检测prrsv的多重荧光定量rt-pcr方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测PRRSV多重荧光定量RT-PCR方法及其应用。检测PRRSV荧光定量RT-PCR引物和探针，引物包括AM-PRRSV引物对和TJM-PRRSV引物对，探针包括AM-V-PRRSV-P探针、AM-C-PRRSV-P探针、TJM-PRRSV-P探针；检测PRRSV多重荧光定量RT-PCR方法，利用引物和探针进行荧光定量RT-PCR扩增，扩增后收集荧光信号，出现扩增曲线者为阳性，其特征在于，所述RT-PCR扩增体系包括上述引物和探针。本发明可同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、HP-PRRSV及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株，具有特异性强、敏感性高、自动化程度高优点。
【专利说明】检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物病毒分子生物检测【技术领域】，具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重荧光定量RT-PCR方法，及其应用于同时对PRRSV美洲型经典毒株、美洲型变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株进行快速检测。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),又称“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。PRRS最早于1987年在美国发生，1991年荷兰首次分离到PRRSV，美国亦于1992年分离到该病毒。此后，该病相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性流行，给世界各国养猪业造成巨大的经济损失。根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为欧洲型和美洲型毒株，两种基因型毒株之间基因组差异很大，核苷酸序列同源性仅为60 %左右。1996年郭宝清等首次在国内分离到PRRSV，证实该病在我国存在。2006年国内爆发高致病性猪蓝耳病(HP-PRRS)，并证实其病原是以Nsp2蛋白481 aa和533~561 aa发生30个氨基酸不连续缺失为标志的高致病性变异毒株(HP-PRRSV)。2010年我国开始在临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗，以便有效防控HP-PRRS。这些弱毒疫苗毒株包括由JXA1株致弱的JXA1-R株、由HuN4株致弱的HuN4-R株、由TJ株致弱的TJM-F92株等。其中，TJM - F92疫苗株是在HP-PRRS发病猪体内分离的高致病性强毒TJ株通过噬斑筛选后，在Marc-145细胞上传代至92代，获得了致弱的疫苗毒TJM-F92株。TJM-F92株Nsp2蛋白除了与其它HP-PRRSV一样在多变区不连续缺失30 aa以外，还出现了第1882~2441 aa共120个氨基酸(360个碱基)的连续缺失。2010年农业部批准临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗以来，广西一直采购、使用TJM - F92株活疫苗，而未采购、使用其他弱毒株活疫苗，以便于正确区分临床发病猪体内的PRRSV野毒株和疫苗株。
[0003]当前，国内PRRSV美洲型流行毒株既有经典毒株，也有HP-PRRSV，加上临床使用的弱毒疫苗株，在临床检测中经常发现在同一地区甚至同一养殖场的猪群中同时存在两种或两种以上的病毒株，给该病的诊断带来极大的困难，这就使得建立PRRSV的快速鉴别检测方法显得尤为重要。迄今，国内外建立了一些技术，包括双抗体夹心ELISA、间接免疫荧光抗体试验(IFA)、原位杂交技术(ISH)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、单重及多重荧光定量RT-PCR等。但是已经建立的技术都无法同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗 毒株。因此，建立能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗株的检测方法不仅能弥补现有技术在这一领域的空白，还具有创新性实践意义。
[0004]荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对待测模板进行定性、定量分析的方法。由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、基因突变及其多态性的研究等多个领域。多重荧光定量PCR是荧光定量PCR的一种特殊形式，是在同一反应体系中加入多对引物和多条探针，同时扩增、检测多个模板的荧光定量PCR技术。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是采用多重TaqMan荧光定量RT-PCR技术，针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株基因组中的保守序列，建立同时检测PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，提供同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的引物、探针及其方法。本发明特异性强、灵敏度高，操作安全方便，能实现PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株等三种毒株的同时检测，为PRRSV美洲型野毒株、弱毒疫苗株的同时快速鉴别检测及有效防控HP-PRRS提供了新的途径，具有良好的应用前景。 [0006]本发明的技术方案为:
一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，该方法利用AM-PRRSV引物对、TJM-PRRSV 引物对、AM-V-PRRSV-P 探针、AM-C-PRRSV-P 探针、TJM-PRRSV-P 探针对阳性对照样品、检测样品进行荧光RT-PCR扩增，扩增后收集荧光信号，其特征在于，所述的TJM-PRRSV引物对其上游引物核苷酸序列为5’ - CAACCCTGCACCTGTGTCAT _3’，下游引物核苷酸序列为5’ - TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3’ ；所述的TJM-PRRSV-P探针为5’ -F-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC -Q-3’，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。收集得到的检测样品荧光信号与阳性对照样品(标准品)荧光信号标准曲线进行比对，检测样品荧光定量RT-PCR扩增出现类似阳性对照样品(标准品)的扩增曲线者为阳性，未出现扩增曲线者为阴性。
[0007]作为本发明的进一步限定，所述的AM-PRRSV引物对的上游引物核苷酸序列为5’ - GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC -3’，下游引物核苷酸序列为 5’ - GCCTCATATTCCGTCTGTGA-3’ ；所述的 AM-V-PRRSV-P 探针为 5’ -F- TAGAACTGTGACAACAACGCTGA -Q-3’ ；所述的AM-C-PRRSV-P 探针为 5’-F- AACTGTGTCTCGACCGGTGAC -Q-3’ ；其中 F 为报告荧光基团，Q 为
淬灭荧光基团。
[0008]作为本发明的进一步限定，所述的F为FAM、TAMRA、J0E中的任一种；所述的Q为BHQ 或 MGB。
[0009]作为本发明的进一步限定，所述RT-PCR扩增反应体系还包括Premix Ex Taq?试剂、R0X参比染料、模板、灭菌双蒸水。
[0010]作为本发明的进一步限定，当RT-PCR扩增体系为阳性对照样品反应时，所述的模板为p-C-Nsp2质粒、p-V-Nsp2质粒和p_TJM_F92质粒标准品混合液；当RT-PCR扩增体系为检测样品反应时，所述的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA。
[0011 ] 作为本发明的进一步限定，所述p-C-Nsp2质粒为含有美洲型经典毒株VR-2332株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-V-Nsp2质粒为含有美洲型变异毒株JXA1株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述P-TJM-F92质粒为含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的阳性标准质粒。
[0012]作为本发明的进一步限定，所述的RT-PCR扩增反应条件为95°C 2min —95°C10s — 54°C 30s，进行40个循环，同时收集荧光信号。
[0013]作为本发明的进一步限定，所述的RT-PCR扩增反应体系包括:Premix ExTaqTM10~12.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游引物 0.2~0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游引物 0.2~0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探针 0.15~0.25ul，25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探针 0.2~0.4ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 下游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV-P 探针 0.5~0.7ul, ROX 参比染料 0.4~0.5ul,模板1.0~2.0ul，双蒸水 2.0~8.25ul。 [0014]作为本发明的进一步限定，所述的RT-PCR扩增反应体系包括:Premix ExTaq?12.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游弓丨物 0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游弓丨物
0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探针 0.25ul，25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探针 0.4ul,25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 下游引物 1.2ul，25pmol/^LTJM-PRRSV-P 探针 0.7ul, ROX 参比染料 0.5ul，模板 2.0ul，双蒸水 5.45ul。
[0015]一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法的应用，检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法用于快速检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗毒株。所述高致病性PRRS活疫苗株为TJM-F92株。高致病性PRRS活疫苗株的判定依据是检测样品出现两条扩增曲线，一条要类似于美洲型变异毒株标准曲线，另一条要类似于高致病性PRRS活疫苗株标准曲线。
[0016]本发明的具体原理是，针对PRRSV美洲型经典毒株Nsp2基因、变异毒株Nsp2基因以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因，设计了用于多重荧光定量RT-PCR检测的扩增引物和TaqMan探针，分别使用FAM、J0E、TAMRA等基团作为探针的发光基团，设计并构建标准阳性质粒、计算出其拷贝数，建立阳性对照样品标准曲线，优化RT-PCR的反应体系，以及其反应步骤，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测，构建出基于引物和荧光探针的PRRSV多重荧光定量RT-PCR检测方法。本法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，用于快速检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株，弥补了现有技术在这一领域的空白，具有实用性。试验方法及具体过程如下:
1.设计引物和探针。
[0017]针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的Nsp2基因，设计了用于多重荧光定量RT-PCR检测的扩增引物和TaqMan探针，分别使用FAM、JOE、TAMRA等基团作为探针的发光基团F，以BHQ等基团作为探针的淬灭基团Q，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测。引物和探针序列如表1所示。
[0018]表1检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR所用引物和探针序列
【权利要求】
1.一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，该方法利用AM-PRRSV引物对、TJM-PRRSV 引物对、AM-V-PRRSV-P 探针、AM-C-PRRSV-P 探针、TJM-PRRSV-P 探针对阳性对照样品、检测样品进行荧光定量RT-PCR扩增，扩增后收集荧光信号，其特征在于，所述的TJM-PRRSV引物对其上游引物核苷酸序列为5’ - CAACCCTGCACCTGTGTCAT -3’，下游引物核苷酸序列为5’ - TTCTCCCTTGGAGGGTGCC -3’ ；所述的TJM-PRRSV-P探针为5’ -F-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC -Q-3’，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的AM-PRRSV引物对的上游引物核苷酸序列为5’- GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC _3’，下游引物核苷酸序列为 5’- GCCTCATATTCCGTCTGTGA -3’ ；所述的 AM-V-PRRSV-P 探针为 5’ -F- TAGAACTGTGACAACAACGCTGA -Q-3’ ；所述的 AM-C-PRRSV-P 探针为 5’ -F- AACTGTGTCTCGACCGGTGAC -Q-3’ ；其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
3.根据权利要求f2任一项所述的检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的F为FAM、TAMRA、JOE中的任一种；所述的Q为BHQ或MGB。
4.根据权利要求3所述检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增反应体系还包括Premix Ex Taq?试剂、R0X参比染料、模板、灭菌双蒸水。
5.根据权利要求4所述检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，当RT-PCR扩增体系为阳性对照样品反应时，所述的模板为p-C-Nsp2质粒、p-V-Nsp2质粒和P-TJM-F92质粒标准品混合液；当RT-PCR扩增体系为检测样品反应时，所述的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA。
6.根据权利要求4飞任一项所述的检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述p_C-Nsp2质粒为含有美洲型经典毒株VR-2332株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述P-V-Nsp2质粒为含有美洲型变`异毒株JXA1株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p_TJM_F92质粒为含有高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因的阳性标准质粒。
7.根据权利要求6所述检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的RT-PCR扩增反应条件为95°C 2min —95°C 10s — 54°C 30s，进行40个循环，同时收集突光信号。
8.根据权利要求7所述检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的 RT-PCR 扩增反应体系包括:Premix Ex Taq?l(Tl2.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游引物 0.2~0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游引物 0.2~0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探针 0.15~0.25ul，25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探针 0.2~0.4ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 下游引物 0.8~1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV-P 探针0.5~0.7ul, R0X 参比染料 0.4~0.5ul，模板 1.0~2.0ul，双蒸水 2.0~8.25ul。
9.根据权利要求8所述检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的 RT-PCR 扩增反应体系包括:Premix Ex Taq?12.5ul, 25pmol/^L AM-PRRSV 上游引物 0.4ul，25pmol/^L AM-PRRSV 下游引物 0.4 ul，25pmol/^L AM-V-PRRSV-P 探针 0.25ul,25pmol/^L AM-C-PRRSV-P 探针 0.4ul，25pmol/^L TJM-PRRSV 上游引物 1.2ul，25pmol/^LTJM-PRRSV 下游引物 1.2ul，25pmol/^L TJM-PRRSV-P 探针 0.7ul, ROX 参比染料 0.5ul，模板 2.0ul，双蒸水 5.45ul。
10.一种权利要求1、任一项所述检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法的应用，其特征在于，检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法用于快速检测并区分 PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株。
【文档编号】G01N21/64GK103725793SQ201310424225
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】施开创, 莫胜兰, 胡杰, 邹联斌, 张步娴, 屈素洁, 陆文俊, 粟艳琼, 苏凯, 李军 申请人:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心