右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法

右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法
【专利摘要】本发明涉及“右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法”，包括固相萃取及液相检测两个步骤，在液相分析前对注射液进行了预处理，采用Waters?Oasis?HLB固相萃取小柱对糠醛进行富集吸附，并将右旋糖酐40去除，收集到液相样品；同时液相检测中采用梯度洗脱的方式，流动相A：甲醇，流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液，用磷酸调节pH为3.0，延长了色谱柱的使用寿命。本发明方法灵敏度高，能同时检测出右旋糖酐40注射液中的5-羟甲基糠醛和2-糠醛，注射液中2-糠醛的最低检出浓度为0.00015μg/mL；重复性好，一批6份注射液测定结果，其含量平均值为0.0889μg/mL，RSD为0.6%；精密度RSD为0.4%，加样回收率平均为93.1%，RSD为0.9%。
【专利说明】右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药物微量杂质成分的HPLC的检测方法，特别是涉及右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法。
【背景技术】
[0002]右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌L.M-1226号菌(Leuconostocmesenteroides)发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，经处理精制而得，其分子式为(C6H1(l05)n。右旋糖酐按照分子量不同分为闻分子(10?20万)、中分子量(6万?8万)、低分子量(2?4万)和小分子量(I?2万)右旋糖酐。右旋糖酐40的重均分子量(Mw)为32000?42000，属于低分子右旋糖酐。国内于1952年研制成功，1957年开始应用于临床。右旋糖酐40主要用于增加血浆容量，维持血压，以抗休克为主。广泛应用于各种休克、血栓性疾病、肢体再植和血管外科手术等。右旋糖酐能提高血浆胶体渗透压，吸收血管外的水分而补充血容量，维持血压；使已经聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液黏滞性，从而改善微循环，防止休克后期的血管内凝血；抑制凝血因子II的激活，使凝血因子I和VDI活性降低以及其抗血小板作用均可阻止血栓形成。此外，还具渗透性利尿作用(黄勋，陈槐卿，王玲等.右旋糖酐40，70对红细胞与内皮细胞粘附的影响[J].生物医学工程学杂志，1998，15(3):240 ?242.)。
[0003]可能是由于蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226号菌发酵后生成的右旋糖酐分子量较大，大分子右旋糖酐作为血浆代用品安全性较差，须用稀酸水解以获得较低分子量的药用右旋糖酐，但是水解的同时，也会使部分右旋糖酐分解成低聚糖，经异麦芽三糖、异麦芽二糖，生成葡萄糖(李艳，陈学武，牟德华.右旋糖酐的生产及应用.山西食品工业[J]，1998.3:36-37.)。己糖(葡萄糖、果糖等单糖)与氨基酸在高温、酸性条件或微生物的作用下脱水发生美拉德(Maillard)反应生成5-羟甲基糠醛及糠醛(杨朝霞，李梅，董建军等.高效液相色谱同时测定啤酒中的5-羟甲基糠醛和糠醛[J].酿酒科技，2006，9:88-89.)。《中国药典》2010年版二部中只采用紫外法对右旋糖酐40葡萄糖注射液中的5-羟甲基糠醛(以下简称5-HMT)进行了限度检查，而对右旋糖酐40氯化钠注射液未做控制。“HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛的限量”，建立了用HPLC法测定右旋糖酐40氯化钠注射液中5-HMT含量的方法，其结果在各批右旋糖酐40氯化钠注射液中均检测出了 5-HMT，因此有必要对其进行质量控制。但是在现有的文献中均没有报导右旋糖酐40氯化钠注射液或葡萄糖注射液中有过检测出糠醛的报导。
[0004]糠醛为有机化合物，是呋喃2位上的氢原子被醛基取代的衍生物，分子式C5H402，又称2-呋喃甲醛。糠醛属中等毒性类物质，其蒸气具有强烈的刺激性，并有麻醉作用。动物吸入、摄入或经皮肤吸收均可引起急性中毒，表现有呼吸道刺激、肺水肿、肝损害、中枢神经系统损害、呼吸中枢麻痹，以致死亡。其急性毒性=LD5tl为65mg/kg(大鼠经口)，最小致死剂量500mg/kg (人经口)，亚急性和慢性毒性:人吸入7.4?52.7mg/m3X3个月，发生粘膜刺激、结膜炎、流泪、头痛。此外糠醛是染色体断裂剂，具有诱发碱基对置换的突变作用，具有诱发精子畸形和精母细胞姊妹染色单体交换的遗传毒性作用，具有诱发脑室扩张的致畸作用等较大的潜在遗传及生殖毒性(牛凤云，王金山，王建刚，魏艳萍.糠醛对大鼠致畸效应的研究，1992，6 (4):290;陈卫平，王金山，宋霖.糠醛诱发小鼠精子畸形的实验研究.卫生毒理学杂志，1994,8(2): 129)。因此，美国政府工业卫生专家学会(ACGIH)在1981年即通过了 2ppm的阈限值(TLV-TWA)的规定。
[0005]从现有文献报导来看，对于右旋糖酐40氯化钠注射液或葡萄糖注射液中糠醛的存在是有可能的，即使其含量非常的低，为保证用药安全，对于糠醛检测及限量是必须的。
[0006]按照“HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5_羟甲基糠醛的限量”建立的HPLC法测定右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛，由于2-糠醛与5-羟甲基糠醛的结构有差异，而且2-糠醛的含量很低，上述检测方法要同时检测出两种杂质难度较大。前期研究结果表明，采用液相色谱进行测定时，液相色谱对糠醛的最低检出限为0.003μ g/mL，即注射液中2-糠醛可检出的最低浓度为0.003 μ g/mL，糠醛在其氯化钠注射液中含量较低，约为0.008?0.17μ g/mL，最低含量接近于最低检出浓度，不便于准确检测。此外，由于该样品中右旋糖酐40的浓度较高，采用文献中流动相等度洗脱方式进行洗脱，将会使右旋糖酐40残留在色谱柱柱头，影响色谱柱的寿命。因此采用检测5-羟甲基糠醛的条件及方法，还不能检测出右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的存在。

【发明内容】

[0007]针对上述领域中的不足，本发明提供一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法，通过优化的液相检测条件，检测出右旋糖酐40氯化钠注射液中确有2-糠醛存在，该HPLC检测方法重复性好，且采用梯度洗脱方法，右旋糖酐40的残留少，对色谱柱的使用寿命影响较小。
[0008]一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法，包括固相萃取及液相检测两个步骤，其特征在于:所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化钠注射液上柱，用水洗涤，去除右旋糖酐及氯化钠，再加甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，真空离心挥干，用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0) (50:50)溶解，0.45 μ m微孔滤膜滤过，作为液相检测的供试品溶液；所述液相检测中的洗脱程序采用梯度洗脱，所述流动相A:甲醇，流动相B:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)，O?3.0Omin采用100%的水相，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin采用A-B体积比为30:70的混合流动相，18.10?21.0Omin采用A-B体积比为50:50的混合流动相，21.10?28.0Omin采用100%的水相平衡色谱柱。
[0009]所述固相萃取小柱为Waters Oasis HLB固相萃取小柱。
[0010]所述固相萃取中，用水洗涤至少三次。
[0011 ] 所述液相检测中的色谱柱为MACHEREY-NAGEL C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m)，检测波长:275nm。
[0012]所述洗脱过程中，柱温为40°C，流动相流速:1.0mL/min。
[0013]由于右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛浓度太低，不便于检测，因此本发明在进行液相检测前，进行了预处理，使用固相萃取法将注射液中氯化钠和右旋糖酐去除，同时将糠醛富集吸附，提高其检测浓度。右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐浓度为6%，氯化钠浓度为0.9%，使用固相萃取小柱萃取过程中，需用水洗脱3次，每次3mL，用以去除右旋糖酐及氯化钠，然后用甲醇洗脱糠醛，收集甲醇洗脱液，挥干甲醇，加流动相甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节PH为3.0) (50:50)溶解，用于液相分析。由于右旋糖酐40易于在色谱柱的柱头残留，从而影响色谱柱的使用寿命，本发明采用了梯度洗脱的方式，O?3.0Omin采用100%的水相，柱温40°C，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0) (30:70)对样品中的糠醛进行分析测定；18.10?21.0Omin采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0) (50:50)，增加流动相中有机相的比例，洗脱样品中的极性较弱的杂质；21.10?28.0Omin采用100%的水相平衡色谱柱。
[0014]本发明方法在采用液相分析前对样品溶液进行了预处理,采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱对糠醛进行富集吸附，并将右旋糖酐40去除，收集到液相样品溶液；同时液相检测中采用梯度洗脱的方式，去除残留，延长了色谱柱的使用寿命。采用本发明的方法，能同时检测出右旋糖酐40注射液中的5-羟甲基糠醛和2-糠醛，对于该注射剂安全性评价有重要依据。本发明方法灵敏度高，注射液中2-糠醛的最低检出量为0.00015μ g/mL，特别适用于注射液中2-糠醛含量较低样品的检测，测定结果更准确；重复性好，一批6份注射液测定结果，其含量平均值为0.0889 μ g/mL, RSD为0.6% ;精密度RSD为0.4%，加样回收率平均为 93.1%，RSD 为 0.9%ο
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1空白色谱图，
[0016]图22-糠醛对照品色谱图，
[0017]其中峰I为2-糠醛，
[0018]图3右旋糖酐40氯化钠注射液色谱图，
[0019]其中峰I为5-羟甲基糠醛，峰2为2-糠醛
[0020]图4右旋糖酐40氯化钠注射液色谱图，
[0021]其中峰I为5-羟甲基糠醛，峰2为2-糠醛。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0023]实施例1
[0024]1.仪器与试药
[0025]仪器:Waters Alliance HT系统；检测器:Waters2487紫外检测器。
[0026]固相萃取柱:0asis HLB, 60mg, 3cc,使用时依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。
[0027]试药:糠醛为分析纯，甲醇为色谱纯，水为高纯水。
[0028]2.方法与结果
[0029]2.1色谱条件:Waters Alliance HT系统；检测器:Waters2487紫外检测器；色谱柱:MACHEREY-NAGEL C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m);洗脱程序采用梯度洗脱，流动相A:甲醇，流动相B:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0);梯度洗脱程序见表I。柱温:40 0C ;流速:1.0mL/min ;检测波长:275nm ;进样量 20 μ L。
[0030]表1注射液梯度洗脱程序
[0031]
【权利要求】
1.一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法，包括固相萃取及液相检测两个步骤，其特征在于:所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化钠注射液上柱，用水洗涤，去除右旋糖酐及氯化钠，再加甲醇洗脱，收集洗脱液，挥干甲醇，用混合溶剂溶解，0.45 μ m微孔滤膜滤过，作为液相检测的制剂供试品溶液；所述液相检测中的洗脱程序采用梯度洗脱，所述流动相A:甲醇，流动相B:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液，用磷酸调节pH为3.0，0?3.0Omin采用100%的水相，迅速去除样品中残留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin采用A-B体积比为30:70的混合流动相，18.10?21.0Omin采用A-B体积比为50:50的混合流动相，21.10?28.0Omin采用100%的水相平衡色谱柱，所述混合溶剂为甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液，用磷酸调节pH为3.0，甲醇与0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液的体积比为50:50。
2.根据权利要求1所述测定方法，所述固相萃取小柱为WatersOasis HLB固相萃取小柱。
3.根据权利要求1所述的测定方法，所述固相萃取中，用水洗涤至少三次。
4.根据权利要求1所述的测定方法，所述液相检测中的色谱柱为MACHEREY-NAGELC18色谱柱，检测波长:275nm。
5.根据权利要求1所述的测定方法，所述洗脱过程中，柱温为40°C，流动相流速:.1.0mT,/mi n.
【文档编号】G01N30/34GK103575835SQ201310545294
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】刘海静, 王嫦鹤, 王发, 张秉华, 耿庆光, 刘雪峰, 由亚宁, 马鹏飞 申请人:陕西省食品药品检验所