Ccne1基因在检测上尿路上皮癌中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明CCNE1基因在检测上尿路上皮癌中的应用，属于基因工程【技术领域】。所述的应用是指通过RT-PCR反应对尿路上皮组织样本中的CCNE1基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的CCNE1基因的mRNA表达量进行对比，当样本中CCNE1基因的mRNA表达量高于正常CCNE1基因的mRNA表达量时，该样本为上尿路上皮癌样本；也可以通过对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，当样本尿路上皮组织的染色指数≥5时，该样本尿路上皮组织中CCNE1高表达，该样本为上尿路上皮癌样本。本发明具有为UTUC患者的诊断提供了一种新的诊断性指标，并且CCNE1基因能够预测T2和T3患者生存差异的优点。
【专利说明】CCNE1基因在检测上尿路上皮癌中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
【背景技术】
[0002]成年人肾癌包括起源于肾实质和肾盂的恶性肿瘤。肾癌中最主要的类型是肾实质癌而肾盂癌相对罕见(大约占10%)。几乎所有的肾盂癌都是上尿路上皮癌(UTUC),UTUC大约占病理诊断肾癌的8.4%，大约占所有尿路上皮癌的5%。UTUC是一种起源于输尿管口到肾盏的移行(尿路)上皮细胞的恶性肿瘤。人们对UTUC的认识不足，并且这些认识通常基于膀胱移行细胞癌，这是因为人们认为他们有共同的危险因素，如吸烟和使用含有乙酰对氨基苯酹类镇痛药。我们从Lughezzani等人的文献了解到:在过去的几年中，一些与UTUC进程相关的分子标志物如细胞增殖(EFGR)、新生血管形成(如HIF-1 α )、细胞粘附(如钙粘附素和链蛋白)、细胞凋亡(如Bcl-2)和细胞周期控制(Ρ53)等推动着UTUC的临床实践向前发展。但是多变量分析证明P53并不能作为独立的预后指标。虽然肿瘤的分期以及肿瘤的病理学分级仍被认为是最可信的临床结果预测指标。然而，其它一些肿瘤研究却表明:用分子标志物判断生存预后要比病理学分级更好。为了证明在预后生存方面分子标志物优于病理学分级，在这项研究中，我们并不是简单的选择性的测试几个基因序列，而是以全基因组mRNA表达谱为基础尽可能找出与预后有关的所有基因。
[0003]人们已经证明:在确定肿瘤特异性标志物、亚型和预测治疗结果方面，利用微阵列或第二代测序技术进行大规模的mRNA表达谱绘测的方法是有效的。这种方法使得同时对成千上万的基因乃至整个基因组扫描的系列研究成为可能，因此这种方法可以促进对肿瘤的全面理解并有利于高敏感性和高特异性的生物标志物的发现。与微阵列技术相比，基于序列的分析不产生mRNA杂交序列并且避免重复性，它可以在无限的动态范围中测量基因表达水平。
【发明内容】
[0004]本发明通过基于序列的分析，我们揭示了在UTUC患者中CCNEl的表达上调，并确定CCNEl的蛋白表达可以作为UTUC患者重要的并且独立的预后评价指标。虽然病理TNM分期可以预测Tl和T2或Tl和T3生存差异，但是分子标记却能够预测T2和T3患者生存差异，这个不能通过!TM分期来预测。本发明的结果不仅描述了 UTUC的分子特性，并且提供了 UTUC的潜在的预后标志物；更重要的是，为功能与临床验证提供了一个丰富的案例。
[0005]本发明的目的在于公开了 CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
[0008]上述技术方案所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其中，CCNEI基因在上尿路上皮癌中表达上调。[0009]上述技术方案所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，包括下述步骤:
[0010](1)、取样本尿路上皮组织，提取尿路上皮组织的RNA ；
[0011](2)、对样本的尿路上皮组织RNA进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA ；
[0012](3)、以步骤⑵获得的尿路上皮组织cDNA为模版，以引物对P为引物，进行RT-PCR反应，将样本尿路上皮组织中的CCNEl基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的CCNEl基因的mRNA表达量进行对比，当样本中CCNEl基因的mRNA表达量高于正常CCNEl基因的mRNA表达量时，该样本为上尿路上皮癌样本；其中引物对P为:
[0013]CCNEI 上游引物:5 ’ -TGGATGGCATCAAACAGGGCAAAG-3，，
[0014]CCNEI 下游引物:5 ’ -GCACGCACTGGTGTCTGGAGGT-3，。
[0015]上述技术方案所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其中，所述RT-PCR 的条件为:50°C 2 分钟、95°C 2 分钟，I 个循环；95°C 15 秒、55°C 30 秒、72°C 40 秒，40个循环。
[0016]上述技术方案所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其中，所述的应用是通过对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，当样本尿路上皮组织的染色指数> 5，该样本尿路上皮组织中CCNEl高表达，该样本为上尿路上皮癌样本。
[0017]本发明具有以下有益效果:
[0018]1、本发明通过实验揭示了 CCNEl基因在上尿路上皮癌中高表达，为UTUC患者的诊断提供了一种新的诊断性指标。
[0019]2、本发明的CCNEl基因能够预测T2和T3患者生存差异，而--Μ分期却不能用来预测T2和T3生存差异。
【专利附图】
【附图说明】:
[0020]1、图1为CCNEl的mRNA的表达在UTUC患者的肿瘤组织和正常对照组织之间的对比结果图。
[0021]2、图2为运用免疫组化染色显示CCNEl在肿瘤组织中和正常组织中的不同显色效果图。
[0022]3、图3为CCNEl的高表达与病人的预后的关系，其中Low为CCNEl低表达，High为CCNEl高表达。
[0023]4、图4为CCNEl作为预后指标分子标记物与了匪分期的对比试验结果图，其中Low为CCNEl低表达，High为CCNEl高表达。
【具体实施方式】:
[0024]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用作进一步的说明。
[0025]一、样本与试剂:
[0026](一)、样本:
[0027]1、所有患者在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由中山肿瘤中心进行病理诊断和临床诊断后确诊的；3、年龄大于18岁；4、肿瘤组织是术中通过电切或全切获得的；5、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNAlater中，并在4°C冷藏过夜，其后_80°C低温储存；6、经HE染色，肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织；7、正常肾组织在病理学检查中显示正常的肾小管和肾小球且无肿瘤细胞污染。
[0028]手术切除的新鲜组织立即沉浸在RNAlater (Qiagen公司；德国)中，并4°C冷藏过夜以便溶液深入浸润组织，其后_80°C低温储存。另一方面，苏木精-伊红(HE)染色检测肿瘤细胞的百分比，筛选出肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织作进一步的研究。正常肾组织的病理学检查显示正常的肾小管和肾小球且无肿瘤细胞污染。根据2002美国癌症联合委员会(AJCC)分期系统，对每名患者的肿瘤进行分期或重新分期。
[0029](二)、试剂:
[0030](I) ,RNAlater ；
[0031](2)、DNase I (RNase Free,美国，Promega)；
[0032](3)、Trizol 试剂溶液(Invitrogen ；Carlsbad,美国)；
[0033](4) > oligo (dT) 18beads (Invitrogen,美国)；
[0034](5)、逆转录酶(M-MLV) (Fermentas ;美国);
[0035](6)、RT-PCR仪(ABI7000)美国应用生物系统公司。
[0036]本发明中涉及到上述试剂的使用均按照试剂使用说明中的步骤进行操作。
[0037]试骀例1:RT-PCR检测CCNEl基因的mRNA在上尿路上皮癌中表达上调:
[0038](一 )、样本信息:`
[0039]10例患者的信息如表1所示:
[0040]表1样本信息
[0041]
【权利要求】
1.CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
2.根据权利要求1所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其特征在于:CCNEl基因在上尿路上皮癌中表达上调。
3.根据权利要求1或2所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，包括下述步骤: (1)、取样本尿路上皮组织，提取尿路上皮组织的RNA； (2)、对样本的尿路上皮组织RNA进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA； (3)、以步骤(2)获得的尿路上皮组织cDNA为模版，以引物对P为引物，进行RT-PCR反应，将样本尿路上皮组织中的CCNEl基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的CCNEl基因的mRNA表达量进行对比，当样本中CCNEl基因的mRNA表达量高于正常CCNEl基因的mRNA表达量时,该样本为上尿路上皮癌样本；其中引物对P为: CCNEl 上游引物:5’ - TGGATGGCATCAAACAGGGCAAAG -3’， CCNEl 下游引物:5’ - GCACGCACTGGTGTCTGGAGGT -3’。
4.根据权利要求3所述的CCNEl基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其特征在于，所述RT-PCR的条件为:50°C 2分钟、95°C 2分钟，I个循环；95°C 15秒、55°C 30秒、72°C 40秒,40个循环。
5.根据权利要求1或2所述的CCNEl基因在检测肾透明细胞癌中的应用，其特征在于:所述的应用是通过对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，当样本尿路上皮组织的染色指数> 5，该样本尿路上皮组织中CCNEl高表达，该样本为上尿路上皮癌样本。
【文档编号】G01N33/574GK103558382SQ201310516287
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】蔡志明, 吴松, 何颖颖, 谢畅, 毛有胜 申请人:深圳市第二人民医院