全内反射荧光显微成像方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明提出了一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法及装置。所述装置包括激光器，发出激光束；针孔滤波器，对激光器发出的激光束进行空间滤波；准直透镜，将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；偏振转换系统，对所述平行光束进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振光束；光瞳滤波器和环形光阑，对获得的高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场；反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上，光电探测器用于探测信号，以及信号分析处理系统。
【专利说明】全内反射荧光显微成像方法及装置
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及全内反射荧光显微成像技术，具体涉及一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法及装置。
【背景技术】
[0002]全内反射突光显微技术(TotalInternal Reflection FluorescenceMicroscopy, TIRFM)是近年来新兴的一种光学成像技术，它利用全内反射产生的倏逝场来照明样品，从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合。目前已成功的实现了 IOOnm甚至更低的空间分辨率，被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。
[0003]全内反射荧光显微技术的提出应该追溯到20世纪80年代中期。到目前，科学家们已发展了多种全内反射荧光显微成像系统，其中棱镜型和物镜型是最为普遍的两种类型。棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰，但是放置样品的空间受到棱镜的限制。物镜型系统中样品的放置则非常方便，并且在对样品的控制上可与多种其它技术相结合，例如纳米操纵、光镊技术等，展现出更加诱人的生物应用前景。
[0004]作为一种光学显微镜，如何进一步提高成像的空间分辨率和时间分辨率依然是全内反射荧光显微技术的关键问题之一。
【发明内容】
[0005]本发明将高级次轴对称偏振光束引入到全内反射荧光显微技术中，通过灵活的调控入射光束的偏振及相位分布，可以灵活调控“荧光探针”的空间分布，从而实现高分辨率的显微成像。
[0006]本发明提供一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像装置，包括:激光器，发出激光束；针孔滤波器，对激光器发出的激光束进行空间滤波；准直透镜，将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；偏振转换系统，对所述平行光束进行偏振态转换，获得轴对称偏振分布；光瞳滤波器和环形光阑，对获得的轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑的作用是阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，因此只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制；反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上；光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号；信号分析处理系统，对信号进行分析处理。
[0007]可选的，所述偏振转换系统包括:棱镜，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；和一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进聚焦物镜。
[0008]可选的，所述光束偏转系统包括:电控偏转器，用于将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束。
[0009]可选的，所述高级次轴对称偏振光束的偏振级次小于5，聚焦系统透镜数值孔径高于 0.95。
[0010]本发明提供一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射突光显微成像方法，包括如下步骤:激光器发出激光束；针孔滤波器对激光器发出的激光束进行空间滤波；准直透镜将经过空间滤波的激光束准直为平行光束；偏振转换系统对所述平行光束进行偏振态转换，获得轴对称偏振分布；光瞳滤波器和环形光阑对获得的轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑用于阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，因此只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制；反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上；光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号；信号分析处理系统，对信号进行分析处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1 (a)是初始偏振方位角为-45°的柱矢量光束(P=I)，图1 (b)是径向偏振光，图1 (C)是切向偏振光，图1 (d)是P=2的柱矢量光束，图1 (e)是P=3的柱矢量光束，图1 (f)是P=4的柱矢量光束，其中箭头表示对应位置线偏振的方位。
[0012]图2(a)是基于轴对称偏振光束的全内反射荧光显微技术结构示意图，图2(b)是差动共焦检测系统，图2(c)是基于旋转棱镜的光束偏转系统，以及图2(d)是基于电控偏转器的光束偏转系统。
[0013]图3(a)和图3(b)是生成高级次轴对称偏振光束的两种典型方法。
[0014]图4 (a)-图4 (b)是偏振级次为4的两种高级次轴对称偏振光束在玻璃_样品界面附近的倏逝场强度分布，图4(c)-图4(d)是偏振级次为10的两种高级次轴对称偏振光束在玻璃-样品界面附近的倏逝场强度分布。
[0015]图5是针孔阵列板的结构示意图。
【具体实施方式】
[0016]在本发明中，通过采用具有空间偏振变化的轴对称偏振光束，调控入射激光光束的振幅、相位及偏振分布，可调控倏逝场的分布，获得更小的“荧光探针”，提高探测的空间分辨率，实现了三维超分辨聚焦。
[0017]轴对称偏振光束是一类具有轴对称偏振分布特性的矢量光束，对称轴为光束的传播轴。在光束横截面上任意一点(中心点除外)都为线偏振，沿圆周方向的偏振方位变化满足如下关系，
[0018]
【权利要求】
1.一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像装置，包括: 激光器，发出激光束； 针孔滤波器，对激光器发出的激光束进行空间滤波； 准直透镜，将经过空间滤波的激光束准直为平行光束； 偏振转换系统，对所述平行光束进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振光束； 光瞳滤波器和环形光阑，对获得的高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑的作用是阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声；反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，因此只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制， 反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上， 光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号， 信号分析处理系统，对信号进行分析处理。
2.如权利要求1所述的全内反射荧光显微成像装置，其中，所述偏振转换系统包括:棱镜，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；和一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进聚焦物镜。
3.如权利要求1所述的全内反射荧光显微成像装置，其中，所述光束偏转系统包括:电控偏转器，用于将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束。
4.如权利要求1所述的全内反射荧光显微成像装置，其中，高级次轴对称偏振光束的偏振级次小于5，并且聚焦系统透镜数值孔径高于0.95。
5.一种基于高级次轴对称偏振光束的全内反射荧光显微成像方法，包括如下步骤: 激光器发出激光束； 针孔滤波器对激光器发出的激光束进行空间滤波； 准直透镜将经过空间滤波的激光束准直为平行光束； 偏振转换系统对所述平行光束进行偏振态转换，获得高级次轴对称偏振光束； 光瞳滤波器和环形光阑对获得的高级次轴对称偏振光束进行振幅及相位调制，其中环形光阑用于阻挡低于全反射临界角的光束入射到聚焦物镜中，使得只有超过临界角的光束入射到玻璃-样品界面上，从而极大抑制了由于透射光荧光激发导致的背景噪声； 反射和聚焦系统，被调制的轴对称偏振光束被反射和聚焦系统聚焦到玻璃与样品之间的界面上，以在玻璃-样品界面上因为全反射而产生倏逝场，该倏逝场沿着玻璃界面传播发生干涉，沿着垂直方向强度以指数形式衰减，只对界面附近的样品进行荧光激发，探测的厚度很薄，背景噪声被极大抑制； 反射和过滤系统，由倏逝场激发的荧光信号经过反射和过滤系统后被聚焦到针孔阵列板上； 光电探测器，布置于针孔阵列板后，以探测信号； 信号分析处理系统，对信号进行分析处理。
6.如权利要求5所述的全内反射突光显微成像方法,其中,所述偏振转换系统包括:棱镜，将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；和一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏转角度以及光斑大小与两透镜的焦距比值有关，使满足偏转方向和光斑大小的光束入射进聚焦物镜中。
7.如权利要求5所述的全内反射突光显微成像方法,其中,所述光束偏转系统包括:电控偏转器，用于将入射的平行光束转换为不同偏转角度的平行光束；一对透镜，所述一对透镜组成望远镜结构，将入射的平行光束转换为偏转方向和光斑大小可控的平行光束。
8.如权利要求5所述的全内反射荧光显微成像方法，其中，高级次轴对称偏振光束的偏振级次小于5，并且聚焦`系统透镜数值孔径高于0.95。
【文档编号】G01N21/64GK103439305SQ201310381350
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】周哲海, 祝连庆, 娄小平, 王君, 张荫民, 刘谦哲, 孟晓辰 申请人:北京信息科技大学