六味地黄制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1,4内酯含量测定方法
【专利摘要】本发明属于药物分析领域，涉及中成药六味地黄系列制剂中两种新发现药理活性成分葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯含量测定方法。本发明利用Na2CO3溶液或60%甲醇溶液提取六味地黄制剂中的葡萄糖二酸（盐）及（或）葡萄糖二酸1，4内酯。采用亲水色谱HPLC-HILIC-UV/ELSD/MS等分离检测技术对这两种化合物进行定量分析。本发明首次建立了六味地黄制剂中葡萄糖二酸盐及其内酯的含量测定方法,为六味地黄系列制剂质量控制提供了新的思路和方法。
【专利说明】六味地黄制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1, 4内酯含量测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物分析领域，特别涉及六味地黄系列制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯的含量测定方法。
【背景技术】
[0002]六味地黄丸由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓等6味中药按一定的比例配伍而成，已有几百年的临床应用历史，是中医药的经典名方。随着临床研究的不断深入，其主治亦由原来的儿科用药拓展到内、外、妇、儿、五官等各科，涉及病症已达40余种，特别对复杂慢性疾病等有较好的疗效。由于该成药疗效确切，几乎没有不良反应报道，且价格低廉等因素，深受大众青睐。目前，在国内约有上百家厂家生产六味地黄产品，主要有汤剂、丸剂、口服液和胶囊剂等；有几十个六味地黄品牌，年销售额超过10亿元，有着良好的社会效益和经济效益。
[0003]应用化学和药理相结合、血清药物化学等方法对六味地黄丸的药理活性成分，入血及体内代谢成分等进行了较为深入的研究，分离制得了一些有生物活性的多糖或小分子代谢产物，取得了可喜的成绩。代谢组学(metabonomics)是继基因组学、转录物组学和蛋白质组学后出现的新的‘组学’技术，主要对生物体在病理生理刺激的条件下，在不同时间、多方位定量检测其代谢物含量的变化，来探讨干预物对机体的调控机制的学科。近年来，代谢组学在发现与疾病诊断、治疗相关的代谢标记物研究、药物药效及毒性评价、作用机制等方面均有着广泛的应用，显示出巨大的潜力。我们在基于HPLC-UV代谢组学特征色谱峰鉴定的基础上，通过对4个特征色谱峰的相对变化关系，推测六味地黄丸可能影响大鼠体内β_葡萄糖醛酸苷酶的活性。经体内外实验证实六味地黄丸具有明显的β_葡萄糖醛酸苷酶抑制作用，从而发现了六味地黄丸的一个作用靶点一β -葡萄糖醛酸苷酶。在此基础上，通过逐步分离六味地黄丸化学成分及体外酶活性测定相结合的方法，发现和鉴定了六味地黄丸中的一种新的药理活性成分一葡萄糖二酸1，4内酯。文献研究(Charles
B.S., Journal of Orthomolecular Medicine Vol.16, N0.2, 2001)表明该物质(包括其前体葡萄糖二酸盐)具有广泛的包括抗癌及雌激素相关的药理作用，之前，该化合物未有在中草药中被发现的报道，因此，未有葡萄糖二酸盐及其内酯在中草药含量测定方法的报道。
[0004]虽然葡萄糖二酸盐被发现存在于水果如苹果和葡萄及少量的蔬菜中，迄今为止，未见利用HPLC-HILIC-UV/ELSD及HPLC-MS/MS技术对他们进行定量测定的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的是对六味地黄系列制剂中的新发现成分葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯应用多种分离检测技术如HPLC-HILIC-UV/ELSD/MS进行定量分析。
[0006]葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯结构式如下:
【权利要求】
1.六味地黄制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯含量测定方法，其特征在于包括: 1)葡萄糖二酸盐和葡萄糖二酸1，4内酯标准溶液的制备:分别精密称取葡萄糖二酸盐和葡萄糖二酸1，4内酯两种对照品40.0mg，定量转移至10.0mL容量瓶中，加水稀释到刻度，精密移取5.0mL至10.0mL容量瓶中，加80%乙腈稀释至刻度，配制成200.0ug/mL溶液，作为对照品母溶液； 2)HPLC-HILIC-UV/ELSD法测定六味地黄丸中总葡萄糖二酸盐的含量: 取六味地黄丸，粉碎，精密称取500mg，加入4.0mL 2_5%Na2C03溶液超声20min，离心，沉淀再用等体积上述溶液提取一次，离心，合并上清液；采用C18 SPE小柱萃取，收集5%甲醇洗脱部分，用高速真空离心，干燥机55°C干燥，干燥物准确加入1.0mL 80%乙腈，10，000转离心IOmin取上清液进行HPLC-HILIC-UV/ELSD分析，以标准曲线法对葡萄糖二酸盐进行定量；HPLC-HILIC-UV法色谱条件:色谱柱为ZIC-HILIC长250_，内径4.6_，颗粒度5um ;以乙腈-5mM磷酸二氢铵为流动相，两者体积比为78:22恒度洗脱；流速0.8mL/min ;检测波长205nm ;进样10ul，柱温30°C ;HPLC-HILIC_ELSD法色谱条件:色谱柱为ZIC-HILICZIC-HILIC长250mm，内径4.6mm,颗粒度5um ;以乙腈A相-0.02%醋酸胺B相为流动相梯度洗脱:0_5min A 相 80%，5_25min A 相 80%_75%，25_30min A 相为 75%_50%，30_35min A 相为50%-80% ;流速0.8mL/min ;进样10ul，漂移管温度60°C气流1.2L/min ； 3)六味地黄丸中葡萄糖二酸1，4内酯含量测定: 取六味地黄丸，粉碎，精密称取500mg，加4.0 mL 60%甲醇溶液，超声20min，5，000转离心IOmin取上清液，残渣继续加4.0mL 60%甲醇溶液，超声20min, 5，，000转离心IOmin取上清液，合并上清液，14，000转离心后适当稀释进样UPLC-MS/MS分析；色谱条件=WatersBEH C18色谱柱,长50mm,内径1.0 mm,粒径1.7um,柱温:40°C;流动相:A相为IOmM甲酸，B相为乙腈；流速0.4mL/min ;质谱条件:电喷雾负离子源ES1-,电压2000V, source tempIOO0C，锥孔电压15V，脱溶剂气温度300°C，锥孔气和脱溶剂气流量分别为50和600L/min ;全扫描模式5(Tl200amu ;二级碰撞能量15V ;分子离子峰191的碎片峰85的强度用于葡萄糖1.4-内酯的定量；以标准曲线法对葡萄糖二酸1，4内酯进行定量； 4)六味地黄丸中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯同时检测: 取六味地黄丸，粉碎，精密称取500mg，加4.0 mL 60%甲醇溶液，超声20min，5，000转离心IOmin取上清液，残渣继续加4.0mL 60%甲醇溶液，超声20min, 5，，000转离心IOmin取上清液，合并上清液，14，000转离心后适当稀释进样HPLC-LILIC-UV分析；HPLC-HILIC_UV法色谱条件:色谱柱为ZIC-HILIC长250mm，内径4.6mm,颗粒度5um ；以乙腈A相_5mM磷酸二氢铵+1.0%磷酸B相为流动相，流动相梯度洗脱程序:0-3min A相83%，3_15min A相83-65%, 15-18min A 相 65%, 18_20min A 相 65-83%，20_30min A 相 83% ;检测波长 205nm ;进样10ul，柱温30°C ;以标准曲线法对葡萄糖二酸盐和葡萄糖二酸1，4内酯进行同时定量。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于所述Na2CO3溶液浓度为2.0%。
【文档编号】G01N30/02GK103698416SQ201310431091
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】谢宝刚, 张宁宁, 姚艳琴 申请人:南昌大学