳糖酶(β-galactosidase)、辣根过氧化氢酶(horseradishperoxidase)、或碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)等加入受质能释放突光信号者；酶受体可与酶连结而活化并产生信号；显色剂则例如荧光剂异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocynate)、罗丹明(rhodamine)、藻红素(phycoerythrin)、突光蛋白、磺酰罗丹明B (Sulforhodamine B, SRB)及冷光物质等；放射性物质如1251、35S、mTc等；金属化合物可例如为钌络合物(Ru complex)。另外，本发明的信号分子S为包覆有上述信号分子S的微脂体，其脂质结构中镶嵌具有信号的信号分子之结构。而部分信号分子S通常于分析定量前才加入或活化，以使信号分子S能于活性期间内有效被检测，以避免影响检测强度衰弱造成的定量误差。而检测信号分子S的方法依据所使用的信号分子类型的不同而有所差异，例如检测信号分子S的方法可包括检测信号的吸光值或放射线强度等，并连同相关仪器进行检测信号的强度。然而，上述检测信号分子的方法为本发明所属【技术领域】具有通常知识者所能理解，故不再赘述。
[0039]在本发明一实施例中，信号分子S与分析物A间接结合如图1C及图1D所示，所使用的信号分子S(星形)以微脂体(圆形)包覆以形成信号复合物15。信号复合物15能直接结合于分析物A或透过识别分子14间接结合于分析物A，并于定量分析前移除微脂体或破裂微脂体而使信号分子S (星形)露出，用以检测信号分子S (星形)的浓度判断分析物A的浓度。
[0040]同样地，为使信号分子S与分析物A具有较佳的结合性，本发明的信号分子S可还包括配体(图未表示)，配体能直接或间接结合于信号分子S或信号分子复合物15。信号分子S能通过配体与分析物A具有较佳的亲和性，以进一步与分析物A或与其结合的识别分子结合。而关于上述信号分子S及微脂体的相关制程及信号分子S结合配体的举例说明及其制备的步骤流程，将于后续进一步说明。除微脂体之外，本发明的信号分子S亦能通过连接其它连结件而结合至分析物，例如特异结合分析物的抗体或连接体(linker)。
[0041]再请同时参照图1A至图1D,本发明的分析试剂盒还包括一封合件112,封合件112设置于滤膜111的流出侧。当实施各分析法时，为使各反应物质间微粒12与第一配体L1、第一配体LI与分析物A或其竞争物Al或第二配体L2之间、信号分子S与分析物A或其竞争物Al或识别分子14等之间能有足够时间进行经由浸泡以相互进行特异性结合，封合件112能暂时封闭滤膜111的孔洞P，待反应完全后再移除封合件112，以滤除多余的溶液。在本发明一实施例中，封合件112为薄膜、或盒盖形式，且其材料可以是金属、乳胶或塑料材料制成。
[0042]由于反应容器11具有滤膜111，因此本发明的分析试剂盒的单一反应容器可为具有至少一滤板(filter plate)或至少一管柱形式。当反应容器为滤板形式时，则可以同时进行多种不同分析方法或同时分析不同的分析物。每个反应容器的组合方式可如图2A所示，相互并排于平面的方式组合成具有各种数目的反应容器11的分析试剂盒2，组合方式较佳为一数组式排列，如96孔滤板、或384孔滤板、或1536孔滤板等。各滤盘或管柱的反应空间深度可随分析样品的体积进行调整，如可容置I μ I至IOOml溶液体积的空间。由于具有多个反应容器11，故本发明的分析试剂盒I能进行分析中的各项检测及分析，包括以标准品建立标准浓度曲线、或于相同样品之间进行重复试验。
[0043]举例来说，如图2Β所示，图中所显示为本发明的分析试剂盒以96孔滤板形式表示，且为俯视示意图。Al?AS为稀释不同浓度标准品，并以此建立的标准曲线对分析物浓度进行分析，而BI?B8为针对八种不同的分析物进行分析，Cl?C8及Dl?D8为BI?B8的另外两个重复，将BI?B8、C1?C8及Dl?D8三者的三个重复分析结果进行统计并对应标准曲线得到平均浓度。故，本发明的分析试剂盒除能用于标准曲线之建立以外，也能同时进行多次重复分析。此外，由于各反应容器的反应空间能依应用的分析样品量调整，因此，也适用于高通量的样品分析。
[0044]除此之外，本发明亦提供一种分析方法，与分析物反应的分析试剂盒配合，分析试剂盒包括多个反应容器以及多个微粒，各反应容器包括具有多个孔洞的滤膜，分析方法步骤包括将具有分析物或其竞争物或识别分子的溶液加入各反应容器，微粒分别与分析物或其竞争物或识别分子直接或间接接合(步骤SI)、加入多个信号分子，信号分子连接至分析物或其竞争物或识别分子(步骤S2)、滤除反应容器中的溶液(步骤S3)以及检测信号分子所产生的信号强度(步骤S4)。
[0045]而关于本发明的分析方法，所使用的分析试剂盒如上述的分析试剂盒，其中的反应容器及其组成组件的相关说明请参照上述。本发明的步骤流程及操作流程示意图分别如图3及图4A至图4E所示。在此，图4A至图4E参照如图1B结构的分析试剂盒同时连同竞争型酶联免疫吸附法进一步说明。
[0046]于步骤SI，在本发明一实施例中，与分析物相竞争的竞争物能直接与微粒结合。对此，微粒先加入至反应容器后，随即加入含有竞争物的溶液与微粒作用一段时间，使竞争物能与微粒充分结合。
[0047]而于另一实施例中，竞争物间接与微粒结合。对此，本发明的分析方法还包括设置至少一第一配体于微粒的表面，第一配体能与分析物或其竞争物直接结合至微粒上。则在进行步骤Si时，则接有第一配体的微粒直接先置于反应容器中，再加入含有分析物或其竞争物的溶液至反应容器中与微粒结合。而若分析物或其竞争物采间接结合方式至微粒时，则本发明的分析方法又可还包括设置第二配体于分析物或其竞争物。其中，第一配体及第二配体能相互结合，两者的结合方式如上述说明。请同时参照如图3及图4A所示。在此实施例中，微粒12先与第一配体LI结合后，设置于反应容器11中，而竞争物Al (方形斜线)则与第二配体L2进行结合。图4A中以单一个反应容器11为例，而真正进行操作时，可有多个反应容器11 一同来进行分析。于步骤SI中，本发明亦不限为先将第一配体LI与微粒12结合后才加入竞争物Al或第二配体L2，也可以先使第一配体LI与竞争物Al或第二配体L2特异性结合后，再通过第一配体LI连接到微粒12上，本发明不限于此。当然在其它实施例中，与微粒12直接或间接接合者，也可为分析物A。
[0048]在本实施例中，微粒12为树脂材料，第一配体LI为链霉亲和素(streptavidin),且第二配体L2为生物素(biotin)为例，能与作为第一配体LI的链霉亲和素嵌合。在本实施例中，微粒12浸泡于含有链霉亲和素的溶液中进行反应，以使链霉亲和素接合至微粒12表面。在此实施例中，竞争物Al通过第二配体L2而结合至第一配体LI之外，并可与分析物A共同竞争后续加入具专一结合性的识别分子14(如图4B所示)。需额外说明的是，本发明中的分析方法中，竞争物Al与分析物A竞争识别分子14的方式，依分析的目的不同，而可以待接有第二配体L2的分析物A与微粒12上的第一配体LI结合后，再加入竞争物Al ；或是先加入接有第二配体L2的竞争物Al，待第二配体L2与微粒12上的第一配体LI结合后，再加入分析物A ;或是分析物A与竞争物Al先混合后再加入，而竞争物Al连接第二配体L2，以与连接在微粒12上的第一配体LI结合。然而，本发明的竞争物Al所扮演的竞争角色，视分析时检测需求而定，本发明不限于此。在本实施例中，如图4A所示，分析物A待竞争物Al所连接的第二配体L2与第一配体LI间接结合后才加入反应容器11中，以竞争后续加入的识别分子14。
[0049]在本实施例中，第二配体L2为生物素，其标定分析物A或竞争物Al的反应使用Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin以抗生素20倍的摩尔数与竞争物Al溶液混合，在室温下反应2小时以后加入68mM牛血清蛋白使未与分析物反应的Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin与牛血清蛋白上胺基反应，再以Tris-HCl将剩余的自由NHS反应官能团结合，以Amiconultrafiltration(Millipore)将接合竞争物Al的生物素与接合牛血清蛋白(Bovineserum albumin, BSA)的生物素通过大小分离,取得溶有生物素标定竞争物Al的过滤液并且加入其1.5倍量具有链霉亲和素接合的微粒12均匀混合，于室温反应I小时，以使生物素与链霉亲和素间相互结合。同时加入BSA溶液以阻断微粒12表面非特异性吸附作用，最后利用离心清洗除去溶液中没有结合上微粒12的其它物质，其中包含游离的竞争物Al，反复离心清洗后，最后将合成好的接合竞争物Al之微粒12溶液储存在4°C备用。
[0050]接着，如步骤S2，加入多个信号分子S，此步骤的示意图如图4C所示。在本实施例中，信号分子S以微脂体包覆以形成信号复合物15。本实施例中，信号复合物15通过识别分子14，而能特异性结合或标定至分析物A或其竞争物Al。另外，为使信号复合物15与识别分子14间的特异性结合更佳，本实施例的信号复合物15还包括第三配体L3。第三配体L3与识别分子14具有较佳特异性，因而能使带有信号分子S的信号复合物15间接接合至有识别分子14的分析物A或竞争物Al上。通过识别分子14与第三配体L3的结合，使信号分子S能标定到分析物A及竞争物Al。当然，于其它实施例中，信号复合物15也可能直接连结于分析物A及/或竞争物Al上，而不需要通过识别分子14或第三配体L3。
[0051]在此实施例中，信号分子S为包覆于微脂体中的荧光物质SRB (磺酰罗丹明，sulforhodamine B, Sigma)。本实施例中的微脂体及包覆突光物质SRB之方法如下:微脂体的组成包含4.8 % DPPG( 二棕榈酰磷脂酰甘油，dipalmi toy lphosphat idyl glycerol, Avanti Polar Lipids) >45.3 % DPPC ( 二掠榈酸憐脂酸胆喊，dipalmi toy lphosphat idyl choline, Avanti Polar Lipids)、45.9 % 胆固醇(cholesterol, Sigma)以及4 % ATA-DPPE，以上的磷脂质组成包覆有150mM的荧光物质SRB (磺酰罗丹明，sulforhodamine B, Sigma)。事先将N-琥拍酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸盐(N-Succinimidyl S-Acetylthioacetate) (SATA, Thermo)与 DPPE 1,2-二(十六酸)-sn-甘油基-3-憐酸乙醇胺(1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola-mine, Avanti Polar Lipids)反应30分钟完成DPPE-ATA的制备，而后将胆固醇、DPPC及DPPG溶于3: I氯仿/甲醇有机溶剂中，再加入事先完成的SATA修饰的DPPE，以氮气除去有机溶剂后形成胶状透明脂质膜再加入预热至60°C的150mM SRB溶液，并于60°C的水浴槽中进行荧光物质SRB的包覆反应(encapsulation)，45分钟后将残留块状的脂质震荡混合均匀在溶液中，再次利用60°C水浴槽继续进行荧光物质SRB的包覆作用30分钟至I小时。
[0052]最后,将已形成的突光微脂体溶液在60°C的条件下,来回挤压穿过200nm孔径的聚碳酸酯针筒式滤器(polycarbonate syringe filers) (Avanti Polar Lipids) 30 次。此时，微脂体直径已被调整成约200nm。将有包覆荧光物质SRB的微脂体与未包覆在微脂体内的突光物质SRB利用大小排除层析法(size exclusion chromatography, SEC)分离,有包覆荧光物质SRB的微脂体经由SEC(CL-4B resin)被分离出来，其冲提液为TBS-蔗糖(25mMTris, 140mM NaCl, and 65g/L 鹿糖,酸碱值调整至 pH 7.5)。
[0053]在本实施例中，第三配体L3为蛋白质G (protein G)，而识别分子14为免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG),且为能与分析物A及其竞争物Al进行特异性结合的抗体。由于蛋白质G能与免疫球蛋白G特异性结合，因此，信号复合物15能通过第三配体L3而与识别分子14特异性结合。
[0054]将蛋白质G接合至包覆有信号复合物15表面上的接合方法如下所述:接合反应依Chen等人(2005)的方法改良，原方法中所使用的Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烧-1-羧酸横酸基玻拍酸亚胺酯，Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)交联剂以具有 24 个 PEG(聚乙二醇，polyethylene glycol)的SM (PEG) 24(琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)_ 二十四碳亚乙基二醇]酯，succinimidyl-[ (N~maleimidoprop1-namido) -tetracosaethyleneglycoI] ester)交联剂(crosslinker, Thermo)取代。预期可以使蛋白质G-微脂体-SRB足以突破空间障碍的困难而具有更大的灵活度与后续使用的作为识别分子14的抗体结合，利于分析的进行。
[0055]关于信号复合物15中的微脂体与蛋白质G的接合反应(conjugation),其作法如下:首先由以SM(PEG) 24将蛋白质G进行衍生化作用(derivitization of neutravidinwith SM(PEG)24)以及微脂体-荧光物质SRB表面的去乙酰反应(deacetylation)同时平行进行，其中蛋白质G的衍生化反应在酸碱值7至9之间在室温下进行I小时，产物由0.2MTris HCl将未反应的官能团结合后，以分子量大小限制为7K的离心柱(Zeba Desaltingcolumn)将接有SM(PEG)24的蛋白质G与未反应的SM(PEG)24分离，得到马来酰亚胺衍生化(Maleimide-derivetized)的蛋白质G,再与同样经过I小时、室温下以0.5M轻基胺盐酸盐(hydroxylamine hydrochloride)去乙酰反应完成后的表面硫醇基裸露的微脂体在酸碱值
6.5到7.5之间进行反应。此马来酰亚胺衍生化的蛋白质G与微脂体表面的硫醇基在室温下反应1.5个小时后以硫氢基结合剂NEM(N-ethylmaleimide)将未反应的微脂体表面硫醇基阻断，再经由大小排除层析法将蛋白质G接合成功的微脂体-荧光物质SRB与未接合成功的蛋白质G分离,冲提液同样使用TBS-鹿糖(25mM Tris, 140mM NaCl, and 65g/L鹿糖，酸碱值调整至PH7.5)。
[0056]另外，如图3及图4D所示，本发明的分析方法于进行步骤SI之后及/或步骤S2之后，可进行一滤除步骤(步骤S3)。当每个加入步骤(步骤SI或S2)后通过封合件112密合滤膜111的孔洞P，使各物质之间充分作用及结合，之后再通过移除封合件112，使溶液中未结合至微粒12上的物质如分析物A或其竞争物Al、第一配体L1、第二配体L2、识别分子14或信号复合物15等，由滤膜111的孔洞P流出。除此之外，本发明的滤除步骤还包括多个清洗的步骤，以达到充分移除非欲进行检测的物质。
[0057]最后，于步骤S4中检测微粒12上竞争物Al所结合的信号复合物15释放的信号分子S的信号强度。依据所接合的不同信号分子S种类，本发明的分析方法中能额外添加其受质或催化酶等，使信号分子S活化后释出信号。在本实施例中，如图4E所示，信号复合物15通过加入界面活性剂使微脂体溶解后，释放出SRB信号分子S。并且依据各种信号分子S的波长范围或信号特性的不同以不同仪器进行检测，统计各分析数值后定量出分析物A的浓度。
[0058]需特别说明的是，在本实施例中，当溶液中分析物A越多，则后续结合到竞争物Al的识别分子14及信号分子S量则越少；反之，溶液中分析物A越少，则后续结合到竞争物Al的识别分子14及信号分子S量则越多。又由于非与微粒12结合的分析物A于进行步骤S3时会被滤除，因此，最后检测被保留在反应容器11中的信号分子S强度，将与所加入的分析物A浓度成反比，因而能间接推知分析物A的浓度。
[0059]当然，若用于三明治分析方法时，加入至反应容器中的溶液还包括至少一识别分子，识别分子能与分析物或其竞争物特异性结合，并能直接或间接地接合至微粒上。请参照图3、图1C及图1D所示。同样地，识别分子13能与分析物A特异性结合。在本实施例中，识别分子13为能与分析物A相结合的抗体。识别分子13能如图1C所示，直接结合于微粒12的表面。或是，为使识别分子13能稳定地结合于微粒12上，于步骤SI前，如图1D所示，微粒12可先直接结合第一配体LI，而识别分子13结合第二配体L2，而第一配体LI与第二配体L2的结合方式已于前文中详细描述。然而，依所使用不同的第一配体LI及第二配体L2而有不同的结合手段。待识别分子13与微粒12直接或间接结合后，即加入分析物A或其竞争物Al以与识别分子13结合，进而将分析物A或其竞争物Al直接或间接结合于微粒12上(步骤SI)。而后续施用于三明治分析方法的步骤S2、步骤S3及步骤S4如上所述，故在此不再赘述。
[0060]以下，本发明将以一实施例说明本发明的分析方法，能快速准确建立检测分析的标准曲线及多重分析的可行性。
[0061]实验例:本发明的分析方法以竞争型分析法分析抗生素
[0062]于本实验例中，分析试剂盒所采用的各组件及其连结关系如图4A所示。其中，微粒12为树脂材料制成的粒子。分析物A及其竞争物Al均为庆大霉素硫酸盐(gentamycinsulfate),微粒12上具有的多个第一配体LI为链霉亲和素(streptavidin),庆大霉素以上述的方法标定生物素(biotin)后与微粒12的卵蛋白结合，形成庆大霉素微粒。而在本实验例中，反应容器11为一滤盘。
[0063]首先以牛血清蛋白阻断在后续所有步骤中非特异性的吸附滤盘的可能性，接着将庆大霉素微粒与6种具有不同浓度的庆大霉素样品(0(负控制组)、0.05、0.1、1、10以及100 μ g/mL)加入底部有封膜的滤盘中，利用微量盘式震动仪(micromixer，TAITEC)混合均匀数秒后加入所需要的抗庆大霉素抗体溶液在室温下反应I小时，待反应过后移除封合件112，在此以铝箔封膜为例，并将TBS-蔗糖加入滤盘中，使反应后除了接有抗庆大霉素抗体的庆大霉素微粒以及未接有抗庆大霉素抗体的庆大霉素微粒以外，其余的抗庆大霉素抗体-庆大霉素、抗庆大霉素抗体、剩余的庆大霉素样品皆随TBS-蔗糖溶液流出滤盘以达到分离清洗的效果，总共清洗三次，最后一次清洗步骤后离心将多余液体移除。再次将96孔滤板底部加上铝箔封膜，加入含信号复合物的溶液，即含有蛋白质G-微脂体-SRB信号分子的溶液反应30分钟，移除封合件112以后仍使用TBS-蔗糖溶液清洗，将多余的蛋白质G-微脂体-SRB洗除，清洗共两次，同样通过离心将多余液体移除。最后将滤盘按照各个孔洞的编号相对应地组合在一般96孔滤板上,加入界面活性剂n-OG(noctyl-beta-d-glucopyranoside)将各孔洞中蛋白质G-微脂体-SRB打破并且通过离心将滤盘中因打破蛋白质G-微脂体-SRB而释放出来的SRB接入一般96孔黑盘中，最终以synergy 2 (Synergy 2Mult1-Mode microplate reader, BioTek)在激发光 540nm 以及吸收光 590nm 的条件下测量记录荧光信号的强弱，而后再统计分析。
[0064]利用本发明的分析方法，进行针对庆大霉素的检测，在6种不同的庆大霉素浓度五次重复下，同时在一个滤盘上一共30个孔洞中分别进行如同上述的高通量滤盘微珠式竞争型分析反应。其中，6种庆大霉素浓度包含分别在TBS(Tris buffered saline)溶液中浓度为0(负控制组)、0.05,0.U0.2,0.5以及I μ g/mL的庆大霉素，测量最后收集于一般96孔黑盘的荧光信号以后，结果如图5A所示，本发明的分析试剂盒及分析方法所得到的检测结果具有稳定的线性关系(R2 = 0.995)。另外，在本发明另一实验例中，样品为配制在脱脂牛奶中含有不同浓度的庆 大霉素溶液，并且依上述的实验步骤，依然可以检测到R2 =
0.9314的线性关系。在此实验结果中更说明了，本发明的分析试剂盒及分析方法具有极佳的特异性，于分析过程中不会受到溶液中其它物质的干扰。因此，在得到的稳定的标准曲线且具特异性的分析条件下，本发明的分析试剂盒及分析方法能还进一步对未知浓度的分析物进行检测，而可得到准确地检测结果。
[0065]为了测量饱和的剂量反应曲线(Dose response curve)选择O (负控制组)、
0.05、0.1、1、10 以及 100 μ g/mL。结果如图 5B 所示，定义检测极限(Limit ofdetection,L0D)为该浓度的信号值为负控制组的数据平均扣除三倍负控制组数据标准差(standarddeviation, SD)。样品配制在TBS溶液中所得到的LOD为52.65ng/mL,以及样品配制在脱脂牛奶中所得到的LOD为14.16ng/mL，足以检测庆大霉素的法规所定的最高残余限量(Maximum residue level, MRL)为200ng/mL。除此之外,本发明的分析试剂盒及分析方法能将此30个标准品的实验在2小时以内即可完成，具有快速准确分析的功效。
[0066]综上所述，本发明所提供的一种分析试剂盒，通过微粒的粒径大于滤膜孔洞，能快速经由滤除方式将直接或间接结合在微粒上的分析物或其竞争物或识别分子与其它物质分离，并进行定量分析。如此一来，能改善现有技术中需以提供磁性将磁珠于分离时的复杂程序。本发明的分析试剂盒还兼具分析容易且设备器材成本较低且能广泛应用于各种分析法等优势，且反应容器能依据分析所需而制成各种容积，因此还能应用于高通量的分析。另外，本发明亦提供一种分析方法，连同本发明的分析试剂盒，能实施间接型酶联免疫吸附法、竞争型酶联免疫吸附法以及夹心法酶联免疫吸附法，相较现有技术的分析方法可还为快速且灵敏地分析及定量分析物。
[0067]以上所述仅为举例性，而非为限制性。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的权利要求中。
[0068]【主要组件符号说明】
[0069]1、2:分析试剂盒
[0070]11:反应容器
[0071]111:滤膜
[0072]112:封合件
[0073]12:微粒
[0074]13、14:识别分子
[0075]15:信号复合物[0076]A:分析物
[0077]Al:竞争物
[0078]L1:第一配体
[0079]L2:第二配体
[0080]L3:第三配体
[0081]P:孔洞
[0082]S:信号分子
[0083]SI ?S4:步骤
【权利要求】
1.一种分析试剂盒,与分析物反应,所述分析试剂盒包括: 多个反应容器，分别包括滤膜，所述滤膜具有多个孔洞；以及 多个微粒，各微粒的粒径大于各孔洞，且直接或间接与所述分析物或其竞争物或识别分子接合。
2.如权利要求1所述的分析试剂盒，其中所述孔洞的孔径介于Inm至Icm之间。
3.如权利要求1所述的分析试剂盒，其中所述微粒的材料包括玻璃、乳胶、橡胶、磁石、树脂、金属、陶瓷、多糖、塑料、或硅。
4.如权利要求1所述的分析试剂盒，其中所述分析物或其竞争物或所述识别分子为蛋白质、肽、核酸、糖类、化合物、细胞、或微生物。
5.如权利要求1所述的分析试剂盒，其中所述识别分子与所述分析物或其竞争物结口 ο
6.如权利要求1所述的分析试剂盒，还包括: 多个信号分子，分别与所述分析物或其竞争物或所述识别分子结合。
7.如权利要求6所述的分析试剂盒，其中所述信号分子包括酶、酶受体、显色剂、放射性物质、纳米脂粒、金属化合物。
8.如权利要求1所述的分析试剂盒，还包括: 封合件，设置于所述滤膜的流出侧。
9.一种分析方法，与分析物反应的分析试剂盒配合，所述分析试剂盒包括多个反应容器以及多个微粒，各反应容器包括具有多个孔洞的滤膜，所述分析方法包括: 将具有所述分析物或其竞争物或识别分子的溶液加入各反应容器，所述微粒分别与所述分析物或其竞争物或所述识别分子进行直接或间接结合； 加入多个信号分子，所述信号分子连接至所述分析物或其竞争物或所述识别分子； 滤除所述反应容器中的所述溶液；以及 检测所述信号分子所产生的信号强度。
10.如权利要求9所述的分析方法，其中各微粒的粒径大于各孔洞。
11.如权利要求9所述的分析方法，其中所述识别分子与所述分析物或其竞争物接合。
【文档编号】G01N33/543GK103954765SQ201310292413
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2012年7月24日
【发明者】陈健生, 何天瑜 申请人:国立中央大学