一种二氧化碳测定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种二氧化碳测定试剂盒，主要成分包括：缓冲液：50-200mM；稳定剂：10％-50％；表面活性剂：0.1-5％；防腐剂：0.1-5g／L；反应加速剂：1-20mM；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)：2-10mM；磷酸烯醇式丙酮酸：5-50g／L；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶：50-500U／L；苹果酸脱氢酶：1-3KU／L；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统：(1)葡萄糖类底物：2-20g／L，(2)相应葡萄糖脱氢酶：100-2000U／L，(3)3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸：1-5mM；本发明使用方便，操作简单；参与偶联反应的成分都是外加的，不会引入内外源物质的污染；再生循环系统速率要小于主反应的速率，不干扰主反应；稳定性好，可以长时间使用。
【专利说明】一种二氧化碳测定试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，具体的说是涉及一种医学、食品、环境监测领域常用的二氧化碳测定试剂盒。
【背景技术】
[0002]血液内二氧化碳(CO2)的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用，血液pH的恒定是维持生命活动必不可少的条件。在代谢性酸中毒和呼吸性碱中毒时，人血清(浆)中二氧化碳浓度减少；而在代谢性碱中毒和呼吸性酸中毒时，人血清(浆)中二氧化碳浓度增加。所以血清(浆)中二氧化碳的测定项目在临床诊疗观察中有着重要的作用。
[0003]总二氧化碳和碳酸氢根的测定方法可分为直接测定和间接推算两类。直接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法等。间接推算是运用血气分析仪测得的PH和PCO2，根据H-H方程的变换形式:
[0004]HCO3 (m mo I / L) =0.03 XPCO2 (mm Hg) X antilog (PH-p ka)或
[0005]HCCV (m mo I / L) =0.225 X PCO2 (k Pa) X anti log (PH-p Ka)
[0006]计算获得。
[0007]式中:PH为37°C时测得值，p ka在37°C为6.1。
[0008]目前，以间接推算法应用较为普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分析结果一起报告，准确性基本可以符合临床要求。
[0009]直接测定法以滴定法应用最为广泛，但由于受外界因素影响较大，测定误差较大。
[0010]酶法测定适合自动化分析仪，结果可靠，但试剂在存放过程中容易受到空气中的CO2的影响，稳定性较差。
[0011]检索中国专利发现，申请号为200810124241.1、申请日为2008.06.30的发明专利申请公开了一种酶法检测二氧化碳浓度的试剂盒，该发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、高铁细胞色素bl、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶及稳定剂。通过将样品与试剂按一定的比例混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测340波长处吸光度下降的速度，从而测算出CO2的浓度大小。
[0012]同时，申请号为200810124240.7、申请日为2008.06.30的发明专利也申请公开了
一种酶法检测二氧化碳浓度的试剂盒，该发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂。通过将样品与试剂按一定的比例混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测340波长处吸光度下降的速度，从而测算出CO2的浓度大小。
[0013]近年来酶法测定二氧化碳的技术进展迅速，适用于自动生化分析仪，检测速度快、准确度高，但试剂盒在开口存放时因为容易与空气中的CO2发生反应，造成底物浓度下降、试剂开口稳定性差的现象，目前国内关于解决二氧化碳测定试剂开口稳定性差的研究也十分缺乏。
【发明内容】
[0014]针对现有技术存在的缺点与不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种二氧化碳测定试剂盒，该试剂盒利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术,计算3-乙酰卩比唳腺嘌呤二核苷酸(还原型)，(APADH)在405nm处吸光度下降程度，测算出血液中二氧化碳的浓度大小。同时在反应体系中偶联了一个3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统，保证了试剂在开口存放中的稳定性和测值准确性。
[0015]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是，提供一种二氧化碳测定试剂盒，主要成分包括:缓冲液:50-200mM ;稳定剂:10% -50% ;表面活性剂:0.1% -5% ;防腐剂:0.l-5g / L ;反应加速剂:l-20mM ；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型):2_10mM ；磷酸烯醇式丙酮酸:5-50g / L ;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:50-500U / L ;苹果酸脱氢酶:1-3KU / L ；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统:(I)葡萄糖类底物:2_20g / L，(2)相应葡萄糖脱氢酶:100-2000U / L，(3) 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸:l_5mM0
[0016]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，缓冲液为pH值在8.0-8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、CAPSO缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0017]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，稳定剂为甘油、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、硫酸铵、乙二醇、丙二醇中的一种或几种。
[0018]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、Triton X系列中的一种或几种。
[0019]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，防腐剂为叠氮钠或PC-300。
[0020]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，反应加速剂为硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾中的一种或几种。
[0021]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统为如下组合中的一种:
[0022](I)葡萄糖-葡萄糖脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)系统、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、甘油-甘油脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)系统、丙酮酸-乳酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)系统；
[0023](2)葡萄糖-葡萄糖脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系统、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)、甘油-甘油脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系统、丙酮酸-乳酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系统。
[0024]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，它为单试剂，具体如下:
[0025]单试剂:包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、反应加速剂、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统。[0026]上述的一种二氧化碳测定试剂盒，它为双试剂或三试剂，具体如下:
[0027]双试剂:
[0028]试剂1:缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、反应加速剂、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统。
[0029]试剂2:缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶。
[0030]表面活性剂、防腐剂、反应加速剂在试剂I或试剂2的位置不限。
[0031]三试剂:
[0032]试剂1:缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、反应加速剂、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统。
[0033]试剂2:缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
[0034]试剂3:缓冲液、稳定剂、苹果酸脱氢酶。
[0035]表面活性剂、防腐剂、反应加速剂在试剂1、试剂2或试剂3中的位置不限。
[0036]试剂盒配制完成后需要4°C放置过夜后使用。
[0037]本发明 的二氧化碳测定试剂盒测定原理如下:
[0038]二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根；
[0039]草酰乙酸+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)苹果酸脱氢酶苹果酸+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)；
[0040]葡萄糖类底物+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)相应葡萄糖脱氧酶相应醒+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)；
[0041]本发明的二氧化碳测定试剂盒应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase ；EC4.1.1.31)酶(偶)联苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase ；EC1.1.1.37)酶促反应速率比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解二氧化碳反应产生草酰乙酸，再通过(偶)联合苹果酸脱氢酶的作用，将还原型的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(在405nm处有吸收峰)氧化成氧化型(在405nm处无吸收峰)。最终以测定3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)在405nm处吸光度下降程度测算出血液中二氧化碳的浓度大小。同时葡萄糖类底物与相应葡萄糖脱氢酶、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸共同组成了 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统，通过酶促反应使3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)得到循环再生，保证了试剂盒不会因为吸收外界的二氧化碳而降低了反应底物浓度导致稳定性下降。
[0042]本发明的二氧化碳测定试剂盒的有益效果主要表现在:
[0043](I)本发明所配制的试剂可以为单试剂，使用方便，操作简单。
[0044](2)本发明参与偶联反应的成分都是外加的，不会引入内外源物质的污染。
[0045](3)本发明的再生循环系统速率要小于主反应的速率，不干扰主反应。
[0046](4)本发明所配制的单试剂试剂盒，稳定性好，可以长时间使用，试验证实37°C闭口放置2周、4°C开口放置30天、4°C闭口放置I年后试剂空白吸光度A≤0.800A。
【具体实施方式】[0047]下面结合实施例子对本发明做进一步的说明。
[0048]实施例1
[0049]本实施例的二氧化碳测定试剂盒为单试剂，包括:
[0050]三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:50mM，
[0051]甘油:10%，
[0052]Triton Χ-100:0.1%,
[0053]叠氮钠:0.1g / L，
[0054]硫酸镁:ImM,
[0055]3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型):2mM，
[0056]磷酸烯醇式丙酮酸:5g / L，
[0057]磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:50U / L，
[0058]苹果酸脱氢酶:IKU / L，
[0059]3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统:
[0060](I)葡萄糖:2g / L，
[0061](2)葡萄糖脱氢酶:100U / L，
[0062](3) 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型):lmM。
[0063]试剂全部溶解配好后4°C放置过夜，分装入瓶。
[0064]将被测二氧化碳样品和试剂混合，使之与试剂的体积比例为1:100，混合均匀，37°C反应时间I分钟，在波长405nm处检测2分钟内吸光度的下降速率，从而测算出二氧化碳浓度的大小。
[0065]取德国罗氏诊断有限公司生产的二氧化碳检测试剂盒(比色法)(货号:03289885190 ;批次:670816-01)作为对照样本，具体试验数据如表I所述示:
[0066]表I对照样本与实施例1性能指标对照表
[0067]
【权利要求】
1.一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于，主要成分包括: 缓冲液:50-200mM: 稳定剂:10% -50% ； 表面活性剂:0.1% -5% ;
防腐剂:0.l-5g / L ； 反应加速剂:l-20mM; 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型):2-10mM ； 磷酸烯醇式丙酮酸:5-50g / L ； 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:50-500U / L ； 苹果酸脱氢酶:1-3KU / L； 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统: (1)葡萄糖类底物:2_20g/ L， (2)相应葡萄糖脱氢酶:100-2000U/ L， (3)3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸:1-5禮。`
2.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:所述的缓冲液为PH值在8.0-8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、CAPSO缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种高稳定性二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:所述的稳定剂为甘油、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白、硫酸铵、乙二醇、丙二醇中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、Triton X系列中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:所述的防腐剂为叠氮钠或PC-300。
6.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:所述的反应加速剂为硫Ife续、硫Ife纳、硫Ife钟中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:所述的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统为如下组合中的一种: (1)葡萄糖-葡萄糖脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)系统、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、甘油-甘油脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)系统、丙酮酸-乳酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)系统； (2)葡萄糖-葡萄糖脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系统、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)、甘油-甘油脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系统、丙酮酸-乳酸脱氢酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系统。
8.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:它为单试剂，具体如下: 单试剂:包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、反应加速剂、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统。
9.根据权利要求1所述的一种二氧化碳测定试剂盒，其特征在于:它为双试剂或三试剂，具体如下: 双试剂: 试剂1:缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、反应加速剂、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统。试剂2:缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶。 表面活性剂、防腐剂、反应加速剂在试剂I或试剂2的位置不限。 三试剂: 试剂1:缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、反应加速剂、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(还原型)循环再生系统。试剂2:缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 试剂3:缓冲液、稳定剂、苹 果酸脱氢酶。 表面活性剂、防腐剂、反应加速剂在试剂1、试剂2或试剂3中的位置不限。
【文档编号】G01N33/52GK103558370SQ201310496163
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】周玭, 温云飞 申请人:青岛金洋生物技术有限公司