一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用。本发明公开的一种对植物根组织进行染色的方法，包括如下步骤：将植物根组织置于PI水溶液中，进行染色，即得被染上色的植物根组织。本发明提供的一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术，克服了常规切片过程中高温或低温固定包埋对根尖幼嫩组织产生的损伤，并且操作流程简单，极大的节省了切片制作的时间，利用本发明的方法可以实现快速便捷的制作植物根组织活体组织切片的目的。
【专利说明】一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用。
【背景技术】
[0002]切片技术是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。该种技术不仅用于观察 正常细胞组织的形态结构，也是病理学和植物学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的 形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。组织切片伴 随着显微镜技术和免疫实验等的发展而得到广泛的应用。但是在切片(如石蜡切片、冰冻切 片)制作过程中，材料经常会要经过高温或低温固定包埋，导致材料组织变形或破碎。同时 现有的切片技术，固定包埋的步骤繁琐，时间周期过长。为了快速简单的得到形态完整的组 织切片，活体切片是最简单有效的切片方法。
[0003]研究表明，由于根尖是透明的，并且涵盖了根系生长成熟的不同位点，是研究植物 发育的很好材料。同时根系除了支持植物的地上部分，还是植物吸收水分和养分的主要器 官，根系发育直接关系到作物的产量。由于根系的重要性，根尖的结构引起越来越多的研究 人员的重视。根尖是植物根系中最“柔软脆弱”的组织，高温或低温情况下，根尖细胞极易 变形或破碎。现有的应用于根尖的切片技术还存在很多不完善的地方，主要表现在以下三 方面:一是组织切片流程繁琐，耗费的时间和经费大；二是制作过程中，通常对材料高温或 低温处理，对于“鲜嫩”的新生组织，尤其是根尖组织细胞极易变形或破碎；三是根尖样品长 度相对长(超过5_)，切片很难保持样品的连续性和完整性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用。
[0005]本发明提供的一种对植物根组织进行染色的方法，包括如下步骤:将植物根组织 置于PI水溶液中，进行染色，即得被染上色的植物根组织。
[0006]上述方法中，所述PI水溶液中PI的浓度为l_50mM。
[0007]上述任一所述的方法中，所述染色的时间为l_60min。
[0008]上述任一所述的方法中，所述根组织包括根尖组织和/或根的成熟区。
[0009]上述任一所述的方法中，所述根组织的直径为10-1050 u m,所述直径为所述根组 织根基部方向一端的直径。
[0010]上述任一所述的方法中，所述根组织的长度为2cm。
[0011]上述任一所述的方法中，所述根组织的直径为10-300 iim时，染色条件如下:PI浓 度为l-5mM，染色时间1-1Omin ;所述根组织的直径为300-600 y m时，染色条件如下:PI浓 度为5-15mM，染色时间10-20min ;所述根组织的直径为600-1050 y m时，染色条件如下:PI 浓度为15-50mM，染色时间20-60min，在上述各根段直径范围内，随着根段直径的增大染色 时间和PI浓度都随之增大。
[0012]上述任一所述的方法中，所述植物为玉米。[0013]所述方法中，在将植物根组织置于PI水溶液中之前，包括如下步骤:
[0014](I)取植物的根组织，将根组织的分泌物吸取干净，然后吸干根组织的表面水分；
[0015](2)在环境温度下，将根组织放到0.1M的磷酸钠缓冲液或高纯水中清洗，清洗后吸干根组织的表面水分；
[0016]所述环境温度为10_30°C ；
[0017]所述0.1M的磷酸钠缓冲液的pH为5.8-7.0 ；
[0018]和/ 或，
[0019]上述方法中，在将植物根组织置于PI水溶液中进行染色之后，包括如下步骤:
[0020]( I)把根组织放到高纯水中，摇床漂洗；
[0021]所述漂洗的时间为15_30min ；
[0022]上述步骤也属于本发明的保护范围。
[0023]上述任一所述的方法中，将根组织放到0.1M的磷酸钠缓冲液中清洗的条件是所述根组织取材于非中性环境。
[0024]上述任一所述的方法中，将根组织放到高纯水中清洗的条件是所述根组织取材于中性环境。
[0025]一种对植物根组织进行染色制片观察的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:按照上述任一所述的方法，得到染色后的根组织；再将根组织放到载玻片上，滴上高纯水，盖上盖玻片，制成切片；然后在荧光共聚焦显微镜下对切片进行镜检，在535nm或氙灯或汞灯或氩离子激光器下488通道激发，617nm检测荧光，连续拍摄图片，将图片拼接，即得到根组织完整的染色图片；
[0026]上述方法中，所述根组织包括根尖组织和/或根的成熟区。
[0027]上述任一所述的方法中，所述根组织的直径为10-1050 μ m，所述直径为所述根组
织根基部方向一端的直径。
[0028]上述任一所述的方法中，所述根组织的长度为2cm。
[0029]上述步骤均保持在黑暗环境下完成。
[0030]上述任一所述的方法在观察植物根组织中的应用也属于本发明的保护范围。
[0031 ] 上述应用中，所述根组织包括根尖组织和/或根的成熟区。
[0032]上述任一所述的应用中，所述根组织的直径为10-1050 μ m，所述直径为所述根组织根基部方向一端的直径。
[0033]上述任一所述的应用中，所述根组织的长度为2cm。
[0034]上述任一所述的应用中，所述植物为玉米。
[0035]本发明提供的一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术，克服了常规切片过程中高温或低温固定包埋对根尖幼嫩组织产生的损伤，并且操作流程简单，极大的节省了切片制作的时间，利用本发明的方法可以实现快速便捷的制作植物根组织活体组织切片的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为不同直径的玉米幼苗根尖组织的活体组织切片。
[0037]图2为玉米幼苗根尖组织的活体组织切片。[0038]图3为玉米幼苗根的成熟区活体组织切片。
【具体实施方式】
[0039]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041]PI (碘化丙唳，Propidium 1dide)购自 Sigma 公司，货号为 P4170。
[0042]PI染色剂母液的配制:
[0043]避光条件下，取PI加入高纯水，混匀，使混合液中PI的浓度为10mg/ml，配制成 10mg/ml的PI母液，用离心管分装后，避光保存于-20°C，注意避免反复冻融使用。
[0044]磷酸钠缓冲液的配制:
[0045]IM磷酸氢二钠母液配制:Na2HP04分子量358，购自国药，称取358g溶解在高纯水 中，定容至1L，即配制成IM的磷酸氢二钠溶液。
[0046]IM磷酸二氢钠母液配制=NaH2PO4分子量156，购自国药，称取156g溶解在高纯水 中，定容至1L，即配制成IM的磷酸二氢钠溶液。
[0047]pH=5.8的0.1M磷酸钠缓冲液配制:将IM磷酸氢二钠母液和IM磷酸二氢钠母液 以体积比7.9ml:92.1ml混合。
[0048]pH=6.0的0.1M磷酸钠缓冲液配制:将IM磷酸氢二钠母液和IM磷酸二氢钠母液 以体积比12.0ml:88.0ml混合。
[0049]pH=7.0的0.1M磷酸钠缓冲液配制:将IM磷酸氢二钠母液和IM磷酸二氢钠母液 以体积比57.1ml:42.3ml混合。
[0050](注:配制方法源自《分子克隆》，pH值计算根据Henderson-Hasselbalch方程式: pH=pK’ +Log{质子受体 / 质子供体}，pK，=6.86 (25 °C )。)
[0051]实施例1、植物根组织活体组织切片的制作及镜检
[0052]一、切片的制作
[0053](一)取一定体积的PI母液加入到2ml高纯水中，配制成一定浓度的PI染色剂，均 匀混合。
[0054](二)用手术刀片切取植物自根末梢开始到根基部方向2cm的根段，用Iml的移液 枪将根段的分泌物吸取干净，然后将用吸水纸吸干。
[0055](三)在环境温度10_30°C下，将根段放到0.1M的磷酸钠缓冲液中或高纯水中清洗 3遍，每次清洗后都用吸水纸吸干。
[0056](四)然后将根段放入一定浓度的PI染色剂中，在lOOr/min的转速的摇床上染色。
[0057](五)把根段放到高纯水中，在100r/min转速的摇床上漂洗15_30min。
[0058](六)将根段放到载玻片上，滴2-3滴高纯水，盖上盖玻片。
[0059]二、切片镜检
[0060]玉米根尖组织容易破碎，自发荧光为蓝色，PI染料能结合活体细胞壁胶质发射出 红色荧光。
[0061]在突光共聚焦显微镜下对切片进行镜检,最大激发光为535nm,最大发射光为 617nm，可以观测到PI发射出的红色光(PI也可以在氙灯或汞灯下激发，也可以在氩离子激 光器下488通道激发)。[0062]镜检过程:首先在明场10倍镜下迅速找到清晰的视野，然后换到荧光界面，在1024的像素下拍摄图片，每张图片大约能拍摄750 μ m的根段，在每个图片上设定标记，然后拍摄下一张图片，如此连续拍摄。
[0063]注意:在染色和镜检过程要保持在黑暗环境下完成，在转移根段的过程中要保持根段表面不被移液器，吸水纸，镊子和其它物品碰伤，因为轻微碰伤后根段在镜检过程中会出现黑色。
[0064]实施例2、不同直径玉米幼苗根段活体切片的制作及镜检
[0065]一、用手术刀片切取不同直径的玉米幼苗根段(自根末稍开始到根基部方向长度为2cm，直径指根段的根基部方向一端的直径)，用Iml的移液器将根段的分泌物吸取干净，然后用吸水纸吸干。
[0066]二、在环境温度10_30°C下，将植物材料放到高纯水中清洗3遍，每次清洗后都用吸收纸吸干。
[0067]三、然后将各直径的根段分别放入不同浓度的PI染色剂中，在lOOr/min的转速的摇床上染色，染色时间为l_60min。
[0068]四、把染色后的各根段放到高纯水中，在lOOr/min的转速的摇床上漂洗15_30min。
[0069]五、将各根段放到载玻片上，滴2-3滴高纯水，盖上盖玻片。
[0070]六、按照实施例1的切片镜检方法观测根段
[0071]根据镜检和观察到的切片结果。
[0072]各组根段的染色条件如表1所示。染色浓度和染色时间根据根段的直径变化而增加。
[0073]表1不同直径的根段染色条件
[0074]
【权利要求】
1.一种对植物根组织进行染色的方法，包括如下步骤:将植物根组织置于PI水溶液中，进行染色，即得被染上色的植物根组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述PI水溶液中PI的浓度为l_50mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述染色的时间为l-60min。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述根组织包括根尖组织和/或根的成熟区。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述根组织的直径为10-1050μ m，所述直径为所述根组织的根基部方向一端的直径； 所述根组织的直径为10-300μπι时，染色条件如下:ΡΙ浓度为l_5mM，染色时间1-1Omin ;所述根组织的直径为300-600 μ m时，染色条件如下:PI浓度为5_15mM，染色时间10-20min ;所述根组织的直径为600-1050 μ m时，染色条件如下:PI浓度为15_50mM，染色时间 20-60min。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述植物为玉米。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在将植物根组织置于PI水溶液中之前，包括如下步骤: (1)取植物的根组织，将根组织的分泌物吸取干净，然后吸干根组织的表面水分； (2)在环境温度下，将根组织放到0.1M的磷酸钠缓冲液或高纯水中清洗，清洗后吸干根组织的表面水分； 所述环境温度为10-30°C ； 所述0.1M的磷酸钠缓冲液的pH为5.8-7.0 ； 和/或， 所述方法中，在将植物根组织置于PI水溶液中进行染色之后，包括如下步骤: (I)把根组织放到高纯水中，摇床漂洗； 所述漂洗的时间为15-30min。
8.—种对植物根组织进行染色制片观察的方法，包括如下步骤:按照权利要求1-7任一所述的方法，得到染色后的根组织；再将根组织放到载玻片上，滴上高纯水，盖上盖玻片，制成切片；然后在荧光共聚焦显微镜下对切片进行镜检，在535nm或氙灯或汞灯或氩离子激光器下488通道激发，617nm检测荧光，连续拍摄图片，将图片拼接，即得到根组织完整的染色图片； 所述根组织包括根尖组织和/或根的成熟区。
9.权利要求1-8任一所述的方法在观察植物根组织中的应用； 所述根组织包括根尖组织和/或根的成熟区。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述植物为玉米。
【文档编号】G01N21/64GK103528872SQ201310478787
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】米国华, 高坤 申请人:中国农业大学