一种测定生物样品中游离分析物的方法及测定药物蛋白结合率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定生物样品中游离分析物的方法，采用溶剂棒中空纤维液相微萃取技术，通过利用反萃过程中浓度曲线法来测得溶剂棒中空纤维液相微萃取的时间常数，进而通过测定预平衡溶剂棒中空纤维液相微萃取所获得的分析物的预平衡浓度来计算实际样品中游离分析物的浓度。在含有蛋白的生物样品中，根据游离药物浓度可以进而计算出药物蛋白结合率。本方法样品前处理装置简单、操作方便，无须使用氘代物，不改变生物样品的性质，可实现简单、快速、准确地测定生物样品中游离分析物的含量。
【专利说明】一种测定生物样品中游离分析物的方法及测定药物蛋白结合率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学分析方法，特别涉及一种测定生物样品中游离分析物的方法及测定药物蛋白结合率的方法。
【背景技术】
[0002]近年来游离型药物受到越来越多的关注和重视，并已成为药动学和治疗药物监测的研究热点之一。药物进入机体血液后有两种存在形式。一种是结合型药物；弱酸性药物与白蛋白结合，弱碱性药物与1-酸性糖蛋白(AGP)结合。另一种为游离型药物。血浆中的游离型药物是产生药理效应的部分，游离药物浓度与受体部位药物平衡，因而其与药效或药物不良反应密切相关，也只有游离型药物才能被机体转化和排泄。
[0003]中空纤维液相微萃取对复杂样品中微量组分的提取、分离、富集和浓缩起重要作用。中空纤维具有能使药物分子通过，生物大分子或结合药物的生物大分子不能通过的特殊结构。利用中空纤维的结构特性测定游离药物浓度及药物蛋白结合率的研究已有报道，上述所有工作都是采用平衡萃取法。而相对较长的平衡萃取时间正是中空纤维液相微萃取最主要的方法缺陷。对于药物分析而言，过长的萃取时间会影响游离药物和结合药物的平衡，进而会在生物样品的分析中产生一些假象而影响结果的准确度和精密度。此外，过长的分析时间可能导致萃取溶剂的损失；而生物样品如血浆等也会由于酶的代谢等因素而导致基质的改变。
[0004]对样品进行振荡或搅拌，对血浆等粘度高的样品进行稀释，在萃取相上施加电压等均可以缩短中空纤维液相微萃取的萃取时间。这些处理方法一方面对萃取速率的影响有限，另一方面增加了仪器的难度和操作参数。此外，这些方法都是为了提高传质速率，但对于分配系数低的分析物，传质并不是中空纤维液相微萃取的限速步骤。
[0005]微萃取中的动力学校正最早由Chen等在固相微萃取中提出，是一种利用内标物脱附来校正分析物吸附的微萃取定量技术，在环境分析、动植物活体检测和药物分析等方面有着广阔的应用前景。基于预平衡的动力学校正对如下样品的分析具有突出的优点:1.平衡时间非常长的样品；2.样品浓度过闻；3.基质组成不稳定，如生物样品等。Ouyang等曾经把动力学校正的概念引进到液相微萃取中。上述建立的动力学校正方法都需要氘代物作为反萃过程的内标物。氘代物价格昂贵，分析仪器需要质谱这类高分离效率的仪器(能够分离分析待测分析物及其氘代物)。这些因素限制了预平衡动力学校正方法在微萃取技术中的应用，也限制了预平衡动力学校正中空纤维液相微萃取方法在游离药物快速分析方面的应用。
【发明内容】
[0006]本发明解决的技术问题在于提供一种测定生物样品中游离分析物的方法，以克服现有游离分析物样品前处理的难点，提供一种简单、快速、准确测定生物样品中游离分析物的方法。
[0007]本发明解决的另一技术问题在于提供一种测定药物蛋白结合率的方法，以提供一种简单、快速、准确的测定方法。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明实施例提出了一种测定生物样品中游离分析物的方法，是利用预平衡溶剂棒中空纤维液相微萃取技术，包括以下步骤:
步骤一:制作溶剂棒中空纤维膜微萃取装置；
步骤二:以不同浓度分析物标准品的利用步骤一的萃取装置进行反萃过程，通过浓度曲线法获得溶剂棒中空纤维液相微萃取的时间常数；所述浓度曲线法使用公式(I):
【权利要求】
1.一种测定生物样品中游离分析物的方法，是利用预平衡溶剂棒中空纤维液相微萃取技术，包括以下步骤: 步骤一:制作溶剂棒中空纤维膜微萃取装置； 步骤二:以不同浓度分析物标准品的利用步骤一的萃取装置进行反萃过程，通过浓度曲线法获得溶剂棒中空纤维液相微萃取的时间常数；所述浓度曲线法使用公式(I):
2.根据权利要求1所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述步骤三中游离分析物浓度计算公式如下公式(2):
3.根据权利要求1所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述步骤一是把聚偏氟乙烯中空纤维膜剪成合适的小段，清洗后晾干，并封闭中空纤维膜的一端口。
4.根据权利要求1所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述步骤二中，将含有分析物标准品质量为qO且体积为Ve的萃取剂注入溶剂棒并将溶剂棒两端封口 ；再将溶剂棒完全浸没于体积为Vs的空白生物样品溶液；振荡萃取一段时间t后；取出溶剂棒，静置后剪开溶剂棒的一端，抽取萃取溶剂进行仪器分析获得Q值；根据公式(I )，以Q为纵坐标，qO为横坐标，进行线性回归，曲线的斜率即:
5.根据权利要求4所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述步骤二进一步包括以下步骤: (A)把50-80μ L的含有不同浓度分析物标准品的萃取溶剂加到一端已封闭的溶剂棒中空纤维膜的内腔中，静置； (B)封闭溶剂棒的另一端； (C)把所述中空纤维膜放到样品瓶中，样品瓶中加有1.8-3.8 mL的空白生物样品溶液，涡旋振荡，进行萃取，在萃取过程中，分析物标准品会反萃到样品溶液中，萃取时间t根据浓度曲线的相关系数和仪器分析的灵敏度来决定；(D)萃取完成后，取出中空纤维膜溶剂棒，取纤维膜内腔中的萃取溶剂25-40 μ L，注入仪器进行含量测定，获取公式(I)中的Q值，Q是反萃取时间为t时目标分析物在溶剂棒中的剩余量，根据公式(I)进行线性回归并计算出时间常数a。
6.根据权利要求2所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述步骤三进一步包括以下步骤: (A)把50-80μ L的空白萃取溶剂加到一端已封闭的溶剂棒中空纤维膜的内腔中，静置； (B)封闭溶剂棒的另一端； (C)把上述中空纤维膜放到样品瓶中，样品瓶中加有1.8-3.8 ml的含有待测分析物的生物样品，涡旋振荡，进行萃取，萃取时间根据仪器分析的灵敏度来决定； (D)萃取完成后，取出中空纤维膜溶剂棒，取纤维膜内腔中的萃取溶剂25-40μ L进行含量测定，获取公式(2)中的η值，根据公式(2)，即可以求出实际生物样品中游离分析物的浓度。
7.根据权利要求1所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述萃取溶剂是选自正辛醇、对二甲苯、正己醚中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述步骤二或步骤三中所述预平衡萃取的分析物或分析物标准品的量是由色谱仪进行含量测定；Kes是指分析物在萃取溶剂和样品溶液间的分配系数，查阅文献或摇瓶法测定获得。`
9.一种测定测定药物蛋白结合率的方法，包括根据下述公式(3)计算药物血浆蛋白结合率: PB(%) =X 100 (3) 其中，ΡΒ(%)是药物蛋白结合率；Ct是加入血浆样品中的药物总浓度；Cf是样品溶液中游离药物的浓度，是按权利要求1至8中任一项所述的测定生物样品中游离分析物的方法所计算出来的游离分析物的含量。
10.根据权利要求9所述的测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于:所述游离物是选自盐酸利多卡因、盐酸布比卡因或盐酸丁卡因中的至少一种；所述生物样品溶液为磷酸盐缓冲溶液或牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液。
【文档编号】G01N30/00GK103512961SQ201310414492
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】崔淑芬, 张英雪, 陈敏, 侯金星 申请人:深圳职业技术学院