黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，包括盒盖、盒身和试纸条，盒盖上设置用于收纳荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的反应槽，盒身内设置试纸条收纳位；所述的试纸条是黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸条，由底板和附着在底板上依次紧密相接的样品垫、层析膜和吸水垫组成，所述的层析膜上设有检测区和质控区，检测区固定与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体或多克隆抗体。使用本发明的检测盒可在极短时间完成植物黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测，具有良好的特异性和灵敏度，是一种理想的黄瓜绿斑驳花叶病毒感染检测工具。
【专利说明】黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用免疫层析技术检测植物黄瓜绿斑驳花叶病毒感染的装置。
【背景技术】
[0002]黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus)是重要的植物检疫性病毒之一，可导致作物产量损失达15%，对葫芦科作物的生产造成严重威胁。2005年辽宁省盖州市西瓜感染了黄瓜绿斑驳花叶病毒，损失惨重。此后在广西、辽宁、河北、山东、广东和北京等地陆续发现疫情，已严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产，因此加强该病毒的检测极为重要。
[0003]防止来自疫区携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子进境和传播是控制该病毒传入和扩散的前提；加强疫情监测并采取有效的根除措施，是防止病害扩散流行的关键。目前，实验室对该病毒的快速检测常用ELISA和PCR等分子生物学检测方法。ELISA试剂盒存在着检测试剂极其昂贵的缺点，PCR方法则存在着操作繁琐，无法实施田间大面积监测的缺点。因此，简便易行的快速检测方法对于黄瓜绿斑驳病毒疫情的防控具有重要意义。
[0004]免疫层析技术是上世纪90年代发展起来的一种基于抗原抗体反应的简便快速检测技术，该技术已经广泛应用于临床、食品安全检测领域。胶体金免疫层析检测试纸条是体外快速检测试剂的主要品种之一。以其快速、简便、价廉、所用样品量少、可以直接测定未经处理的样品、污染小、不需要贵重仪器、可以直观判断结果、易于基层和现场使用等优点，而得到广泛应用。但是胶体金免疫层析试纸条的灵敏性不够理想，这大大限制了它在检测领域中的广泛应用。
[0005]采用比纳米金颗粒信号更为强的标记物质即可在一定程度上提高免疫层析试纸条的灵敏性。新型的荧光纳米颗粒恰恰具有这样一种优势。荧光纳米颗粒是将荧光物质(如FITC、量子点、稀土螯合物)包裹在高分子材料中，形成纳米颗粒(Nanoparticles, NPs)。包裹作用一方面能使更多的发光分子连接在生物分子上起到信号放大作用，另一方面可克服外界环境对发光试剂的影响(如淬灭作用等)，增加发光试剂的稳定性。包裹着荧光分子或其它发光分子的纳米颗粒比单个荧光分子有高得多的发光强度和光化学稳定性。荧光纳米颗粒还具有颗粒均一，大小任意可调等优势；尤其是在标记方面，完全摒弃了胶体金依靠被动物理吸附的标记方式，采用定向共价偶联技术，几乎完整保持了抗体和抗原的活性，使检测的背景噪音大大降低。采用相同的抗原和抗体试剂，荧光纳米颗粒在灵敏性上可以轻易超出胶体金1-2个数量级，是极有应用前景的生物分子标记材料。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种使用方便，灵敏度高的针对黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测装置，用于植物黄瓜绿斑驳花叶病毒感染的现场快速检测。
[0007]本发明公开一种黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，包括盒盖、盒身和试纸条，盒盖上设置用于收纳荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的反应槽，盒身内设置试纸条收纳位；所述的试纸条是黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸条，由底板和附着在底板上依次紧密相接的样品垫、层析膜和吸水垫组成，所述的层析膜上设有检测区和质控区，检测区固定与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体或多克隆抗体。所述黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的形式更有有益于产品的保存和使用，检测时荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物与检测样品充分接触，更有助于阳性样品的检出，并且时间证明有非常高的灵敏度。
[0008]为适用不同情况下的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测，本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒可制备为各种具体的实施方式。
[0009]为实现多次使用的目的，本发明的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的【具体实施方式】之一是在所述的盒身内设置试剂瓶收纳位，所述的试剂瓶收纳位放置收纳了荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的棕色试剂瓶。试剂瓶中预先灌入可供多次使用量的荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物反应液。使用时，向反应槽中倒入一次检测量的反应液，即可进行后续检验。为了避免所述荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的失活，该实施方式下的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒需要于4°C度保存。
[0010]为应用于多个样品检测目的，本发明的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的另一【具体实施方式】是在所述检测盒中配置具孔反应板，所述具孔反应板上设有用于容纳荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的盲孔。作为优选地，所述的具孔反应板从整体外型上与盒身反应槽相匹配，具孔反应板上设有多个孔径0.5?1.0cm、深度0.5?1.0cm的盲孔。所述的荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物可以采用上文述及的试剂瓶方式保存，使用时加入到具孔反应板的盲孔中。更为优选地，是在盲孔中预先吸附冻干的荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物。检测过程中，将具孔反应板取出放置于反应槽中，并以每一个盲孔作为一个独立的展开槽进行加样检测。可实现同时对对多个样品的检测。
[0011]上述各个技术特征，也可以在黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的设计中组合使用，其组合而成的技术方案也应当在本发明所延及的范围内。
[0012]此外，为实现本发明所述的现场快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的发明目的，还可以将其设计组装为本领域常见的试纸形式，本发明提供一种具体的试纸设计思路为:一种黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸，由底板和附着在底板上依次紧密相接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫组成，其特征在于所述的结合垫上包埋有荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物；所述的层析膜上设有检测区和质控区，检测区固定与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0013]上述本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸可以与检测样品提取用的洁净塑料袋组装成为试剂盒保存，以应对一次或多次检测使用。
[0014]上述本发明任一技术方案中所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒或黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸中所述的检测区所固定的与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应抗体优选单克隆抗体。所述单克隆抗体可以根据现有技术中所记载的单抗制备方法制备，也可以购买商品单克隆抗体。所述的检测区可以采用现有技术中所记载的点涂法制备:将与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的多克隆抗体或单克隆抗体作为硝酸纤维素膜上的检测区包被抗原，将适当浓度的包被抗原用点膜仪以I μ L/cm的量喷于黏于PVC底板上的硝酸纤维素膜上。然后置于干燥密闭的37°C真空烘箱内烘烤60min，取出后干燥环境保存备用。
[0015]上述本发明任一技术方案中所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒或黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸中所述的质控区固定有羊抗鼠IgG。所述的质控区可以采用现有技术中所记载的点涂法制备:将适当浓度的羊抗鼠IgG用点膜仪以I μ L/cm的量喷于黏于PVC底板上的硝酸纤维素膜上。然后置于干燥密闭的37°C真空烘箱内烘烤60min，取出后干燥环境保存备用。
[0016]使用本发明的检测盒或检测试纸可在极短时间完成植物黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。在保证良好的特异性和灵敏度前提下，可以在IOmin之内得出检测结果，大大快于传统的PCR (I?2小时)、ELISA (I?2小时)等检测方法，提高了检测效率。本发明既适合单份样品的检测，也适用于大批量样品的快速检测；并且对操作者及仪器设备要求不高，是一种理想的黄瓜绿斑驳花叶病毒感染快速检测工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]本发明附图4幅，其中，
[0018]图1是本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒结构示意图，I (a)为盒盖结构示意图，1(b)为盒身结构示意图；
[0019]图2是本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒中的试纸条的结构示意图；
[0020]图3是本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒中的具孔反应板结构示意图；
[0021]图4是本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸结构示意图；
[0022]附图中:1、盒盖；2、盒身；3、试纸条收纳位；4、反应槽；5、稀土荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物；6、底板；7、样品垫；8、层析膜；9:吸水垫；81、检测区；82、质控区；10、结合垫；11、具孔反应板；12、盲孔。
【具体实施方式】
[0023]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，本发明所述及的
[0024]牛血清白蛋白(BSA)购自上海生工。硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜购自美国Millipore公司。所用试剂均为分析纯。用于对比试验的40nm胶体金参考Frens方法制备([J].Nat Phys.Sci, 1973，241 (105):20)制备。黄瓜绿斑驳花叶病毒感染阳性样品由辽宁省出入境检验检疫局提供，经过RT-PCR (国家标准GB/T28071-2011)方法鉴定确定为阳性样品。
[0025]实施例1.制备黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒及黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸
[0026]1、荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物反应液的制备
[0027]取荧光颗粒(购自深圳市易瑞生物技术有限公司)50μ L (10mg/ml)，加入550 μ L50mM MES(pH6.0)、100mg/mL 的 sulfo-NHS 和 EDC 各 200 μ L，室温摇动 30min ;离心，弃上清；用lmL50mM的MES (pH6.0)重悬颗粒；加入适量黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体(购自北京兰伯瑞生物技术有限公司)，室温振摇Ih ;加入等体积的PBS-BSA (BSA含量2%，PH7.4)，继续反应Ih ;离心，弃上清；用50mM MES(pH6.0)洗涤颗粒3次，ImL/次；用300 μ L重悬液(IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)，10%蔗糖)重悬颗粒，4°C保存，备用。
[0028]制备所得的荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物反应液以下述方式之一处理:
[0029]a.独立保存于棕色试剂瓶，并装配至黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒中；
[0030]b.在聚苯乙烯制备的具孔反应板上吸附荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物，吸附的方法可使用现有技术中已非常成熟的冻干吸附。作为参考，本发明使用的冻干技术参数主要包括(中试型冻干机，德国CHRIST，EPSIL0N2-6D):
[0031]冷冻速度(CoolingRate) 1.5°C /min ；
[0032]早期冷冻点(IncipientFreezing Point)-1°C, 15min ；
[0033]冷冻温度(Coolingtemperature)-40°C ；
[0034]共溶点(MeltingPoint Eutectic temperature) -27°C ；
[0035]加热温度(Heatingtemperature) 20°C , 120mino
[0036]c.将其负载于硝酸纤维素膜上制备负载了荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的结合垫。
[0037]2、层析膜的制备
[0038]I)检测区:以黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体(购自北京兰伯瑞生物技术有限公司)为硝酸纤维素膜上的检测区包被抗原。将浓度为lmg/mL的包被抗原用点膜仪以I μ L/cm的量喷于黏于PVC底板上的硝酸纤维素膜上。置于干燥密闭的37°C真空烘箱内烘烤60min，取出后放于干燥皿中待用。
[0039]2)质控区:以羊抗鼠IgG (购自深圳市易瑞生物技术有限公司)包被硝酸纤维素膜，作为质控区。将浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG用点膜仪以I μ L/cm的量喷于黏于PVC底板上的硝酸纤维素膜上。置于干燥密闭的37°C真空烘箱内烘烤60min，取出后放于干燥皿中待用。
[0040]3、黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的装配
[0041]如附图1示，黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒包括盒盖1、盒身2和试纸条3，盒盖I上设置用于收纳荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物5的反应槽4，盒身2内设置试纸条收纳位3，试纸条收纳位3可以收纳一或多张试纸条。
[0042]所述的试纸条3是黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸条，单张的试纸条如附图2示:在底板6上依次紧密搭接的样品垫7、层析膜8和吸水垫9 ;其中，所述的层析膜8上设有检测区81和质控区82，检测区81固定有与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体；质控区82固定有羊抗鼠IgG。装配后裁切成5mm宽的条状,可收纳于盒身2内。
[0043]非检测状态下，所述的荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物以反应液的形式存贮于棕色试剂瓶，该试剂瓶可放置于盒身2内。装配得到的检测盒需4°C度保存。
[0044]同时可采用聚苯乙烯制备如附图3的具孔反应板11，其上设有盲孔12。所述具孔反应板11外形与反应槽4相匹配，具孔反应板11上盲孔12孔径0.5cm，盲孔12深度0.5cm。采用本实施例1b的方法在盲孔12中冻干负载荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物。适宜数量的所述具孔反应板11也收纳于盒身2内适当位置即可。检测时，可将试纸条做适当裁剪以适用于以盲孔12为展开槽的检测过程。
[0045]4、黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸的装配
[0046]如附图4示，在底板6上依次紧密搭接的样品垫7、结合垫10、层析膜8和吸水垫9 ;其中，所述的结合垫10上包埋有荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物；所述的层析膜8上设有检测区81和质控区82，检测区81固定有与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体；质控区82固定有羊抗鼠IgG。
[0047]装配后裁切成5mm宽的条状，即得本发明所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸，4°C干燥保存。
[0048]实施例2.样品检测
[0049]1、检测样品制备
[0050]检测样品制备:取Ig待检测样品叶片于洁净塑料袋中，加入3ml PBST (I XPBS,
0.5%Tween20, pH7.4)，揉搓塑料袋中的叶片，取汁液为检测样品进行检测。
[0051]2、使用黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒检测样品
[0052]将所制备的检测样品加入至实施例1.3所制备的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒的反应槽12中，加入荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物反应液，吹打混匀；插入试纸条，40°C孵育3min,5min后紫外光下肉眼观察层析结果。
[0053]如使用具孔反应板检测，则直接将检测样品加入至具孔反应板11的盲孔12中，吹打混勻；插入试纸条，40°C孵育3min, 5min后紫外光下肉眼观察层析结果。
[0054]3、使用黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸检测样品
[0055]将实施例1.4所制备的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸的样品垫端插入检测样品，5min,紫外光下肉眼观察层析结果。
[0056]4、结果判定
[0057]无论使用黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒还是黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸检测样品，结果的判定标准是一致的:检测区81和质控区82均有荧光显示，则检测结果阳性，显示样品被黄瓜绿斑驳花叶病毒感染；检测区81有荧光显示而质控区82无荧光显示，则检测结果阴性，显示样品未被黄瓜绿斑驳花叶病毒感染；检测区81和质控区82均无荧光显示，则试纸作废，需重新检测。
[0058]5、检测特异性及稳定性试验
[0059]使用黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒检测小西葫芦花叶病毒(ZYMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番木瓜环斑病毒(PRSV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、甜瓜坏死斑点病毒(MNSV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)阳性样本(以上病毒均购自中国检验检疫科学研究院)，均无交叉反应，本发明的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒应用特异性良好。
[0060]将黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒中的试纸条、稀土荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物，以及提取液(IXPBST)放在37°C 7天，取出检测不同浓度的阳性样品，观察其稳定性。实验结果证实，在测试条件下灵敏性没有明显降低。
[0061]实施例3.与胶体金免疫层析法的对比试验
[0062]参照文献“南瓜花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制”([J].植物检疫，2012，38(5):88-91.)的方法制备单抗-胶体金偶联物，并参照实施例1的方法制备黄瓜绿斑驳花叶病毒胶体金免疫层析检测盒及检测试纸。参照实施例2的方法进行胶体金免疫层析法检测。
[0063]1、检测灵敏性比较试验
[0064]使用实施例2.2 (检测盒，试剂瓶)的测试形式比较本发明实施例1.3所制备的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸条与黄瓜绿斑驳花叶病毒胶体金免疫层析检测试纸条的灵敏度。
[0065]用PBST倍比稀释同一份阳性样本，用胶体金免疫层析方法与本发明的方法分别进行检测。判读结果如下表所示(表中+表示阳性，-表示阴性)。从表中可以看出荧光纳米颗粒试纸条的灵敏性要高于胶体金试纸条的灵敏性。
[0066]
【权利要求】
1.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，包括盒盖、盒身和试纸条，盒盖上设置用于收纳荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的反应槽，盒身内设置试纸条收纳位； 所述的试纸条是黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测试纸条，由底板和附着在底板上依次紧密相接的样品垫、层析膜和吸水垫组成，所述的层析膜上设有检测区和质控区，检测区固定与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体或多克隆抗体。
2.权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的盒身内还设有试剂瓶收纳位，所述的试剂瓶收纳位放置收纳了荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的掠色试剂瓶。
3.权利要求2所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于检测盒4°C度保存。
4.权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于还包括具孔反应板，所述具孔反应板上设有用于收纳荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物的盲孔。
5.权利要求4所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的具孔反应板外形与盒身反应槽相匹配，具孔板上盲孔孔径0.5?1.0cm,盲孔深度0.5?1.0cm0
6.权利要求5所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的具孔反应板由聚苯乙烯制成，盲孔内收纳冻干的荧光纳米颗粒-黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体偶联物。
7.权利I?6中任一权利要求所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的检测区固定有与黄瓜绿斑驳花叶病毒发生特异性反应的单克隆抗体。
8.权利I?6中任一权利要求所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的质控区固定有羊抗鼠IgG。
9.权利I?6中任一权利要求所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的荧光纳米颗粒为稀土荧光纳米颗粒，其含有稀土离子与螯合剂形成的螯合物，所述螯合物可以在紫外光激发下发射出特征性荧光；所述稀土离子为Eu3+、Sm3+、Dy3+或Tb3+。
10.权利9所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测盒，其特征在于所述的稀土荧光纳米颗粒粒径10?lOOOOnm。
【文档编号】G01N33/569GK103558379SQ201310548698
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】曹冬梅, 李鑫, 曹际娟, 李立梅 申请人:曹冬梅, 李鑫, 曹际娟, 李立梅