一种血清中氨含量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定血清中氨含量的方法。即公开了一种测定血氨含量的双试剂，所述试剂37℃和42℃加速破坏试验表明，试剂稳定性良好，解决了冻干剂需要冻干和复溶的繁琐问题，可现配现用，2-8℃可稳定20个月；临床相关性试验表明，本方法测值稳定，准确度高，适用于手动、半自动、自动检测系统，易于推广使用。
【专利说明】一种血清中氨含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测血清中氨含量的方法，属于体外诊断领域。
【背景技术】
[0002]正常人体内游离血氨含量极低，正常值是(10-52) μ mol/L。血氨按其来源可分为内源性氨和外源性氨，高血氨含量有神经毒性，血氨的测定对于肝硬化门脉高压、肝昏迷、Reye's综合症及儿科的一些先天性代谢紊乱等病的诊断、观察和预后诊断有重要意义。
[0003]谷氨酸脱氢酶法较其他方法操作简便，适用于自动生化分析仪，其反应原理是:氨在谷氨酸脱氢酶的作用下与a -KG和NADH反应，生成L-谷氨酸和NAD+，通过监测NADH的下降速率，与校准液相比，计算出血清中氨的含量。
[0004]应用于临床诊断的AMM试剂盒多为谷氨酸脱氢酶法，存在单、双、三试剂等多种液体剂型及干片制剂。试剂盒的主要难点是试剂的稳定性，尤其是NADH的稳定性问题。NADH作为常用的还原性辅酶，在340nm有最强吸收峰，在体外诊断试剂中常被作为色原。但它在水溶液中不稳定，容易发生氧化还原反应，从而使试剂效期变短，难于在医院推广使用。血氨干片制剂很好地解决了液体剂型稳定性差的缺点，但试剂制备时需要冻干过程，应用时需要复溶过程，较为繁琐，也增加了试剂成本。
【发明内容】
[0005]本发明利用本领域中公认的测定血氨的原理，确定了一种测定血氨含量的方法，采用两种试剂与血清样本混合反应，通过确定各试剂中组成，并得到保质期时间较长，测值稳定的试剂组成。
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]一种血清中氨含量的测定方法，包括如下步骤:
[0008]①配制试剂a:试剂a包括缓冲液、α _酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和稳定剂；
[0009]②配制试剂b:试剂b包括缓冲液、谷氨酸脱氢酶和稳定剂；
[0010]③将试剂a、试剂b和血清样本按120?240:40:10?20比例混合反应，比色法测定血清样本中血氨含量，或在自动生化仪上检测血氨含量；
[0011]所述试剂a中各组分的浓度为:缓冲液50_250mM、α -酮戊二酸2_50mM、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.45mM、稳定剂占单体试剂总体积的0.05-3% ；
[0012]所述试剂b中各组分的浓度为:缓冲液50-200禮、谷氨酸脱氢酶500-40000U。
[0013]本发明所述的测定方法，步骤③中所述试剂a、试剂b和血清样本按160?200:40:15?20比例混合。
[0014]本发明所述的测定方法，步骤③中所述试剂a、试剂b和血清样本按200:40:20比例混合。
[0015]本发明所述的测定方法，所述试剂a和试剂b中的缓冲液选自3_(环己胺)-2_羟基-1-丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、吗啉代丙烷磺酸缓冲液、3-(环己胺基)丙磺酸缓冲液、3-(环己氨基)-1_丙磺酸或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸缓冲液中的至少一种或多种的混合物。
[0016]本发明所述的测定方法，所述试剂a中各组分的浓度为:缓冲液50_150mM、α -酮戊二酸10-30mM、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.25mM、稳定剂占单体试剂总体积的0.05-1%。
[0017]本发明所述的测定方法，所述缓冲液的pH为7.0-12.0。
[0018]本发明所述的测定方法，所述缓冲液的pH为为8.0-10.0。
[0019]本发明所述的测定方法，所述稳定剂选自牛血清白蛋白、EDTA钠/钾盐、乙二醇、叠氮钠或TritonX-1OO中的至少一种或多种。
[0020]本发明所述的测定方法，所述试剂a的组成为:100mM3-(环己氨基)_1_丙磺酸，pH=9.5，α -酮戊二酸15mM，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.20mM, EDTA钠盐0.05%，叠氮钠0.1% ;所述试剂b的组成为50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH=8.0，谷氨酸脱氢酶20000U，BSA0.05%,叠氮钠 0.1%。
[0021]本发明提供了一种应用所述血氨检测液体双试剂检测血清中血氨含量的方法，包括:将待检测样品加入到血氨检测液体单试剂进行反应；将反应物置于紫外/可见分光光度计或半、全自动生化分析仪上，检测340nm波长下吸光度的下降，计算血氨含量。
[0022]其中待检测样品与血氨检测液体单试剂比例为120~240:40:10~20 ;所述的反应时间优选为3-10分钟，可在25-40°C范围内检测，最优温度为37°C。
[0023]37°C和42°C加速 破坏试验和临床相关性试验表明，本发明所制备的血氨液体双试剂稳定性良好，解决了冻干剂需要冻干和复溶的繁琐问题，可现配现用，(2-8) °C可稳定18个月，测值准确，适用于手动、半自动、自动检测系统，易于在各大医院推广使用。
【具体实施方式】
[0024]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0025]实施例1
[0026]配制试剂并检测:按表1中各组分浓度配制试剂a和试剂b，将试剂a、试剂b和血清样本按120~240:40:10~20比例混合反应，于生化仪上检测血清样本中血氨含量，或紫外分光光度仪上检测。
[0027]表1
[0028]
【权利要求】
1.一种血清中氨含量的测定方法，其特征在于包括如下步骤: ①配制试剂a:试剂a包括缓冲液、α -酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和稳定剂； ②配制试剂b:试剂b包括缓冲液、谷氨酸脱氢酶和稳定剂； ③将试剂a、试剂b和血清样本按120?240:40:10?20比例混合反应，比色法测定血清样本中血氨含量，或在自动生化仪上检测血氨含量； 所述试剂a中各组分的浓度为:缓冲液50-250mM、α -酮戊二酸2_50mM、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.45mM、稳定剂占单体试剂总体积的0.05-3% ； 所述试剂b中各组分的浓度为:缓冲液50-200mM、谷氨酸脱氢酶500-40000U。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤③中所述试剂a、试剂b和血清样本按160?200:40:15?20比例混合。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤③中所述试剂a、试剂b和血清样本按200:40:20比例混合。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述试剂a和试剂b中的缓冲液选自3_(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、吗啉代丙烷磺酸缓冲液、3-(环己胺基)丙磺酸缓冲液、3-(环己氨基)-1-丙磺酸或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸缓冲液中的至少一种或多种的混合物。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述试剂a中各组分的浓度为:缓冲液50-150mM、α -酮戊二酸10_30mM、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.25mM、稳定剂占单体试剂总体积的0.05-1%。
6.根据权利要求1-5任一权利要求所述的测定方法，其特征在于:所述缓冲液的pH为7.0-12.0。
7.根据权利要求1-5任一权利要求所述的测定方法，其特征在于:所述缓冲液的pH为为 8.0-10.0。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于:所述稳定剂选自牛血清白蛋白、EDTA钠/钾盐、乙二醇、叠氮钠或TritonX-1OO中的至少一种或多种。
9.根据权利要求1?8任一权利要求所述的测定方法，其特征在于所述试剂a的组成为:100mM3-(环己氨基)-1-丙磺酸，pH=9.5，α -酮戊二酸15mM，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.20mM, EDTA 钠盐 0.05%,叠氮钠 0.1% ； 所述试剂b的组成为50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH=8.0，谷氨酸脱氢酶20000U，BSA0.05%,叠氮钠 0.1%。
【文档编号】G01N21/33GK103543117SQ201310500886
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】秦宏佳 申请人:大连市沙河口区中小微企业服务中心