一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物检测【技术领域】，涉及一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法，并提供该方法的应用途径。适用于检测硫化氢合成酶包括CBS、CSE及CL的活性，对于组织样品，先剪成小块再研磨，对于细胞，组织细胞裂解液进行裂解，裂解产物进行蛋白定量，如图，反应体系(组织细胞裂解产物、L-半胱氨酸、5-磷酸吡哆醛)加在反应瓶外圈的反应池中，吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)加在内圈的吸收池中，反应体系产生H2S气体分子与吸收体系的荧光探针相结合，可用于荧光测定和荧光成像，定量检测H2S含量，更为直观地反映H2S合成酶的活性。本发明可为研究H2S相关的信号通路以及H2S在一些疾病过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。
【专利说明】一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用
一、【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用。这种荧光探针检测酶活性法可为研究组织细胞中一些重要的酶学过程中的机制，阐明生物系统中某些重要的信号通路，为某些重大疾病的早期诊断和预防提供良好的辅助手段。
二、【背景技术】
[0002]长期以来,硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)被认为是一种有毒的气体,然而，随着对H2S研究的深入,发现体内的一些组织细胞能生成H2S,它是继一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后被发现的第三种内源性气体信号分子。越来越多的实验表明，H2S不仅是一种内源性的气体信号分子，而且具有多种细胞保护作用，参与体内多种病理生理过程。在哺乳动物中，以半胱氨酸或半胱氨酸衍生物为底物催化生成H2S的内源酶具有相对的组织特异性，胱硫醚-Y -裂解酶(cystathionine- Y -lyase,CGL)主要在心血管系统中表达,胱硫醚-β -合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)主要在中枢神经系统、肝脏和胰腺组织中表达。巯基丙酮酸转硫酶(3-mercaptopyruvatesulfurtransferase, 3-MST)和半胱氨酸裂解酶(cysteine lyase, CL)也负责催化内源性H2S的生成。随着H2S在生物体系中的重要作用逐渐地被认识，鉴别和检测生物内源性H2S的方法日益受到关注，检测生物样品中H2S浓度的准确性和可靠性对于理解其功能非常重要，但由于H2S为可挥发气体分子，在生物体内受到各种复杂因素的影响，导致其检测难度高，检测结果不稳定。而检测生物组织或细胞中的硫化氢合成酶活性能较好反映该组织细胞产生H2S的能力，相对于直接检测生物体内的H2S含量，该方法更为可靠和稳定。所以，直观、特异、定量地检测生物组织或细胞中硫化氢合成酶的活性显得尤为重要。
[0003]传统的检测H2S方法如比色法、电化学分析法、气相色谱法以及硫化物沉淀法都需要复杂的样品处理，荧光检测方法由于简便，灵敏性高，可重复性好，并且能够实现可视化检测，因此，新型的荧光检测试剂和检测方法成为研究的焦点。硫化氢荧光探针灵敏度高，可作为生物物质研究指示系统，并可用于H2S的定量检测和组织细胞中硫化氢合成酶活性的间接测定，另外在研究微环境性质以及疾病的诊断等领域也有广泛应用，荧光检测方法不失为一种直观、特异、简便的检测手段，有望取代传统的检测方法。
[0004]传统的检测硫化氢合成酶活性的方法有反应瓶-亚甲基蓝法，但该方法中的反复冻融法裂解组织细胞步骤显得尤为繁琐，其检测反应瓶吸收体系中的H2S含量也不如本发明的荧光成像法直观、简便和灵敏。本发明的方法中所采用的荧光探针是新型的苯丙二硫醇化合物，是一个封闭的内酯构象，稳定性好，能够长期保存使用(_20°C )，无可见光区域的吸收特性，探针自身荧光微弱(荧光量子产量:Φ = 0.003)，仅在反应后荧光增强(荧光量子产量:Φ = 0.392)，用于荧光成像时信噪比高，并可用于荧光的定量测定；该荧光探针在磷酸缓冲溶液中的检测限为微摩尔(μ mol/L)，可检测到在血浆和细胞中10微摩尔的H2S浓度，检测效果稳定。荧光探针和H2S反应前后变化迅速，量子产率较高，在37°C条件下和H2S反应Ih可达最高荧光强度，适用于反应体系内H2S的快速测定；其操作简便，检测条件容易实现，可重复性好，可视化；并且，该荧光探针选择性高，可特异地和H2S反应，不受其他生物硫醇如半胱氨酸、谷胱甘肽干扰。因此，该方法有希望作为一种新型的硫化氢合成酶活性检测技术得到应用。
三、
【发明内容】
[0005]本发明需要解决的问题是:
[0006]1.提供一种基于H2S的荧光探针的，可用于检测硫化氢合成酶活性的新方法。这种荧光探针检测酶活性法可为研究组织细胞中一些重要的酶学过程中的机制，阐明生物系统中某些重要的信号通路，为某些重大疾病的的早期诊断和预防提供良好的辅助手段。
[0007]2.提供H2S荧光探针检测硫化氢合成酶活性的应用途径。
[0008]本发明的技术方案为:
[0009]1.一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法:
[0010](I)本发明的方法中所采用的荧光探针是新型的苯丙二硫醇化合物，是一个封闭的内酯构象，无可见光区 域的吸收特性，探针自身荧光微弱(荧光量子产量:φ = 0.003)，仅在反应后荧光增强(荧光量子产量:Φ = 0.392)，MW = 591.65，其结构式为:
[0011]
【权利要求】
1.一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法，其特征是: (1)本发明的检测方法适用于检测CBS、CSE及CL(需另外加入亚硝酸盐)的活性，实验步骤如下:对于组织样品，先剪成小块，再研磨，对于细胞，组织细胞裂解液(强)进行裂解(碧云天生物技术所，南通，中国)；细胞裂解产物经蛋白定量后，加入反应瓶中，反应体系加在外圈的反应池中，包括2mmol/L 5-磷酸吡哆醛400 μ 1，10mmol/L L-半胱氨酸40μ1及组织细胞裂解液，并用lOOmmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH = 7.4)定容至2ml。吸收体系加在内圈的吸收池中，即加入20 μ mo I/L硫化氢荧光探针工作液1ml，其中含有反应佐剂溴烷铵(CTABaOymol/L)。在37°C的密闭环境中吸收反应60min，取吸收池的溶液可用于荧光测定和荧光成像； (2)检测硫化氢合成酶活性试验，传统的组织细胞裂解方法为:直接加入缓冲液，经-20°C室温反复冻融裂解。本发明的裂解方法为:用碧云天生物技术所提供的组织细胞裂解液(强)进行裂解，对于55_细胞培养皿加入100 μ I细胞裂解液即可。 (3)检测硫化氢合成酶活性试验，传统的反应瓶吸收体系为:取0.5ml2%醋酸锌(调节PH值至碱性)加入中央的吸收池中，向锥形瓶充入适量的氮气，以胶塞封口，将锥形瓶置于37°C恒温箱中，轻摇120min，用50%三氯醋酸0.5ml中止反应后，继续反应60min，彻底吸收硫化氢。本发明的吸收体系为:含有反应佐剂溴烧铵(CTAB,10ymol/L)的硫化氢荧光探针工作液，在37°C的密闭环境中吸收反应60min ； (4)检测硫化氢合成酶活性试验，传统的检测方法为亚甲基蓝检测法:将吸收池中的醋酸锌混匀后，吸取0.4ml (枪头注意不接触锥形瓶壁)，加入7.2mol/L对苯二胺40 μ 1，1.2mol/L 三氯化铁 40 μ 1，室温反应 20min 后,用酶标仪(Molecular Devices, Sunnyvale,CA，USA)检测670nm波长处的吸光度值。绘制H2S标准曲线可定量分析。本发明的检测方法为:取吸收池溶液，用AMG荧光显微镜(Advanced Microscopy Group, USA)进行荧光成像，或用全波长扫描多功能读数仪(Varioskan Flash3001)进行突光测定Oex(max)=476nm, λ em(max) = 513nm),绘制H2S标准曲线可进行定量分析。
2.根据权利要求1所述反应瓶吸收体系的配制方法，其特征是: (1)配制IOOmmoI/L 磷酸缓冲液(PBS, PH = 7.4)
A 液:lmol/L K2HPO4.3H20 (MW = 228.22)取 9.13g+40ml ddH20 ； B 液:lmol/L KH2PO4(MW = 136.09)取 1.36g+10ml ddH20 ； 取A液40.lml+B液9.9ml,混合后，用ddH20定容至500ml ； (2)配制检测H2S的荧光探针液:将4mg荧光探针(MW= 591.65)溶解于13.5ml乙腈，配制浓度50mmol/L的荧光探针母液，_20°C长期保存，使用时，先取lOOmmol/L磷酸缓冲液(PBS, PH = 7.4) 500 μ 1，再加入乙腈500 μ 1，混匀后取荧光探针母液20 μ I加入其中与之混合，配制浓度20 μ mmol/L的荧光探针工作液； (3)配制溴烷铵(CTAB):取364mgCTAB(MW = 364.45)溶解于100ml乙醇中配成IOmmoI/L的溴烷铵母液，常温保存，使用时，按1: 1000用lOmmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH=7.4)进行稀释，配成浓度10 μ mol/L的溴烷铵工作液； (4)配制反应瓶吸收体系:取浓度20μ mmol/L的硫化氢探针工作液100 μ 1，在此基础上加入反应佐剂溴烷铵母液(CTAB，10mmOl/L)10l.! 1，并用磷酸缓冲液(PBS)定容至10ml，即CTAB终浓度为ΙΟμπιοΙ/L，取配制好的反应体系Iml加入反应瓶吸收池，现用现配。
3.根据权利要求1所述反应瓶反应体系的配制方法，其特征是: (1)配制IOOmmoI/L 磷酸缓冲液(PBS, PH = 7.4)
A 液:lmol/L K2HPO4.3H20 (MW = 228.22)取 9.13g+40ml ddH20 ； B 液:lmol/L KH2PO4(MW = 136.09)取 1.36g+10ml ddH20 ； 取A液40.lml+B液9.9ml,混合后，用ddH20定容至500ml ；(2)配制lmol/LL-半胱氨酸(MW = 121.16)取0.12g+lml上述(I)配制的磷酸缓冲液；(3)配制20mol/L(0.5% ) 5-磷酸吡哆醛(MW = 265.1)取 0.50g+100ml 上述(I)配制的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述用组织细胞裂解液在对组织细胞进行裂解的新方法在生物工程工业中的应用。
5.根据权利要求1所述用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法在生物工程工业中的应用。
6.根据权利要求1所述用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法在研究H2S相关的信号通路以及H 2S在疾病或生物体内的病生过程中的意义及诊断的应用。
【文档编号】G01N21/64GK103630518SQ201310576537
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】蔡典其, 杨春涛, 俞晓立, 江伟炽, 郑洁蓉 申请人:蔡典其, 杨春涛