T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种T4化学发光体外诊断试剂盒，本发明对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行T4的检测。
【专利说明】T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种Τ4检测试剂盒，具体涉及一种Τ4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]甲状腺素(Thyroxin(e)，Thx，T4)是甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素，以游离形式释放入血循环中并迅速与血浆蛋白相结合。甲状腺素又称四碘甲状腺原氨酸，由两个3,5- 二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物，是甲状腺的主要激素。甲状腺素的化学本质为四碘甲状腺原氨酸，即T4，有DL，L, D型，其中L型活性强，D型活性较小。甲状腺素无臭，无味，遇光变质，熔点231-233? (分解)，不溶于水和乙醇等普通有机溶剂，但溶于含有无机酸或碱的乙醇，也溶于氢氧化碱和碳酸碱溶液。在其酸性乙醇溶液中加入亚硝酸钠，加热即呈黄色，再加过量氨水即变为粉红色。甲状腺素可由牛、羊、猪等的甲状腺中提取，也可人工合成。甲状腺素主要控制耗氧速率和总代谢速率。甲状腺素具有促进一般组织代谢，提高神经兴奋性和身体发育的作用，可用于治疗甲状腺机能减退，粘液性水肿和克汀病等。定量测定人血清游离T4 (FT4)对甲状腺疾病的诊断，甲状腺的病理、生理研究有重要意义使用。
[0003]T4以前一直用放射免疫分析(RIA)，放射免疫分析它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质，但是放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题，用ELISA方法快速简便，既有放射免疫分析的优点，同时也减少了污染。
[0004]竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和固相抗原竞争结合酶标抗体，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下:(1)将特异性抗原与固相载体连`接，形成固相抗原。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。
(3)加发光液显色:参考管中由于结合的酶标抗体最多，信号值最高。参考管信号值与待测管信号值的大小，代表受检标本抗原的量。待测管信号值越低，表示标本中抗原含量越多。
[0005]由于半抗原都是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。
[0006]现在T4试剂盒比较多的为酶联免疫方法测T4，ELISA法也以快速，简单实效，而被广泛应用，但是相对于化学发光，不具有发光检测的高灵敏度和检测范围。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。本发明对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行T4的检测。
[0008]本发明的一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法技术方案为，该T4化学发光体外诊断试剂盒，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原T4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的T4抗原；酶结合物中含有T4酶标抗体。
[0009]发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
[0010]微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原T4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。
[0011 ] 所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。
[0012]将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为:
①平衡EDC，NHS至室温；
②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解；
③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC ;再室温反应10-20分钟；
④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA；
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T4，室温反应1.5-3小时；
⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-T4；
⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
[0013]步骤②中活化缓冲液包括:0.1M的MES，0.5M的NAC1，调节pH为6.0。
[0014]步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。
[0015]步骤⑥中Tris 为 20-50 mmol /I,η
[0016]耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时；
③洗漆一次后，放入真空干燥箱4-6小时；
④真空封袋后，放入4度冰箱。
[0017]其中，步骤①中的包被液为，氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的混合水溶液，其中还可以含有防腐剂。
[0018]上述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，
①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀,37 0C反应50-80分钟；
②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；
③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原T4的量。
[0019]浓缩洗涤液加纯水稀释为洗涤液(例:20Χ浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为IX洗涤液)。
[0020]本发明的有益效果为:本发明的试剂盒使用方便，本发明运用化学发光法定量检测，可以使其检测范围更加宽广，增加其灵敏度，精密度实验也优于一般的ELISA方法。而对比市面上的化学方法定量检测试剂盒，本发明试剂盒用的为间接法，通过包被小分子半抗原，采用竞争法检测T4。
[0021]小分子抗原，又称为半抗原，这些小分子本身没有免疫原性，当与载体结合后形成大分子，可以获得免疫原性。半抗原与载体形成的免疫原，当半抗原分子量极小，或则极性较大时，小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板条上，使用BSA偶联小分子，可以形成较大的分子量，通过疏水作用就容易吸附于固相载体上，这样的方法灵敏度高，高度的特异性和灵敏性，能使分析过程简化。
[0022]EDC将T4和载体进行耦联。EDC能与载体蛋白BSA形成一种活泼的酯结构，半抗原T4的基团上有羧基基团，能使之与BSA-EDC反应，可以形成BSA-T4偶联物。甲状腺素-牛血清白蛋白偶联物(Thyroxin(e)-Bovine Serum Albumin Conjugate,Thx-BSA Conjugate,T4-BSA Conjugate)是甲状腺素与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)经化学交联获得的偶联物，可作为抗原免疫动物用于抗体的制备，或包被于固相载体用于甲状腺素及其抗体的检测。
[0023]采用竞争法检测小分子半抗原T4，该方法的好处在于操作简单，一步完成，包被一般不会出现过量包被造成IC50值(被抑制一半时抑制剂的浓度)较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，灵敏度和精确度较高。而采用包被抗体的方法很容易造成包被过量影响IC50值，并且小分子的标记通常不能采用经典的过碘酸钠法，需要采用其他的化学方法，EDC0 NHS/EDC等，对酶的活性`有一定的影响。
`[0024]【专利附图】
【附图说明】:
图1所示为竞争法原理图；
图2所示为校准品趋势图。
[0025]【具体实施方式】:
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0026]实施例1 材料:
活化缓冲液:0.1M MES, 0.5M NACl, ρΗ6.0 ；
载体蛋白=BSA ；
目的蛋白:小分子半抗原Τ4;
NHS ;巯基乙醇；脱盐柱 将小分子半抗原Τ4和载体蛋白进行耦联，
①平衡EDC (1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，NHS (N-羟基丁二酰亚胺)至室温。
[0027]②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，BSA (牛血清白蛋白)用活化缓冲液溶解，终浓度为5mg/mL。
[0028]③将200uL EDC溶液与500uL BSA溶液混合后，加入200uL NHS溶液，室温反应15分钟，后加入IOOuL EDC0再反应15分钟。
[0029]④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白(EDC-BSA)。
[0030]⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白(小分子半抗原T4)，室温反应2小时。
[0031]⑥加入30 mmol/L Tris终止反应，得到耦联蛋白(BSA-T4)。
[0032]⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心4次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
[0033]试剂盒微孔板制备:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。
[0034]③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。
[0035]④真空封袋后，放入4度冰箱。
[0036]其中，步骤①中的包被液为，IL纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。
[0037]校准品、质控品制备:用T4抗原、样品稀释液(1%BSA溶解于PH7.4的PBS溶液中)分别配制浓度为l、20、100、300`、800、1500ng/ml的6个校准品、100、800ng/ml的2个质控
品O
[0038]酶结合物制备:
用T4酶标抗体、酶稀释液(20%小牛血清混合于pH7.4的PBS溶液中)配制成一定浓度的酶结合物。
[0039]试剂盒的使用:
①分别向微孔板中加入50uL校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入IOOuL酶标抗体，分别与校准品、质控品和待测样本充分混匀，37°C反应60分钟。
[0040]②浓缩洗涤液加纯水稀释为I X洗涤液(例:20 X浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为IX洗涤液)，加入洗涤液洗涤四次，每次加洗涤液量为350UL。
[0041]③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出待测样本中T4抗原的量。
[0042]发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
[0043]实验结果:
表1:校准品结果_
【权利要求】
1.一种T4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原Τ4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的Τ4抗原；酶结合物中含有Τ4酶标抗体。
2.根据权利要求1所述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
3.根据权利要求1所述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原Τ4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种Τ4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原Τ4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。
5.根据权利要求4所述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，将小分子半抗原Τ4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为: ①平衡EDC，NHS至室温； ②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解； ③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后 再加入1-2体积份的EDC ;再室温反应10-20分钟； ④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA； ⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原Τ4，室温反应1.5-3小时； ⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-T4； ⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
6.根据权利要求5所述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，步骤②中活化缓冲液包括:0.1M的MES，0.5Μ的NACl，调节pH为6.0。
7.根据权利要求5所述的T4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45_55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。
8.根据权利要求5所述的T4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，步骤⑥中Tris为20-50 mmol /I,η
9.根据权利要求5所述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为: ①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时； ②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时； ③洗漆一次后，放入真空干燥箱4-6小时； ④真空封袋后，放入4度冰箱。
10.如权利要求1所述的Τ4化学发光体外诊断试剂盒的使用方法，其特征在于， ①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀,37 0C反应50-80分钟； ②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原T4的量。
【文档编号】G01N33/78GK103499564SQ201310403102
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】穆海东, 汪宁梅, 陈福美, 沈珏璟 申请人:上海裕隆医学检验所股份有限公司