一种筛选、检测磷脂酶c的方法

一种筛选、检测磷脂酶c的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测磷脂酶C酶活的方法以及检测磷脂酶C酶活的产品。使用本发明的方法或产品，可以精确定量酶活，检测成本低，便于大量筛选、检测，还便于高通量进行筛选或检测。
【专利说明】一种筛选、检测磷脂酶c的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及磷脂酶C检测领域，具体而言，涉及一种筛选、检测磷脂酶C的方法。

【背景技术】
[0002] 食用油精炼过程中的脱胶一直是精炼工艺发展的难题。常用的水化脱胶，酸炼脱 胶等化学法脱胶手段，都无法高效、低残留地去除毛油中的磷脂，并且去除磷脂的同时还会 吸附大量的食用油，降低了精炼产率。近年来酶法脱胶是研究的热点。鉴于生物酶反应具有 特异性，高效性及可控性等一系列优点，该脱胶法可以对食用油中的磷脂进行有效地去除， 并且减少脱胶过程中食用油的损失，虽然现在还未广泛采用，但是理论上认为酶法脱胶是 优于传统脱胶方法的。例如在sn-3位酶切下磷酯酰基团，从而使油中的磷脂分解成甘油二 酯及溶于水的磷酸复合物(磷脂头)，这类酶被称为磷脂酶C(PLC)。磷脂酶C大致按底物类 型可以分为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C (PC-PLC)，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (PI-PLC)、 磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C (PE-PLC)以及磷脂酸特异性磷脂酶C (PA-PLC)等。
[0003] 在丰富的微生物来源中寻找产出高活力PLC的菌种，是现今磷脂酶研究的主要方 向之一。怎样在庞大复杂的微生物群落中快速地找到目标菌种，是研究中技术需要突破的 地方，其实也就是指PLC活力的检测及其高通量筛选的方法开发。
[0004] PLC酶活力检测的方法现在已有很多（高林.微生物磷脂酶C检测方法的研究进 展.Journal of Anhui Agri Sci2010, 38(23):12412-12413):如
[0005] 卵黄平板法：根据PLC对平板培养基中的卵黄中卵磷脂的水解作用，会在平板上 产生乳白色晕圈，根据晕圈直径大小来判断酶活高低。由于材料简单，操作方便，在酶活力 初筛时被广泛应用，但是无法用于精确定量检测酶活，一般只能用于定性检测。
[0006] 酸碱滴定法：利用PLC水解卵磷脂释放出的酸性水解产物，即磷酸胆碱，然后用 NaOH来滴定磷酸胆碱的量，从而测定PLC的活力。该方法特点反应时间快，但是释放出的酸 性水解产物量少，滴定误差大、操作繁琐，工作效率太低。
[0007] 放射性同位素法：利用不同的放射性同位素标记不同的磷脂底物，待PLC水解各 种底物后，利用放射性检测设备就可以对不同放射性同位素标记的水解产物进行检测，从 而不仅可以对该PLC的活力进行测定，对其磷脂底物的偏好性也可以进行了解。该方法专 一性强，结果准确，但是技术性过高、底物昂贵并且对仪器设备有要求。
[0008] NPPC法：该法利用一种卵磷脂类似结构的合成物质，即对硝基磷酸胆碱（NPPC)， 作为PLC的反应底物，水解后产生了对硝基苯酚，该物质在410nm处有最大吸收波长。此法 重复性好，操作方便，反应时间短，但是由于合成物质成本较大，所以有一定的局限性。
[0009] HPLC法：利用HPLC对PLC的水解产物进行紫外分析，此法准确度最好，并且能掌 握底物消耗速率，特异性的底物种类等多种信息，但是由于技术性过高，对技术人员的仪器 操作水平等都有较高的要求，并且成本较高、检测速度慢，所以未被广泛采用。
[0010] 荧光标记法，化学发光检测法及分光光度法：这几类方法采用的策略相似，分别 利用荧光基团，发光基团等标记了磷脂底物，经PLC水解，分别通过荧光检测，底片感光或 者分光光度计对产物进行检测。这些方法策略是现在PLC检测方法开发的主要方向，特异 性强，灵敏度高，具有很好的准确度，但是底物合成困难、合成成本较高，也存在一定的局限 性。
[0011] 钥蓝定磷法：经PLC水解磷脂底物后，释放出的磷酸复合物，经磷酸酶作用，可以 水解出无机磷酸。在酸性条件下，经还原剂作用，无机磷酸可以与钥酸盐形成钥蓝络合物， 从而在680-800nm处有吸收值，从而对PLC的活力进行测定。
[0012] 钥蓝定磷法的起始思想是来自于混合样品中用于测定含磷量的方法：将样品酸解 或灼烧，使其中的有机磷全部转化为无机磷，从而通过钥蓝定磷法检测总磷含量，即为国标 方法中的定磷法。但是将其应用至磷脂酶活力检测是后续发展的一个新方向。然而在之前 的文献报道中显示，该方法虽然具有很好的重复性，但是为了保证PLC反应后的磷酸复合 物最大程度地释放无机磷酸，对磷酸酶的用量要求很大，而且为了避免反应中其他因素生 成磷钥蓝络合物，需要有一定的方法来去除这些因素的影响。
[0013] 在一些研究中已经报道磷脂酶的活力检测进入高通量筛选模式。Invitrogen公司 的AmplexRedphosphatidylcholine试剂盒[9]以多重生物酶反应为手段，可以针对磷脂 酰胆碱特异性的磷脂酶C进行检测。当磷脂酶C对磷脂酰胆碱切下磷酸胆碱后，利用磷酸 酶切下胆碱单体，使其在胆碱氧化酶的作用下被氧化，释放出过氧化氢，从而利用辣根过氧 化物酶产生化学发光。而该试剂盒中的AmplexRed试剂是一种突光试剂，在化学发光产生 的情况下，会受到该波长的光从而被激发出荧光，最后通过荧光检测，可以对PLC活力进行 测定。该方法特异性强，灵敏度高，但是也具有很多局限性。例如由于该试剂盒中的特色试 剂是与胆碱单体连接的，所以只能检测磷脂酰胆碱特异性的磷脂酶活力，并且底物合成成 本较大，不适合高通量筛选用途；多重生物酶反应由于其复杂性，也具有弊端，从产物发生 到荧光检测，其中任何一个物质反应出现问题就会造成结果无法分析。


【发明内容】

[0014] 本发明的发明人发现，使用磷脂酶C(例如磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇 特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、磷脂酸特异性磷脂酶C)和/或稀释后的磷 脂酶C酶解复合磷脂(包括但不限于大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂)，然后将酶解 液固液分离，将获得的溶液加入到磷酸酶反应体系中反应，再将反应液与钥酸或钥酸盐(例 如包括但不限于钥酸铵、钥酸钠、钥酸钾)溶液接触，检测吸光值，在一定的稀释度下，PLC的 酶活与钥蓝吸光值正相关，因此，可以使用该方法检测PLC酶活。发明人还发现，该方法可 直接用于发酵液中PLC酶活的检测。发明人还发现，在合适的稀释度下，仅根据吸光值的大 小就可确定发酵液的酶活的相对高低，因此，可用于菌株的快速筛选或发酵条件的快速选 择。发明人还发现，使用有机溶剂和/或水溶解的复合磷脂，均可用于本发明，但当使用有 机溶剂(包括但不限于三氯甲烷）溶解复合磷脂时，其反应速度明显快于使用水溶解复合磷 脂的反应速度。
[0015] 因此，本发明的一个目的在于，提供一种检测磷脂酶C酶活的方法.
[0016] 本发明提供的方法包括以下步骤：
[0017] 1)使用磷脂酶C和/或其稀释液酶解复合磷脂；
[0018] 2 )固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸 光值；
[0019] 3)确定磷脂酶C酶活与钥蓝吸光值线性相关的稀释度，
[0020] 4 )计算所述磷脂酶C酶活。
[0021] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂为：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂， 蓖麻磷脂中的一种或多种。
[0022] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于水和/或有机溶剂中。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于有机溶剂。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于三氯甲烷。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，所述分离后溶液与磷酸酶接触为：将分离后溶液与 磷酸酶于30-45°C反应30min以上。
[0026] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为35_42°C。
[0027] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为37-40°C。
[0028] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应时间为0. 5h_2h。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，所述检测吸光值为检测600_810nm的吸光值。
[0030] 在本发明的一个实施方案中，所述检测吸光值为检测650-750nm的吸光值。
[0031] 在本发明的一个实施方案中，所述磷脂酶C为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰 肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。
[0032] 本发明还提供了一种筛选表达磷脂酶C的菌株的方法。
[0033] 本发明提供的方法包括以下步骤：
[0034]1)使用磷脂酶C和/或其稀释液酶解复合磷脂；
[0035]2)固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸 光值。
[0036] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂为：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂， 蓖麻磷脂中的一种或多种。
[0037] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于水和/或有机溶剂中。
[0038] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于有机溶剂。
[0039] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于三氯甲烷。
[0040] 在本发明的一个实施方案中，所述分离后溶液与磷酸酶接触为：将分离后溶液与 磷酸酶于30-45°C反应30min以上。
[0041] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为35-42°C。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为37-40°C。
[0043] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应时间为0. 5h_2h。
[0044] 在本发明的一个实施方案中，所述检测吸光值为检测600_810nm的吸光值。
[0045] 在本发明的一个实施方案中，所述检测吸光值为检测650_750nm的吸光值。
[0046] 在本发明的一个实施方案中，所述磷脂酶C为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰 肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。
[0047] 本发明还提供了一种检测发酵液中磷脂酶C酶活的方法。
[0048] 本发明提供的方法包括以下步骤：
[0049] 1)使用发酵液和/或其稀释液酶解复合磷脂；
[0050] 2 )固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸 光值；
[0051] 3)确定磷脂酶C酶活与钥蓝吸光值线性相关的稀释度；
[0052] 4 )计算所述磷脂酶C酶活。
[0053] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂为：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂， 蓖麻磷脂中的一种或多种。
[0054] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于水和/或有机溶剂中。
[0055] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于有机溶剂。
[0056] 在本发明的一个实施方案中，使用的复合磷脂溶于三氯甲烷。
[0057] 在本发明的一个实施方案中，所述分离后溶液与磷酸酶接触为：将分离后溶液与 磷酸酶于30-45°C反应30min以上。
[0058] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为35_42°C。
[0059] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为37-40°C。
[0060] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应时间为0. 5h_2h。
[0061] 在本发明的一个实施方案中，所述检测吸光值为检测600_810nm的吸光值。
[0062] 在本发明的一个实施方案中，所述检测吸光值为检测650-750nm的吸光值。
[0063] 在本发明的一个实施方案中，所述磷脂酶C为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰 肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。
[0064] 本发明还提供了一种检测磷脂酶C酶活的产品。
[0065] 本发明提供的产品包括：复合磷脂或复合磷脂溶液，磷酸酶储存体系溶液，磷酸酶 反应体系溶液，和钥蓝显色反应物溶液。
[0066] 在本发明的一个实施方案中，所述产品为检测试剂盒。
[0067] 在本发明的一个实施方案中，所述产品还包括磷脂酶反应体系溶液。
[0068] 在本发明的一个实施方案中，所述磷脂酶为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌 醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。
[0069] 本专利中，将钥蓝定磷法应用到PLC的活力检测，磷酸酶对磷酯酰基团（磷脂经磷 脂酶作用后的产物）没有选择性，因而优于上述方法的磷脂酶底物局限性；钥蓝法对游离磷 的检测技术很成熟，因而本方法可以用于精确定量酶活；可使用复合磷脂(包括但不限于大 豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂）作为酶活检测底物，磷酯酰基团量低因而磷酸酶用 量很少，所以检测成本低，便于大量筛选、检测；反应体积上进行了小量化，使之能在96孔 板规模上进行，便于高通量进行筛选或检测；本方法在去除未反应的磷脂底物方法上进行 了改进，直接将复合磷脂溶于氯仿，使PLC酶在一个两相体系中反应，这样优于利用有机溶 剂来萃取底物的方法，不仅操作简便，而且可以将复合磷脂中的杂质成分隔离在有机相，不 会影响到水相的后续检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0070] 图1为磷钥蓝检测的标准曲线。
[0071] 图2显示磷酸酶反应速度与底物（P0，）浓度增加的关系。
[0072] 图3显示磷酸酶（CIAP)反应产物生成率与其浓度增加的关系。
[0073] 图4显示磷钥蓝络合物在700nm处吸光值与PLC浓度的关系。

【具体实施方式】
[0074] 本文所公开的"范围"以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个 或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限 定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限 可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60 - 120和80 - 110的 范围，理解为60 - 110和80 - 120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1 和2,和如果列出了最大范围值3,4和5,则下面的范围可全部预料到：1 一 3、1 一 4、1 一 5、 2 - 3、2 - 4、和 2 - 5。
[0075] 在本发明中，除非有其他说明，组合物的各组分的含量范围以及其优选范围之间 可以相互组合形成新的技术方案。
[0076] 在本发明中，除非有其他说明，"其组合"表示所述各元件的多组分混合物，例如两 种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
[0077] 在本发明中，除非有其他说明，所有"份"和百分数（％)都指重量百分数。
[0078] 在本发明中，除非有其他说明，所有组合物中各组分的百分数之和为100%。
[0079] 在本发明中，除非有其他说明，数值范围"a_b"表示a到b之间的任意实数组合的 缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围"0-5"表示本文中已经全部列出了 "0-5" 之间的全部实数，"0-5"只是这些数值组合的缩略表示。
[0080] 在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围"a-b"表示a到b之间的任意整数组 合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围"1-N"表示1、2……N，其中N是 整数。
[0081] 如果没有特别指出，本说明书所用的术语"一种"指"至少一种"。
[0082] 如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数）的基准都是所述组合 物的总重量。
[0083] 在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
[0084] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方 式可以相互组合形成新的技术方案。
[0085] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可 以相互组合形成新的技术方案。
[0086] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以 随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤（a )和（b )，表示所述方法可包 括顺序进行的步骤（a)和（b)，也可以包括顺序进行的步骤（b)和（a)。例如，所述提到所述 方法还可包括步骤（c)，表示步骤（c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以 包括步骤（a)、（b)和（c)，也可包括步骤（a)、（c)和（b)，也可以包括步骤（c)、（a)和（b)等。 [0087] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的"包括"表示开放式，也可以是封 闭式。例如，所述"包括"可以表示还可以包含没有列出的其他元件，也可以仅包括列出的 元件。
[0088] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文实施例中的具体数值以及具体物质可与 本文描述部分的其他特征结合。例如，本文描述部分提到反应的温度为l〇-l〇〇°C，而实 施例提到的反应温度为20°c，那么可以认为本文已经具体公开了 10-20°c的范围，或者 20-100°C的范围，且该范围可以描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。又例如， 本文描述部分提到一类化合物醇，而实施例提到的具体的醇为乙醇，那么乙醇可以与描述 部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。
[0089] 本发明的发明人发现，使用磷脂酶C(例如磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇 特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C、磷脂酸特异性磷脂酶C)和/或稀释后的磷 脂酶C酶解复合磷脂(包括但不限于大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂)，然后将酶解 液固液分离，将获得的溶液加入到磷酸酶反应体系中反应，再将反应液与钥酸或钥酸盐(例 如包括但不限于钥酸铵、钥酸钠、钥酸钾)溶液接触，检测吸光值，在一定的稀释度下，PLC的 酶活与钥蓝吸光值正相关，因此，可以使用该方法检测PLC酶活。发明人还发现，该方法可 直接用于发酵液中PLC酶活的检测。发明人还发现，在合适的稀释度下，仅根据吸光值的大 小就可确定发酵液的酶活的相对高低，因此，可用于菌株的快速筛选或发酵条件的快速选 择。发明人还发现，使用有机溶剂和/或水溶解的复合磷脂，均可用于本发明，但当使用有 机溶剂(包括但不限于三氯甲烷）溶解复合磷脂时，其反应速度明显快于使用水溶解复合磷 脂的反应速度。
[0090] 在本发明中，术语"磷酸酶"指的是能催化磷酸单酯的水解的酶，但不能催化磷酸 二酯以及磷酸三酯的水解的磷酸酶。
[0091] 因此，本发明提供了一种检测PLC酶活的方法，该方法包括以下步骤：
[0092] 1)使用磷脂酶C和/或其稀释液酶解复合磷脂；
[0093] 2 )固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸 光值；
[0094] 3)确定磷脂酶C酶活与钥蓝吸光值线性相关的稀释度；
[0095] 4 )计算所述磷脂酶C酶活。
[0096] 本发明还提供了一种筛选表达磷脂酶C的菌株的方法，该方法包括以下步骤： [0097] 1)使用磷脂酶C和/或其稀释液酶解复合磷脂；
[0098] 2 )固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸 光值。
[0099] 本发明还提供了一种检测发酵液中磷脂酶C酶活的方法，该方法包括以下步骤：
[0100] 1)使用发酵液和/或其稀释液酶解复合磷脂；
[0101] 2 )固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸 光值；
[0102] 3)确定磷脂酶C酶活与钥蓝吸光值线性相关的稀释度；
[0103] 4 )计算所述磷脂酶C酶活。
[0104] 在本发明的一个实施方案中，所述复合磷脂为本领域中常规使用的复合磷脂，包 括但不限于：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂中的一种或多种。
[0105] 在本发明的一个实施方案中，所述的磷脂酶C为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂 酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。
[0106] 在本发明的一个实施方案中，所述复合磷脂溶于水、有机溶剂或水与有机溶剂组 成的混合溶剂中。
[0107] 在本发明的另一个实施方案中，所述复合磷脂溶于有机溶剂。
[0108] 在本发明的另一个实施方案中，所述复合磷脂溶于三氯甲烷。
[0109] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系为包含磷酸酶、Mg2+和缓冲液的 磷酸酶反应体系。
[0110] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系为包含磷酸酶、Ca2+和缓冲液的 磷酸酶反应体系。
[0111] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的磷酸酶为l〇_15U/mL。
[0112] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的Mg2+为2-20mM。
[0113] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系中的Ca2+为2_20mM。
[0114] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系的缓冲液为 40-100mMTris-Cl(pH8. 0-9. 0)〇
[0115]在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含10-15U/mL磷酸酶，2_20mM Mg2+ 和 / 或 40-100mM Tris-Cl (pH8. 0-9. 0)。
[0116]在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系包含10-15U/mL磷酸酶，2_20mM Ca2+ 和 / 或 40-100mM Tris-Cl (pH8. 0-9. 0)。
[0117] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶反应体系为：50mM Tris-Cl (pH9.0)， 10mM MgCl2，碱性磷酸酶 10U/mL。
[0118] 在本发明的一个实施方案中，使用的钥酸盐为钥酸铵、钥酸钠、钥酸钾中的一种或 多种。
[0119] 在本发明的一个实施方案中，使用的钥酸盐的浓度为2-3%，优选为2. 4-2. 6%。
[0120] 在本发明的一个实施方案中，使用的钥酸盐的浓度为2%，2. 1%，2. 2%，2. 3%，2. 4%， 2. 5%，2. 6%，2. 7%，2. 8%，2. 9%，或 3. 0%。
[0121] 在本发明的一个实施方案中，所述分离后溶液与磷酸酶接触为：将分离后溶液与 磷酸酶于30-45°C反应至少30min。
[0122] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为35_42°C。
[0123] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为37-40°C。
[0124] 在本发明的一个实施方案中，分离后溶液与磷酸酶的反应温度为3〇°c，3rc， 32°C，33°C，34°C，35°C，36°C，37°C，38°C，39°C，4(TC，41°C，42°C，43 摄氏度，44°C，或 45°C。
[0125] 在本发明的一个实施方案中，所述分离后溶液与磷酸酶的反应时间为0. 5_2h。
[0126] 在本发明的一个实施方案中，与磷钥蓝标准曲线比较，确定不同稀释度下磷脂酶C 酶活与吸光值线性相关区域。
[0127] 在本发明的一个实施方案中，于600-810nm检测吸光值，优选于650-750nm检测吸 光值。
[0128] 在本发明的一个实施方案中，于 600nm，610nm，620nm，630nm，640nm，650nm，660nm, 670nm，680nm，690nm，700nm，710nm，720nm，730nm，740nm，750nm，760nm，770nm，780nm， 690nm，800nm，或810nm检测吸光值。
[0129] 在本发明的一个实施方案中，计算所述磷脂酶C酶活为：计算吸光值线性相关的 稀释度下磷脂酶C酶活，计算上述稀释度下磷脂酶C酶活的平均值。
[0130] 本发明还提供了一种检测磷脂酶C酶活的产品。
[0131] 本发明提供的产品包括：复合磷脂或复合磷脂溶液，磷酸酶储存体系溶液，磷酸酶 反应体系溶液，和钥蓝显色反应物溶液。
[0132] 在本发明的一个实施方案中，本发明提供的产品包括磷脂酶反应体系溶液。在本 发明中，可使用的磷脂酶反应体系溶液为本领域的技术人员所熟知的体系，也可根据本发 明公开的内容或实际需要，进行适当调整。在本发明的一个实施方案中，磷脂酶反应体系溶 液包括缓冲体系及提供PLC反应所需的活性金属离子。在本发明的一个实施方案中，PLC 反应所需的活性金属离子为Ca 2+，Zn2+中的一种或多种；缓冲体系为pH6. 5-8. 0的缓冲溶 液，优选的缓冲溶液为Tris-Cl。在本发明的一个实施方案中，用于PLC反应的溶液包括： 25-50mM Tris-Cl (pH6. 5-8. 0),2-5mM CaCl2〇
[0133] 在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶储存体系溶液包括磷酸酶及稳定所述磷 酸酶的溶液。在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶储存体系溶液包括400-10, 000U/mL 的磷酸酶。在本发明的一个实施方案中，所述磷酸酶储存体系溶液中稳定所述磷酸酶的溶 液包括：50-150mM Tris-Cl(pH8. 0-9. 0)，5-10mM MgCl2。在本发明的一个实施方案中，所述 磷酸酶储存体系溶液为：50-150mM Tris-Cl (pH8. 0-9. 0)，5-10mM MgCl2,500U/mL 磷酸酶。
[0134] 在本发明中，可使用的磷酸酶反应体系溶液为本领域的技术人员所熟知的体系， 也可根据本发明公开的内容或实际需要，进行适当调整。在本发明的一个实施方案中，用于 磷酸酶反应体系溶液包括缓冲体系及提供磷酸酶反应所需的活性金属离子。在本发明的一 个实施方案中，磷酸酶反应所需的活性金属离子为Mg 2+，Ca2+中的一种或多种；缓冲体系为 pH8. 0-9. 0的缓冲溶液，优选的缓冲溶液为Tris-Cl。在本发明的一个实施方案中，用于磷 酸酶反应的溶液包括：200-500mM Tris-Cl (pH8. 0-9.0)，10-100mM MgCl2。
[0135] 在本发明中，可使用的钥蓝显色反应物溶液为本领域的技术人员所熟知的体系， 也可根据本发明的内容或实际，进行适当调整。在本发明的一个实施方案中，钥蓝显色反应 物溶液包括钥酸或钥酸盐溶液和硫酸。在本发明的一个实施方案中，所述钥酸盐为钥酸铵， 钥酸钠和钥酸钾中的一种或多种。在本发明的一个实施方案中，钥蓝显色反应物溶液包括 0? 1-0. 2%(w/v)钥酸铵溶液，l-5%(v/v)硫酸。
[0136] 在本发明的一个实施方案中，该产品为检测试剂盒。
[0137] 在本发明的一个实施方案中，检测磷脂酶C酶活的产品中包括：
[0138] 提供PLC酶反应的底物的试剂1，例如可使用1-5% (w/v)的用氯仿溶解的复合磷 脂。
[0139] 进行磷酸酶反应的缓冲体系及提供磷酸酶反应所需的活性金属离子的试剂2,例 如可使用 200-500mM Tris-Cl (pH8. 0-9.0)，10-100mM MgCl2。
[0140] 提供反应所需的磷酸酶的试剂3,例如可使用400-10, OOOU/mL碱性磷酸酶， 50-150mM Tris-Cl (pH8. 0-9.0)，5-10mM MgCl2, 20-50% 甘油。
[0141] 提供钥蓝显色反应所需的反应物的试剂4,例如可使用0. 1-0. 2%(w/v)钥酸铵溶 液，1 -5% (v/v)硫酸。
[0142] 在本发明的一个实施方案中，检测磷脂酶C酶活的产品中还包括：
[0143] 进行PLC反应的缓冲体系及提供PLC反应所需的活性金属离子的试剂5,例如可使 用 25-50mM Tris-Cl (pH6. 5-8.0)，2-5mM CaCl2。
[0144] 本发明的产品使用时，还需要加入提供钥蓝显色反应所需的还原剂，为更好地使 用还原剂，通常需要新鲜配制，因此，大多数情况下由使用者自制，也可以在产品中包括还 原剂。在使用本发明的产品的一个实施方案中，所述还原剂为8%_10%( w/v )抗坏血酸，1%-2% 氯化亚锡，或0. 5%-1%苯酚。
[0145] 实施例
[0146] 在本发明的下述实施例中，牛小肠来源的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase-Calf intestine, AP)购自Takara公司，磷脂酰胆碱特异性磷脂酶购自帝斯 曼（中国）有限公司。
[0147] 实施例1、标准曲线制备
[0148] 取烘干的磷酸氢二钾试剂粉末0. 1431g，溶于去离子水，定容至100mL，配制成 lmg/mL P0广的磷酸氢二钾溶液。
[0149] 从lmg/mL P0广的磷酸氢二钾溶液分别取出0, 2, 5,8,10,15, 20, 50 ii L，加入去离 子水补足至940 ii L，再加入20 ii L的10% (w/v)抗坏血酸溶液，摇匀30s后加入40 ii L的 2. 5% (w/v)钥酸铵溶液(溶剂为30%硫酸溶液)，最后定容至lmL，最终的P0广浓度是0, 2， 5,8,10,15, 20, 50 ii g/mL。每个浓度点平行做3个重复样品。
[0150] 37°C水浴lOmin后，在吸光度700nm下进行吸光值检测，对得到的数据进行线性拟 合，即得到磷钥蓝检测的标准曲线，结果如图1所示。
[0151] 图1结果显示：P0广浓度在0-10 U g/mL的范围内，磷钥蓝检测无机磷的方法在线 性区间内，经拟合获得线性回归方程如下：y=〇. 〇58*x，R2=0. 9989。
[0152] 实施例2、
[0153] 配制 10 ii g/ ii L P043-的磷酸胆碱溶液，分别取 0, 5,10, 20,40, 50,80 ii gP043-的磷 酸胆碱溶液于总体系l〇〇y L中，该反应体系还含有50mM Tris-Cl (pH9. 0)，10mM MgCl2，加 入碱性磷酸酶到10U/mL。
[0154] 37°C水浴30min，加入到840iiL去离子水中，再加入20iiL的10%(w/v)抗坏血酸 溶液，摇匀30秒后加入40 y L的2. 5% (w/v)钥酸铵溶液，最后定容至lmL。
[0155] 37°C水浴10min，在吸光度700nm下进行吸光值检测，将得到的吸光值进行线性回 归后得到对应的p〇43_的质量，将由此得到的产物p〇43_质量数除以起初加入的底物p〇43_质 量数，再除以反应时间，即得到相同量的碱性磷酸酶在不同底物p〇43_质量数时的反应速度。 以p〇43_底物质量数为横坐标，以计算得到的反应速度为纵坐标，获得两者的关系，结果如图 2所示。
[0156] 图2结果显示：30min反应过程中，P0广底物量为50ii g时，反应速度已经不再明 显增加，因此，选择P〇/_底物量为50 y g，作为后续试验的优化条件。
[0157] 实施例3、
[0158] 将碱性磷酸酶进行梯度稀释，分别取0,0. 05,0. 1，0. 2,0. 4,0. 5，1.0，1.5U于 lOOuL体系中，该反应体系还含有50mM Tris-Cl (pH9. 0)，10mM MgCl2,50iig P0广的磷酸 胆碱溶液。
[0159] 37°C水浴30min，按实施例2的方法进行钥蓝法显色及检测，将得到的吸光值进行 线性回归后得到对应的P〇/_的质量，将由此得到的产物P〇/_质量数除以起初加入的50iig 底物P〇/_，再乘以100%，即得到反应产物P〇/_的生成率。以碱性磷酸酶浓度为横坐标，以反 应产物生成率为纵坐标，获得两者的关系，结果如图3所示。
[0160] 图3结果显示：随着CIAP酶量的增加，反应的产物生成率也增加，当达到10U/mL 时，产物率几近平缓，指在P0广底物（50 y g)富余情况下，10U/mL的碱性磷酸酶量已经能够 进行最大的酶切力。因此，以10U/mL的碱性磷酸酶量作为后续试验的优化条件。
[0161] 实施例4
[0162] 本实施例中，以大豆磷脂作为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶（PC-PLC，以下简称 PLC)的反应底物，检测PLC酶活，并以p-NPPC合成底物的方法（Kook-HwaSeo&JongII Rhee.High-levelexpressionofrecombinantphospholipaseCfromBacillus cereusinPichiapastorisanditscharacterization. (2004)Biotechnology Letters26:1475 - 1479)检测PLC酶活，进行对比，具体过程如下：
[0163] 4.1两相反应
[0164] 将大豆磷脂溶于氯仿，进行两相反应。
[0165] 在200iiL的反应体系中，含有终浓度0? 5%(w/v)的大豆磷脂，25mM Tris-Cl (pH7. 5)，5mM CaCl2。再对 PLC 酶进行稀释，稀释比例分别为 1:25,1:50,1:100,1:200， 1:400,1:500,1:800,1:1000,1:1600,1:2000,1:3200,1:4000,1:6400,1:12800,1:25600， 将每个稀释度的酶液20 y L加入到反应体系中。对照组采用沸水浴5min的PLC并进行 1:500稀释。将样品置于37°C摇床上进行15min，30min，60min的反应，摇床转速为150rpm。 再于 12, OOOrpm 离心 2min。
[0166] 吸取离心后的上清80iiL于lOOiiL的磷酸酶反应体系中，该体系还含有50mM Tris-Cl(pH9.0)，10mMMgCl2，AP10U/mL。在 37°C，水浴 30min。
[0167] 反应后，加入840iiL的离子水，再加入20iiL的10% (w/v)的抗坏血酸，及40iiL 的2. 5% (w/v)钥酸铵溶液。37°C显色10min。取显色后的溶液于700nm检测吸光度，其中， 反应301^11的检测结果（？^：酶稀释比例为1 :500-1:6400)如表1所示，并以于沸水浴5111111 灭活的PLC酶作为变性对照。
[0168] 表1磷钥蓝法对梯度稀释后的商品酶PLC的活力检测结果
[0169]

【权利要求】
1. 一种检测磷脂酶C酶活的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 使用磷脂酶C和/或其稀释液酶解复合磷脂； 2) 固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸光 值； 3) 确定磷脂酶C酶活与钥蓝吸光值线性相关的稀释度， 4) 计算所述磷脂酶C酶活。
2. -种筛选表达磷脂酶C的菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 使用磷脂酶C和/或其稀释液酶解复合磷脂； 2) 固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸光 值。
3. -种检测发酵液中磷脂酶C酶活的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 使用发酵液和/或其稀释液酶解复合磷脂； 2) 固液分离，使用分离后溶液与磷酸酶接触后，与钥酸或钥酸盐溶液接触，检测吸光 值； 3) 确定磷脂酶C酶活与钥蓝吸光值线性相关的稀释度； 4) 计算所述磷脂酶C酶活。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于， 所述复合磷脂为：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂中的一种或多种。
5. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合磷脂溶于水、有机溶剂 或水与有机溶剂组成的混合溶剂中，优选的有机溶剂为：三氯甲烷。
6. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离后溶液与磷酸酶接触 为：将分离后溶液与磷酸酶于30_45°C反应30min以上，分离后溶液与磷酸酶的优选反应温 度为35-42°C，更优选为37-40°C，优选的反应时间为0. 5h-2h。
7. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测吸光值为检测 600-810nm的吸光值，优选为650-750nm的吸光值。
8. -种检测磷脂酶C酶活的产品，其特征在于，所述产品包括：复合磷脂或复合磷脂溶 液，磷酸酶储存体系溶液，磷酸酶反应体系溶液，和钥蓝显色反应物溶液；优选的产品为检 测试剂盒。
9. 如权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品还包括磷脂酶C反应体系溶液。
10. 如权利要求1-7所述的方法或权利要求8-9所述的产品，其特征在于，所述磷脂酶 C为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶 C、和/或磷脂酸特异性磷脂酶C。
【文档编号】G01N21/31GK104450865SQ201310430394
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】谢文娴, 许骏, 戴小军, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司