一种快速鉴别延胡索生熟饮片的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速鉴别中药延胡索生熟饮片的方法，它是将生延胡索饮片、醋延胡索饮片粉碎过4号筛，精称生延胡索和醋延胡索药粉各2g，加蒸馏水或甲醇25ml，超声提取处理40min，将提取液高速离心，取上清液作为供试品溶液；再取延胡索乙素标准对照品，加甲醇制成每1ml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述新制备的延胡索供试品溶液35μl、延胡索乙素对照品溶液15μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，碱性状态下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热10min，置紫外灯（365nm）下检视。本发明能快速鉴别生延胡索和醋延胡索饮片中延胡索乙素的含量差异，为中药行业鉴别和评价延胡索饮片质量提供依据。
【专利说明】一种快速鉴别延胡索生熟饮片的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药饮片定性、定量测定【技术领域】，更具体地说是一种通过定性、半定量分析快速进行鉴别中药延胡索生熟饮片的方法。
【背景技术】
[0002]延胡索为S粟科植物延胡索CbzyWi1S yanhusuo ff.T.Wang.的干燥块莖。性味辛、苦、温，归肝、脾经。具有活血、利气和止痛的功效，临床主治胸胁及脘腹疼痛、经闭痛经、产后瘀阻和跌打肿痛。目前经研究表明，延胡索中生物碱具有良好的镇痛作用，其中又以延胡索乙素的镇痛作用较强，稳定性最好，但水溶性较差，延胡索经醋制后能使其生物碱类成分溶出量增加，以增强止痛效果，故常选用其作为指标。2010版中国药典中使用薄层色谱法、高效液相法、化学发光法、毛细管电泳法对延胡索进行鉴别与含量测定。而相比于其他方法，薄层色谱法具有快速、简便的特点。目前，已有的薄层色谱试验方法主要包括:
1、2010版中国药典的方法:
(I)供试品溶液制备:据2010版中国药典方法所述，取延胡索粉末lg，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水IOml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次IOml合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材lg，同法制成对照药材溶液。
[0003](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
[0004](3)色谱条件:照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2?3μ 1，分别点于同一用I %氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯一丙酮(9:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽薄层板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0005]2、魏良兵，孟楣，程墦，等.不同醋炙延胡索中延胡索乙素的含量变化.中药材，2008，31 (4):494-495 方法:
(O供试品溶液制备:精密称取供试品2g，置圆底烧瓶中，精密加入浓氨试液一甲醇(I: 20)混合溶液IOOml称定重量,冷浸lh，加热回流lh，放冷，再称定重量,用浓氨试液一甲醇(1:20)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至IOml容量瓶中，并稀释到刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0006](2)对照品溶液制备:精密称取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每Iml含0.1Omg的溶液，即得对照品溶液。
[0007](3)色谱条件:以硅胶G板为吸附剂，甲苯一丙酮(9:2)为展开剂，饱和30min，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘。光谱扫描确定最大吸收波长:照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取对照品溶液、供试品溶液各I μ I点于硅胶G薄层板上，依法展开；在200?700nm的波长范围内扫描延胡索乙素斑点，选定280nm为检测波长,在650nm处均无吸收,选定650nm为参比波长。
[0008]3、谭永红，吴苏澄，姜云平，等.胃炎停胶囊中白花蛇舌草、延胡索、高良姜的薄层色谱鉴别[J].华西药学杂志，1998，13(4):265?266的方法:
(I)供试品溶液制备:取供试品5g加氨水5ml浸润，加乙醚80ml，超声提取lh，提取液用10%乙酸萃取(20ml X 3)，合并萃取液，加氨水调PHlO?11，再加氯仿萃取(20ml X 3)，合并氯仿萃取液，水洗涤至中性；加适量无水硫酸钠脱水，挥去氯仿，残渣加甲醇Iml溶解得供试品溶液。另取缺延胡索的阴性对照样品5g，同法制成阴性样品供试液。
[0009](2)对照品溶液制备:取延胡索乙素对照品加甲醇制成每毫升含Img的对照品溶液。
[0010](3)色谱条件:吸取上述3种溶液各10μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以(I )正己烷一氯仿一甲醇一二乙胺(10:6:1:1滴)和(II )苯一丙酮一二乙胺(8:2:1滴)为展开剂展开，取出晾干，喷以改良碘化铋钾溶液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品则无此斑点。
[0011]4、郑弘，许红玮.延胡索不同炮制方法的薄层色谱鉴别对比研究[J].中医学报，2013，28 (5) =695-696 的方法:
(I)供试品溶液制备:取延胡索样品粉碎，取粉末lg，加甲醇50ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水IOml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次IOml合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。
[0012](2)对照品溶液制备:取延胡索乙素对照品加甲醇制成Iml含1.5mg的溶液，作为对照品溶液。
[0013](3)色谱条件:将供试品和对照品点于同一 I %氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯一丙酮(9:2)为展开剂展开6?7cm，取出薄层板，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽薄层板上吸附的碘，置紫外光灯(365nm)下检视。可见供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0014]5、刘新，林於，陈云，等.中成药中延胡索乙素薄层扫描法系统研究.中成药，2006，26 (I): 19-23 的方法:
(O供试品溶液制备:取延胡索的生药粉制剂，加入乙醇适量回流提取3次，每次30min，得到乙醇提取液。减压抽干乙醇，残渣用0.2mol稀硫酸或盐酸分次溶解，并用适量乙醚洗涤，得酸水提取液。调节PH9?10，用适量乙醚萃取4?5次，得乙醚提取液后，蒸干乙醚，用乙醇将残渣分次溶解，得供试品溶液。
[0015](2)色谱条件:采用了高效硅胶G预制板与硅胶G手工板及加二乙胺法碱性展开剂系统。显色系统选定改良碘化铋钾、碘薰2种方式显色，采用可见光、紫外光及荧光3种方式检测。经试验结果显示，碘化铋钾显色稳定性较碘薰显色差，应在显色后5h内检测。考虑到中成药中THP含量微，要求有较好的检出灵敏度、稳定性和扫描速度，以碘薰显色、荧光单波长检测较为适宜。
[0016]综上所述，现有延胡索薄层色谱的试验方法存在以下问题:
(1)现有技术使用的薄层色谱法中延胡索的提取存在着操作复杂，溶剂消耗量大，提取率不闻等问题；
(2)现有技术中使用的是I%氢氧化钠溶液制备的特制硅胶G薄层板或高效硅胶G预制板与娃I父G手工板；
(3)现有技术中展开剂的配制溶剂种类繁多有用到甲苯、丙酮、氯仿、二乙胺等有刺激性溶剂，容易对人体造成伤害；
(4)现有技术的方法显色时多用碘缸，或者使用显色适用范围小的改良碘化铋钾，且在薄层色谱检视中能够显色可见的斑点少或者不明显。
【发明内容】
[0017]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足提供一种改良后的薄层色谱实验方法。本发明公开的快速鉴别中药延胡索生熟饮片的薄层色谱方法，其特征在于按如下的步骤进行:
一种快速鉴别延胡索生熟饮片的方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(1)供试品溶液的制备:分别取粉碎过的生延胡索、醋延胡索各2g，加蒸馏水或甲醇25ml，超声提取处理40-60min，将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心10_20min，4000r/s，取生延胡索、醋延胡索上清液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶液30-35μ1、对照品溶液12-15 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚:环己烷:甲醇的体积比为(3^6):(2^4):(0.5~2)作为展开剂，碱性状态下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检测。优选展开剂乙醚:环己烷:甲醇的体积比为5:3:1，碱性状态下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检测。
[0018]本发明所述的鉴别方法，其中步骤(3)所述的碱性状态下展开指的是硅胶G薄层板经过氨水饱和后使用。具体指的是硅胶G薄层板经过25%氨水饱和IOmin后使用。
[0019]本发明所述的鉴别方法，其中步骤(3)所述的碱性状态下展开指的是硅胶G薄层板经过氨水饱和后使用。优选指的是:硅胶G薄层板经过25%氨水饱和IOmin后使用。
[0020]本发明所述的生延胡索指的是延胡索药材除去杂质，洗净，干燥，切厚片。
[0021]本发明所述的醋延胡索指的是净延胡索饮片照醋炙法炒干或照醋煮法煮至醋吸尽，切厚片。
[0022]本发明提供了一种快速鉴别中药延胡索生熟饮片的方法:
(I)供试品溶液制备:取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)2g，加蒸馏水25ml，超声提取处理40min，将延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0023](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0024](3)色谱条件:取上述供试品溶液35 μ 1、对照品溶液15 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(5:3:1)作为展开剂，碱性状态下展开(氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105°C下加热IOmin，在365nm紫外灯下检视如图1所示。
[0025]本发明另外一种快速鉴别中药延胡索生熟饮片的方法: (I)供试品溶液制备:取生延胡索、醋延胡索饮片的粉末(粉碎过4号筛)2g，加入甲醇25ml，超声提取处理40min，将延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0026](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0027](3)色谱条件:取上述供试品溶液30 μ 1、对照品溶液12 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(5:3:1)作为展开剂，碱性状态下展开(氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105°C下加热IOmin，在365nm紫外灯下检视如图2所示。
[0028](4)在以上两种提取方法的薄层色谱检视中，生延胡索和醋延胡索对应位置上的延胡索乙素斑点，醋延胡索斑点明显比生延胡索斑点显色清晰明亮，表明延胡索醋制后可增加延胡索乙素的溶出量，明显增强了止痛效果。
[0029]本发明提供的改良后的薄层法与现有技术使用的薄层色谱法比较:
(I)现有技术使用的薄层色谱法中，延胡索的提取所用的溶剂大多都需要甲醇配合使用乙醚、浓氨试液、氯仿等试剂，本发明只需使用甲醇一种溶剂。另外延胡索的提取存在着操作复杂，溶剂消耗量大，提取率不高等问题；而本发明改良后的实验方法中延胡索的提取方法简单易行，溶剂消耗量少且节约时间；
(2 )现有技术中使用的是I %氢氧化钠溶液制备的特制硅胶G薄层板或高效硅胶G预制板；而本发明的实验方法中采用的是经过25%氨水饱和的普通硅胶G板，优点在于省去制板步骤，并且在碱性条件下饱和后的薄层板可以促进结合生物碱类成分形成游离生物碱，游离生物碱极性低于结合生物碱，避免了拖尾和比移值过小，故可以获得更好的展开效果；
(3)现有技术中薄层展开剂的配制溶剂种类繁多，例如甲苯、丙酮、氯仿、二乙胺等有刺激性的溶剂，容易对人体造成伤害；本发明的展开剂为乙醚、环己烷、甲醇，常用且毒性较小;
(4)现有技术的方法显色时多用碘缸，或者使用显色适用范围小的改良碘化铋钾，且在薄层色谱检视中能够显色可见的斑点少或者不明显；而本发明的所采用的是广谱显色剂，适用范围广，检出灵敏度高且薄层色谱检视中能够显色可见的斑点多且清晰。
综上所述，本发明公开的对炮制前后延胡索中延胡索乙素的含量差异的薄层色谱法的改良达到简单、快捷、效果明显的目的，并为薄层色谱法检验延胡索中的延胡索乙素提供有利的参考。
[0030]【专利附图】
【附图说明】:
图1为本发明实施例1延胡索炮制方法的检测图；其中1:生延胡索饮片，2:醋延胡索饮片，3:延胡索乙素对照品；
图2为本发明实施例2延胡索炮制方法的检测图；其中I生延胡索饮片，2醋延胡索饮片，3延胡索乙素对照品。
[0031]图3为水提液未用氨水饱和的图；其中1-生延胡索饮片，2-醋延胡索饮片，3-延胡索乙素对照品；主要是延胡索水提液未采用25%氨水饱和薄层板，与图1比较，醋延胡索分离效果不好，检测斑点有明显拖尾现象。
[0032]图4为醇提液未用氨水饱和的图；其中1-生延胡索饮片，2-醋延胡索饮片，3-延胡索乙素对照品；主要是延胡索甲醇提液未采用25%氨水饱和薄层板，与图2比较延胡索乙素斑点Rf值偏小，检测斑点也有拖尾现象。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中所用各种原料均有市售。
[0034]实施例1
供试品溶液制备:分别取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)各2g，加蒸馏水25ml，超声提取处理40min，分别将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin，4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0035]对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0036]色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶液35 μ 1、对照品溶液15 μ 1，点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(5:3:1)作为展开剂，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105 °C下加热IOmin,在365nm紫外灯下检视如图1所示。
[0037]实施例2
供试品溶液制备:分别取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)各2g，加入甲醇25ml，超声提取处理40min，分别将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0038]对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0039]色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶供试品溶液30μ 1、对照品溶液12μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(5:3:1)作为展开齐U，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检视如图2所示。
[0040]实施例3
(1)供试品溶液的制备:取生延胡索粉末、醋延胡索过4号筛粉末各2g，加蒸馏水25ml，超声提取处理60min，将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心15min，4000r/s，取上清液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)色谱条件:取上述供试品溶液35μ 1、对照品溶液13.5 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚:环己烷:甲醇的体积比为5:3:1作为展开剂，碱性状态下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检测。
[0041]实施例4
(I)供试品溶液的制备:取过4号筛生延胡索粉末、过4号筛醋延胡索粉末各2g，加甲醇25ml，超声提取处理40min，将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)色谱条件:取上述供试品溶液30μ 1、对照品溶液15 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚:环己烷:甲醇的体积比为5:3:1作为展开剂，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检测。
[0042]实施例5
(I)供试品溶液制备:分别取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)各2g，加入水25ml，超声提取处理40min，分别将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0043](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0044](3)色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶供试品溶液30 μ 1、对照品溶液12 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(5:4:1)作为展开齐U，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检视。
[0045]实施例6
(O供试品溶液制备:分别取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)各2g，加入甲醇25ml，超声提取处理40min，分别将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0046](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0047](3)色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶供试品溶液30 μ 1、对照品溶液12 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(3:2:0.5)作为展开剂，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录),在105°C下加热IOmin,在365nm紫外灯下检视。
[0048]实施例7
(I)供试品溶液制备:分别取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)各2g，加入水25ml，超声提取处理40min，分别将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0049](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0050](3)色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶供试品溶液30 μ 1、对照品溶液12 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(4:2:1)作为展开齐U，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105°C下加热lOmin，在365nm紫外灯下检视。
[0051]实施例8
(O供试品溶液制备:分别取生延胡索粉末、醋延胡索粉末(4号筛)各2g，加入甲醇25ml，超声提取处理40min，分别将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心IOmin 4000r/s，取上清液作为供试品溶液。
[0052](2)对照品溶液制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0053](3)色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶供试品溶液30 μ 1、对照品溶液12 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚-环己烷-甲醇(4.5:2.5:1.5)作为展开剂，碱性状态下展开(25%氨水饱和)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液(中国药典附录)，在105?下加热IOmin,在365nm紫外灯下检视。
【权利要求】
1.一种快速鉴别延胡索生熟饮片的方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)供试品溶液的制备:分别取粉碎过的生延胡索、醋延胡索各2g，加蒸馏水或甲醇25ml，超声提取处理40-60min，将生延胡索、醋延胡索提取液高速离心10_20min，4000r/s，取生延胡索、醋延胡索上清液作为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:再取延胡索乙素标准品，加甲醇制成每Iml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液； (3 )色谱条件:分别取生延胡索、醋延胡索供试品溶液3 O - 3 5 μ 1、对照品溶液12-15 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以展开剂乙醚:环己烷:甲醇的体积比为3飞:2^4:0.5~2作为展开剂，碱性状态下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热IOmin,在365nm紫外灯下检测。
2.权利要求1所述的鉴别方法，其中步骤(3)所述的碱性状态下展开指的是硅胶G薄层板经过氨水饱和后使用。
3.权利要求1所述的鉴别方法，其中步骤(3)所述的碱性状态下展开指的是硅胶G薄层板经过25%氨水饱和IOmin后使用。
4.权利要求1所述的含量测定方法，其中步骤(3)所述的展开剂是指乙醚:环己烷:甲醇体积比为5:3:1 作为展开剂。
【文档编号】G01N30/90GK103543235SQ201310550242
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】窦志英, 金祖翔, 魏思文, 吴梓君, 罗琛艳 申请人:天津中医药大学