一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法,该方法包括以下步骤：准备筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料；生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜；筛选大肠杆菌生物膜毒力基因；记录大肠杆菌形成生物膜检测-96孔微量板法的结果、目的基因fimH、KpsMTII、chuA、fliCPCR扩增结果、毒力基因筛选结果；统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布。本方法利用PCR聚合酶链式反应，对25株大肠杆菌阳性菌株菌进行毒力因子fimH、KpsMTII、chuA、fliC、yja和PapC的检测筛选，本发明通过确定大肠杆菌形成生物膜毒力基因的分布情况，为大肠杆菌生物膜的形成机理提供重要的理论依据。
【专利说明】—种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因筛选领域，尤其涉及一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法。【背景技术】[0002]大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种迦直，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。
[0003]大肠杆菌0157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括中国等许多国家都有报道，且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌0157:H7引起肠出血性腹泻，约2%~7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。
[0004]大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)革兰氏阴性短杆菌，大小0.5X I~3微米。周身鞭丢，能运动，无芽抱。能发酵多种篚类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物牛长，减小蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膛尬等处可引起I症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便运染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。(国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个)大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗凰(H)和表面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格(LederberR)采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。
[0005]大肠杆菌(E.coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。
[0006]该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55°C经60分钟或60°C加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌逯等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，伯易耐药，是由带有R因子的JI粒转移而获得的。
[0007]大肠杆菌(ETEC)产生的毒素分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)，根据其来源不同，耐热肠毒素又可分为猪源性(STp)和人源性(STh)，它们分别由位于质粒上的三种毒力基因编码，产毒性大肠杆菌(ETEC) —般含有三个毒力基因中的一个或几个基因。目前，用于检测产毒性大肠杆菌多采用聚合酶链反应(PCR)方法，一般是单基因PCR，每次扩增能检测一种毒力基因，具有较高的特异性和敏感性。
【发明内容】
[0008]本发明实施例的目的在于提供一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，旨在解决原有技术筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的过程繁琐，检测筛选的特异性和敏感性差的问题。
[0009]本发明实施例是这样实现的，一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，该方法包括以下步骤:
[0010]步骤一、准备筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料；
[0011]步骤二、生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜；
[0012]步骤三、筛选大肠杆菌生物膜毒力基因；
[0013]步骤四、记录大肠杆菌形成生物膜检测-96孔微量板法的结果、目的基因fimH、KpsMTI1、chuA、fliC PCR扩增结果、毒力基因筛选结果；
[0014]步骤五、统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布。
[0015]进一步，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料包括病料、培养基、试剂药品、仪器；
[0016]病料为25株生物膜鉴定阳性大肠杆菌甘油菌；培养基为LB培养基、M9培养基、麦康凯培养基；试剂药品为 IOXtagplus Buffer> dNTP Misture、DL2000marker、6X loadingBuffe、核酸染料EBl XTAE、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖、U型96孔板、结晶紫、1%PBS缓冲溶液、33%冰醋酸溶液；仪器为紫外线可见分光光度计C0DES54、全波长酶标仪Power Wave XS、THZ-82A气浴恒温振荡器、小型离心机。
[0017]进一步，生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜的具体方法为:
[0018](I)从_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取IOOuL菌液接种于5mLLB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养；
[0019](2)将菌液接种于麦康凯培养基中，置于37°C恒温培养箱内培养24h ；
[0020](3)麦凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h ；
[0021](4)按1:100倍稀释:取培养的菌液50uL于新鲜的5mLLB试管液体培养基上，于37°C缓慢震摇4.5h，保证细菌处于对数生长期；
[0022](5)将紫外可见分光光度计预热半小时；
[0023](6)取2mL菌液于干净比色皿中，同时取2mLLB液体培养基作为空白对照；
[0024](7)调整波长为600nm，初始波长为200nm ；
[0025](8)测菌液OD6tltlnm值，记录数据；
[0026](9)用灭菌的M9液体培养基将所测OD6tltlnm值稀释至0.01 ;
[0027](10)取200uL稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，每个菌液加6孔，用M9液体培养基作为空白对照，于37 °C恒温箱中培养36h ；[0028](11)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液；
[0029](12)用1%PBS缓冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干；
[0030](13)将甲醇加入96孔U型平底板中，固定15min，倒出并晾干；
[0031](14)将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水冲洗，晾干后观
察并记录结果；
[0032](15)将33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定0D6(l(lnm。
[0033]进一步，生物膜阳性OD6tltol值判定标准如下:
[0034]将阴性对照平均OD值加上其3倍的标准差SD定义为临界值cut-off，OdcO，基于临界值ODc，菌株生物膜可以分为:0D ( ODc为不粘附，即(-);0Dc〈0D ( 20Dc为弱粘附，即(+ ) ；20Dc<0D ( 30D 为中等粘附，即(++) ；0D>30Dc 为强粘附，即(+++)。
[0035]进一步，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的具体方法为:
[0036](I)菌体的处理
[0037]将过夜16h培养的菌液离心:取1.5mL菌液离心12000rpm, 5min ；
[0038]收集菌体弃上清液；
[0039]在向离心的菌体中加入IOOuL去离子水，然后煮沸悬浮IOmin后，12000rpm离心5min，_20°C保存所得到的上清液。
[0040](2)引物设计
[0041]设计5对特异性引物，预期扩增出的目的片段大小fimH (508bp)KpsMTII (272bp)chuA (279bp) fliC yia (211bp)及 T 载体通用的 M13 引物。
[0042](3) PCR 扩增反应。
[0043]进一步，PCR扩增反应体系为:
[0044]DNA 模板 4uL ；dNTP4.0uL,含 MgCl2 ； 10 X PCR Buffer5.0uL ；Tag 酶 0.2uL ;引物PlluL，20pmol ;引物 P21uL，20pmol ；ddH2038uL ;总体积为 50uL。
[0045]进一步，PCR扩增的具体条件如下:
[0046]KpsMTIIPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0047]FimHPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0048]FliCPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，50°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0049]chuAPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，52°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0050]yjaPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，50°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0051]PapCPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 40s，72°C延伸 45s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0052]PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶，100V电泳20min，拍照观察结果。
[0053]进一步，统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布的方法为:[0054]统计fimH、KpsMTI1、chuA、fliC、yja和PapC在所检测25株菌中出现的频率。
[0055]本发明提供的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法利用PCR聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction),对25株大肠杆菌阳性菌株菌进行相关毒力因子fimH,KpsMTII，，chuA，fliC，yja，和PapC的检测筛选。其结果显示:KpsMTII在所检测25株菌中出现的频率最高，占40% ;其次是fliC,占32.5%, fimH占20%，合计占52.5% ；chuA占7.5%，yja和PapC均未检出。本发明通过确定大肠杆菌形成生物膜毒力基因的分布情况，为大肠杆菌生物膜的形成机理提供重要的理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1是本发明实施例提供的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法流程图；
[0057]图2是本发明实施例提供的生物膜阳性菌株0D__值与ODc值对照图；
[0058]图3是本发明实施例提供的fimH (508bp)KpsMTII (272bp)基因PCR扩增结果示意图；注 1,2.目的片段 fimH (508bp)，4，5.目的片段 KpsMTII (272bp), 3.MarkerDL2000 ；
[0059]图4是本发明实施例提供的4chuA (279bp)基因PCR扩增结果示意图；注7，8.目的片段 chuA (279bp)，6.DL2000marker ；
[0060]图5是本发明实施例提供的fliC基因PCR扩增结果示意图；注9，10.目的片段fliC, 11.DL2000marker ；
[0061]图6是本发明实施例提供的大肠杆菌生物膜毒力基因统计结果示意图。
【具体实施方式】
[0062]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0063]图1示出了本发明提供的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法的流程。为了便于说明，仅仅不出了与本发明相关的部分。
[0064]本发明的实施例提供的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法包括以下步骤:
[0065]步骤一、准备筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料；
[0066]步骤二、生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜；
[0067]步骤三、筛选大肠杆菌生物膜毒力基因；
[0068]步骤四、记录大肠杆菌形成生物膜检测-96孔微量板法的结果、目的基因fimH、KpsMTI1、chuA、fIiC PCR扩增结果、毒力基因筛选结果；
[0069]步骤五、统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布。
[0070]作为本发明实施例的一优化方案，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料包括病料、培养基、试剂药品、仪器；
[0071]病料为25株生物膜鉴定阳性大肠杆菌甘油菌；培养基为LB培养基、M9培养基、麦康凯培养基；试剂药品为 10 X tagplus Buffer> dNTP Misture、DL2000marker、6X loadingBuffe、核酸染料EBl XTAE、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖、U型96孔板、结晶紫、1%PBS缓冲溶液、33%冰醋酸溶液；仪器为紫外线可见分光光度计C0DES54、全波长酶标仪Power Wave XS、T HZ-82A气浴恒温振荡器、小型离心机。[0072]作为本发明实施例的一优化方案，生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜的具体方法为:
[0073](1)从_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取IOOuL菌液接种于5mLLB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养；
[0074](2)将菌液接种于麦康凯培养基中，置于37°C恒温培养箱内培养24h ；
[0075](3)麦凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h ；
[0076](4)按1:100倍稀释:取培养的菌液50uL于新鲜的5mLLB试管液体培养基上，于37°C缓慢震摇4.5h，保证细菌处于对数生长期；
[0077](5)将紫外可见分光光度计预热半小时；
[0078](6)取2mL菌液于干净比色皿中，同时取2mLLB液体培养基作为空白对照；
[0079](7)调整波长为600nm，初始波长为200nm ；
[0080](8)测菌液OD6tltlnm值，记录数据；
[0081](9)用灭菌的M9液体培养基将所测OD6tltlnm值稀释至0.01 ;
[0082](10)取200uL稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，每个菌液加6孔，用M9液体培养基作为空白对照，于37 °C恒温箱中培养36h ；
[0083](11)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液；
[0084](12)用1%PBS缓冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干；
[0085](13)将甲醇加入96孔U型平底板中，固定15min，倒出并晾干；
[0086](14)将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水冲洗，晾干后观察并记录结果；
[0087](15)将33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定0D6(l(lnm。
[0088]作为本发明实施例的一优化方案，生物膜阳性OD6tltol值判定标准如下:
[0089]将阴性对照平均OD值加上其3倍的标准差SD定义为临界值cut-off，OdcO，基于临界值ODc，菌株生物膜可以分为:0D ( ODc为不粘附，即(-);0Dc〈0D ( 20Dc为弱粘附，即(+ ) ；20Dc<0D ( 30D 为中等粘附，即(++) ；0D>30Dc 为强粘附，即(+++)。
[0090]作为本发明实施例的一优化方案，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的具体方法为:
[0091](I)菌体的处理
[0092]将过夜16h培养的菌液离心:取1.5mL菌液离心12000rpm, 5min ；
[0093]收集菌体弃上清液；
[0094]在向离心的菌体中加入IOOuL去离子水，然后煮沸悬浮IOmin后，12000rpm离心5min，_20°C保存所得到的上清液。
[0095](2)引物设计
[0096]设计5对特异性引物，预期扩增出的目的片段大小fimH (508bp)KpsMTII (272bp)chuA (279bp) fliCyia (211bp)及 T 载体通用的 M13 引物。
[0097](3) PCR 扩增反应。
[0098]作为本发明实施例的一优化方案，PCR扩增反应体系为:
[0099]DNA 模板 4uL ;dNTP4.0uL，含 MgCl2 ； 10 XPCR Buffer5.0uL ;Tag 酶 0.2uL ;引物 PlluL，20pmol ;引物 P2 luL，20pmol ；ddH2038uL ;总体积为 50uL。
[0100]作为本发明实施例的一优化方案，PCR扩增的具体条件如下:
[0101]KpsMTII PCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0102]FimHPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0103]FliC PCR反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，50°C退火40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0104]chuAPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，52°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0105]yjaPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，50°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0106]PapCPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 40s，72°C延伸 45s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0107]PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶，100V电泳20min，拍照观察结果。
[0108]作为本发明实施例的一优化方案，统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布的方法为: [0109]统计fimH、KpsMTI1、chuA、fliC、yja和PapC在所检测25株菌中出现的频率。
[0110]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0111]本发明利用PCR聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction),对25株大肠杆菌阳性菌株菌进行相关毒力因子fimH，KpsMTII，，chuA，fliC，yjadP PapC的检测筛选。其结果显示:KpsMTII在所检测25株菌中出现的频率最高，占40% ;其次是fliC，占32.5%, fimH占20%，合计占52.5% ；chuA占7.5%，yja和PapC均未检出。其目的是通过确定大肠杆菌形成生物膜毒力基因的分布情况，为大肠杆菌生物膜的形成机理提供理论依据。
[0112]I 材料
[0113]1.1病料25株生物膜鉴定阳性大肠杆菌甘油菌为本实验室保存。
[0114]1.2培养基
[0115]LB培养基M9培养基麦康凯培养基。
[0116]1.3试剂药品
[0117]10XtagplusBuffer, dNTPMisture, DL2000marker,6X loading Buffer,核酸染料(EB) I X TAE，冰醋酸，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，U型96孔板(3599)购自Corning Costar公司。结晶紫购于Baso公司，1%PBS缓冲溶液，33%冰醋酸溶液。
[0118]1.4 仪器
[0119]紫外线可见分光光度计C0DES54 ;全波长酶标仪Power Wave XS美国产；THZ-82A气浴恒温振荡器，金坛市医疗仪器厂；小型离心机:(Sigmal_13Labway Science)。
[0120]2 方法
[0121]2.1生物膜-96孔板微量法测定生物膜
[0122](I)从_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取IOOuL菌液接种于5mLLB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养。[0123](2)将菌液接种于麦康凯培养基中。置于37°C恒温培养箱内培养24h。
[0124](3)麦凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h。
[0125](4)按1:100倍稀释:取培养的菌液50uL于新鲜的5mLLB试管液体培养基上，于37°C缓慢震摇4.5h，保证细菌处于对数生长期。
[0126](5)将紫外可见分光光度计预热半小时。
[0127](6)取2mL菌液于干净比色皿中，同时取2mLLB液体培养基作为空白对照。
[0128](7)调整波长为600nm，初始波长为200nm。
[0129](8)测菌液OD6tltlnm值，记录数据。
[0130](9)用灭菌的M9液体培养基将所测OD6tltlnm值稀释至0.01。
[0131](10)取200uL稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，每个菌液加6孔，用M9液体培养基作为空白对照。于37 °C恒温箱中培养36h。
[0132](11)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液。
[0133](12)用1%PBS缓冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干。
[0134](13)将甲醇加入96孔U型平底板中，固定15min,倒出并晾干。
[0135](14)将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水冲洗，晾干后观察并记录结果。
[0136](15)将33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定0D6(l(lnm。
[0137](16)对此实验在不同时间再重复一次。
[0138](17)生物膜阳性OD6tltlnm值判定标准，将阴性对照平均OD值加上其3倍的标准差SD定义为临界值(cut-off，0dc0)，基于临界值ODc，菌株生物膜可以分为:0D ( ODc为不粘附
(_)0Dc〈0D ( 20Dc 为弱粘附( + )，20Dc〈0D ( 30D 为中等粘附(++)0D>30Dc 为强粘附(+++)
[16].
[0139]2.2生物膜毒力基因筛选实验
[0140]2.2.1菌体的处理
[0141]将过夜16h培养的菌液离心:取1.5mL菌液离心12000rpm，5min)。收集菌体弃上清液。在向离心的菌体中加入IOOuL去离子水，然后煮沸悬浮IOmin后，12000rpm离心5min。_20°C保存所得到的上清液
[0142]2.2.2引物设计
[0143]分别设计5对特异性引物，送上海Sangon公司合成，预期扩增出的目的片段大小fimH (508bp) KpsMTII (272bp) chuA (279bp) fliC yia (211bp)及 T 载体通用的 M13 引物。引物序列见表1。
[0144]表1毒力基因引物序列
[0145]Table I Primer sequences of virulence gen
[0146]
【权利要求】
1.一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤一、准备筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料； 步骤二、生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜； 步骤三、筛选大肠杆菌生物膜毒力基因； 步骤四、记录大肠杆菌形成生物膜检测-96孔微量板法的结果、目的基因fimH、KpsMTI1、chuA、fliCPCR扩增结果、毒力基因筛选结果； 步骤五、统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布。
2.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料包括病料、培养基、试剂药品、仪器； 病料为25株生物膜鉴定阳性大肠杆菌甘油菌；培养基为LB培养基、M9培养基、麦康凯培养基；试剂药品为 10 X tagplusBuffer、dNTPMisture、DL2000marker、6 X loadingBuffe、核酸染料EBl X TAE,胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖、U型96孔板、结晶紫、1%PBS缓冲溶液、33%冰醋酸溶液；仪器为紫外线可见分光光度计C0DES54、全波长酶标仪PowerffaveXS> THZ-82A气浴恒温振荡器、小型离心机。
3.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜的具体方法为: (1)从_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取IOOuL菌液接种于5mLLB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养； (2)将菌液接种于麦康凯培养基中，置于37°C恒温培养箱内培养24h； (3)麦凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h ； (4)按1:100倍稀释:取培养的菌液50uL于新鲜的5mLLB试管液体培养基上，于37°C缓慢震摇4.5h，保证细菌处于对数生长期； (5)将紫外可见分光光度计预热半小时； (6)取2mL菌液于干净比色皿中，同时取2mLLB液体培养基作为空白对照； (7)调整波长为600nm，初始波长为200nm； (8)测菌液OD6tltlnm值，记录数据； (9)用灭菌的M9液体培养基将所测OD6tltol值稀释至0.01 ; (10)取200uL稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，每个菌液加6孔，用M9液体培养基作为空白对照，于37°C恒温箱中培养36h ； (11)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液； (12)用1%PBS缓冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干； (13)将甲醇加入96孔U型平底板中，固定15min,倒出并晾干； (14)将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水冲洗，晾干后观察并记录结果； (15)将33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定OD6ticinm。
4.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，生物膜阳性OD6tltlnm值判定标准如下:将阴性对照平均OD值加上其3倍的标准差SD定义为临界值cut-off，OdcO，基于临界值ODc，菌株生物膜可以分为:0D ( ODc为不粘附，即(-);0Dc〈0D ( 20Dc为弱粘附，即( + );20Dc〈0D ( 30D为中等粘附，即(++) ；0D>30Dc为强粘附，即(+++)。
5.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的具体方法为: (1)菌体的处理 将过夜16h培养的菌液离心:取1.5mL菌液离心12000rpm, 5min ； 收集菌体弃上清液； 在向离心的菌体中加入IOOuL去离子水，然后煮沸悬浮IOmin后，12000rpm离心5min，_20°C保存所得到的上清液； (2)引物设计 设计5对特异性引物，预期扩增出的目的片段大小fimH (508bp)KpsMTII (272bp)chuA(279bp) fliCyia (211bp)及 T 载体通用的 M13 引物； (3)PCR扩增反应。
6.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为:
DNA 模板 4uL ；dNTP4.0uL，含 MgCl2 ；10XPCRBuffer5.0uL ;Tag 酶 0.2uL ;引物 Pl IuL,20pmol ;引物 P2 luL，20pmol ；ddH2038uL ;总体积为 50uL。
7.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，PCR扩增的具体条件如下: KpsMTIIPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； FimHPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共 30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； FliCPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，50°C退火 40s，72°C延伸 30s，共 30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； chuAPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，52°C退火 40s，72°C延伸 30s，共 30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； yjaPCR反应条件:95°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火40s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； PapCPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 40s，72°C延伸 45s，共 30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶，100V电泳20min，拍照观察结果。
8.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布的方法为: 统计fimH、KpsMTII, chuA、fliC、yja和PapC在所检测25株菌中出现的频率。
【文档编号】G01N21/31GK103602723SQ201310353877
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】喻华英, 焦海宏 申请人:塔里木大学