同型半胱氨酸质控品及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种同型半胱氨酸质控品，其高浓度品和低浓度品分别包括以下浓度的各组分：20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-10mM金属螯合剂、0.1-5%防腐剂、0.1-30%糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态为：还原态Hcy1-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。该质控品的制备方法为：同型半胱氨酸高值制备；将高值分别稀释到高浓度品和低浓度品所需的浓度；稳定化处理。该同型半胱氨酸质控品成分稳定，Hcy的存在状态与人血清中同，稳定性好，准确度高。
【专利说明】同型半胱氨酸质控品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学检验【技术领域】，具体涉及一种同型半胱氨酸质控品，以及该同型半胱氨酸质控品的制备方法。
【背景技术】
[0002]同型半胱氨酸(Hcy)即2-氨酸-4-巯基丁酸，也称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，参与甲硫氨酸的代谢过程，可被甲基化生成蛋氨酸，或被转硫化作用生成半胱氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，并可释放到血液中。目前研究认为，Hcy是独立的心脑血管疾病最新监测指标，其水平升高与心、脑血管及周围血管动脉粥样硬化病变有关，并与老年痴呆、肾功能衰竭、流产及糖尿病早亡有关，所以Hcy的体外检测具有重要的临床价值，可用于预测脑血管疾病发生的危险性。
[0003]Hcy测定是指测定血清或者血浆中总的同型半胱氨酸(tHcy)的含量。在血清或者血浆中，游离的或者说处于还原态的Hcy含量很低，仅占tHcy总量的2%左右，其他的均为结合的或者处于氧化态的Hey。其结合方式包括:自身氧化=Hcy-S-S-Hcy (5-10%)；与半胱氨酸(Cys)氧化:Hcy-S-S-Cys (5_10%);与白蛋白(Alb)中的半胱氨酸结合氧化:Hcy-S-S-Alb(70-90%)。
[0004]目前检测血浆中Hcy主要采用酶循环法，该法可以在自动生化分析仪上进行，测定灵敏度高，广泛应用于临床检验。酶循环法测定Hcy中，加入一定浓度的还原剂TCEP将氧化态的Hcy转化为还原态的Hcy，从而保证结果的准确性。
[0005]Hcy的测定需要一个准确、稳定的质控品来监控仪器状态及试剂的好坏。由于血清的不易获得性、成分的复杂性、可能带有HIV等病毒，导致无法采用血清作为基质制备Hcy质控品。而市场上常见的Hcy质控品多为水剂，与Hcy在血清中的存在状态有很大的区别，且存在稳定性差的问题:4°C放置I个月即有明显的下降，放置一年值降为原来的一半，给临床检验带来很大的困难。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种同型半胱氨酸质控品，该同型半胱氨酸质控品成分稳定，Hcy的存在状态与人血清中同，稳定性好，准确度高、抗干扰能力强，使用安全。
[0007]一种同型半胱氨酸质控品，包括高浓度品和低浓度品，所述高浓度品包括以下浓度的各组分:20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-1OmM金属螯合剂、0.1-5%(g/100mL)防腐剂、0.1-30% (g/100mL)糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为:还原态Hcyl-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70_90% ;所述低浓度品包括以下浓度的各组分:20-200mMpH7.0-7.5 的缓冲液、9g/L 氯化钠、0.1-1OmM 金属螯合剂、0.1-5% (g/100mL)防腐齐IJ、0.1-30% (g/100mL)糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为:还原态Hcyl-3%，Hcy-S-S-Hcy5_10%、Hcy-S-S-Cys5_10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。
[0008]作为优选，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或GOOD’ s缓冲液中的一种，进一步优选为磷酸盐缓冲液。
[0009]作为优选，所述金属螯合剂为EDTA、DTPA、EGTA、NTA中的一种。
[0010]作为优选，所述防腐剂为Proclin系列防腐剂、NaN3、G418、叠氮锂中的一种。
[0011]作为优选，所述糖类为海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡聚糖、葡萄糖、乳糖中的一种，进一步优选为海藻糖。
[0012]作为优选，所述多元醇为甘油、PEG4000、乙二醇中的一种，进一步优选为甘油。
[0013]所述高浓度品和低浓度品中的缓冲液、金属螯合剂、防腐剂、糖类或多元醇的种类相同。
[0014]本发明上述同型半胱氨酸质控品的制备方法，具有以下操作步骤:
[0015](I)高值制备:在20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液中加入5-10mML-半胱氨酸、30-50g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向反应液中加入0.001-0.lg/L同型半胱氨酸,于25°C _37°C下进行氧化反应1-10天,反应结束后18000rpmX30min离心取上清液；
[0016](2)高值稀释:采用步骤(I)中的缓冲液稀释上清液到高浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用步骤(I)中的缓冲液稀释上清液到低浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值；
[0017](3)稳定化处理:在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂
0.1-10禮、防腐剂0.1-5% (g/100mL)、糖类或多元醇0.1-30% (g/100mL)，在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.l-10mM、防腐剂0.l_5%(g/100mL)、糖类或多元醇0.1-30% (g/100mL)，并用HPLC定值，得到高浓度品和低浓度品。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果:本发明采用重组人白蛋白及L-半胱氨酸，与同型半胱氨酸发生氧化反应，使最终反应体系中还原态Hcy占总的同型半胱氨酸(tHcy)的 1-3%，Hcy-S-S-Hcy 占 5-10%、Hcy-S-S_Cys 占 5-10%、Hcy-S-S_Alb 占70-90%;然后氯化钠、金属螯合剂、防腐剂、糖类或多元醇的加入，使得制备成的液体质控品基质类似人血清，尽量模拟Hcy在血清中的存在状态，不仅质控品制剂的稳定性好，不易降解，保存时间长，而且由于质控品模拟人血清制备而成，同检测样品基质类似，所以检测准确度高，有效保证了临床检验需求。该质控品由于采用制备方法制成而成，加入的物质种类和含量可控，所以该质控品成分稳定，不存在在人血清中存在的有可能干扰检测结果的物质，抗干扰能力强，也不存在在人血清中存在的有可能导致不安全情况的物质(如HIV)，安全非常安全，可放心使用。
【具体实施方式】
[0019]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
[0020]实施例1:
[0021 ] 本实施例同型半胱氨酸质控品(10 ii M、35 ii M)，包括高浓度品和低浓度品，其中:高浓度品包括以下浓度的各组分:50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液、9g/L氯化钠、5mMEDTA、l%Proclin300、15%海藻糖、35iiM同型半胱氨酸，同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为:还原态 Hcyl-3%，Hcy-S-S-Hcy5_10%、Hcy-S-S-Cys5_10%、Hcy-S-S-Alb70_90% ；
[0022]低浓度品包括以下浓度的各组分:50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液、9g/L氯化钠、5mMEDTA、l%Proclin300、15%海藻糖、10 yM同型半胱氨酸，同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为:还原态 Hcyl-3%，Hcy-S-S-Hcy5_10%、Hcy-S-S-Cys5_10%、Hcy-S-S-Alb70-90%。
[0023]该同型半胱氨酸质控品的制备方法，具有以下操作步骤:
[0024](I)高值制备:在50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液中加入1.2g/LL_半胱氨酸、50g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向100ml反应液中加入0.0015g同型半胱氨酸，于37°C下进行氧化反应3天，反应结束后18000rpmX30min离心取上清液；
[0025](2)高值稀释:采用50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液稀释上清液到同型半胱氨酸浓度为35 PM，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液稀释上清液到同型半胱氨酸浓度为10 PM，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值；
[0026](3)稳定化处理:在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入9g/L氯化钠、5mMEDTA、l%Procl in300、15%海藻糖，在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入9g/L氯化钠、5mMEDTA、l%Proclin300、15%海藻糖，并用HPLC定值，得到本实施例同型半胱氨酸质控品(10 y M、35 u M)0
[0027]将上述同型半胱氨酸质控品(10 y M、35 y M)按照每个ImL分装，每月测定一次，每次重复3次，取平均值，数据如下:
[0028]
【权利要求】
1.一种同型半胱氨酸质控品，包括高浓度品和低浓度品，其特征在于:所述高浓度品包括以下浓度的各组分:20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液、9g/L氯化钠、0.1-1OmM金属螯合剂、0.1-5%防腐剂、0.1-30%糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为:还原态Hcyl-3%，Hcy-S-S-Hcy5-10%、Hcy-S-S-Cys5-10%、Hcy-S-S-Alb70_90% ;所述低浓度品包括以下浓度的各组分:20-200mMpH7.0-7.5 的缓冲液、9g/L 氯化钠、0.1-1OmM金属螯合剂、0.1-5% 防腐剂、0.1-30%糖类或多元醇、设定浓度的同型半胱氨酸，其中同型半胱氨酸的存在状态及各存在状态的比例为:还原态 Hcyl-3%，Hcy-S-S-Hcy5_10%、Hcy-S-S-Cys5_10%、Hcy-S-S-Alb70_90%。
2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或GOOD’ s缓冲液中的一种。
3.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述金属螯合剂为EDTA、DTPA、EGTA、NTA 中的一种。
5.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述防腐剂为Proclin系列防腐剂、NaN3、G418、叠氮锂中的一种。
6.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述糖类为海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡聚糖、葡萄糖、乳糖中的一种。
7.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述多元醇为甘油、PEG4000、乙二醇中的一种。
8.根据权利要求7所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述多元醇为甘油。
9.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品，其特征在于:所述高浓度品和低浓度品中的缓冲液、金属螯合剂、防腐剂、糖类或多元醇的种类相同。
10.权利要求1所述的同型半胱氨酸质控品的制备方法，其特征在于:具有以下操作步骤: (1)高值制备:在20-200mMpH7.0-7.5的缓冲液中加入5_10mML-半胱氨酸、30_50g/L重组人白蛋白，混匀使形成反应液，向反应液中加入0.001-0.lg/L同型半胱氨酸，于250C _37°C下进行氧化反应1-10天，反应结束后离心取上清液； (2)高值稀释:采用步骤(I)中的缓冲液稀释上清液到高浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到高浓度同型半胱氨酸溶液，采用步骤(I)中的缓冲液稀释上清液到低浓度品所需同型半胱氨酸浓度，得到低浓度同型半胱氨酸溶液，并用HPLC对高浓度同型半胱氨酸溶液和低浓度同型半胱氨酸溶液进行定值； (3)稳定化处理:在高浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.l-10mM、防腐剂0.1_5%、糖类或多元醇0.1_30%，在低浓度同型半胱氨酸溶液中加入氯化钠9g/L、金属螯合剂0.1-10禮、防腐剂0.1_5%、糖类或多元醇0.1-30%,并用HPLC定值，得到高浓度品和低浓度品。
【文档编号】G01N35/00GK103575921SQ201310583529
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】邹炳德, 贾江花, 邹继华, 周海滨 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司