茶尺蠖血细胞的染色液及其染色方法
【专利摘要】本发明提供了一种茶尺蠖血细胞的染色液及其染色方法，染色液包括瑞氏粉和茶多酚粉，瑞氏粉和茶多酚粉的质量比为4～8∶1；瑞氏粉和茶多酚粉配制的染色液染色时间为1-3min，磷酸缓冲液染色时间为5-10min。本发明提供的专用于鉴别茶尺蠖血细胞的染色液和染色方法，对鉴别茶尺蠖血细胞的种类，具有快捷、准确、直观的特点，丰富了茶尺蠖生理生化研究技术。对进一步深入研究茶尺蠖病毒等生物防治措施的入侵规律、生物防治药物筛选等有重要意义。
【专利说明】茶尺蠖血细胞的染色液及其染色方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞的染色液和染色方法，尤其涉及茶尺蠖幼虫血淋巴中的血细胞的染色分离鉴定方法。
【背景技术】
[0002]昆虫作为生物界分布最广、数量众多的一类群体，在长期的进化过程中具备了高度的适应能力和独特的免疫体系。昆虫的免疫包括体液免疫和细胞免疫两个部分。细胞免疫主要表现为血细胞介导免疫反应,如吞噬、结节、包囊等,另外也负责清除体内凋亡细胞和组织碎片，从而参与组织重建和器官修复。而体液免疫作用则产生许多抗菌性的蛋白质和多肽，是防御体系的重要组成成分。
[0003]有关昆虫血细胞的研究很多，研究内容涉及到10个目100多个种以上。但是昆虫血细胞形态多样，变异复杂，不仅给血细胞的分类带来困难，而且还影响了对其生理功能、生化等方面深入的研究。近年来，在昆虫血细胞数量变动、形态结构观察、生理、生化、免疫学及分子生物学等方面的研究取得了新的进展，而对其的研究手段不尽相同。研究手段主要为染色方法与显微观察技术的不同。常用的染色方法是有丫啶橙、碘化丙啶、中性红、苏木精、吉姆萨染色、瑞氏染色、以及吉-瑞混染等。显微观察手段主要采用光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、扫描电子显微镜以及透射电子显微镜等技术。
[0004]鉴于目前鳞翅目诸如棉铃虫、家蚕、斜纹夜蛾等害虫血细胞的研究虽已有报道，但不同昆虫种类的生理生化等特性均有其特殊性。而茶尺蠖作为重要的茶树害虫在其他方面的研究都有卓越的进展，茶尺蠖的血细胞染色方法将有利于对其血细胞做更为深入的研究，进而对血细胞的免疫作用更深入的了解，为茶尺蠖的抗干扰能力提供依据，为防治茶尺蠖药物的研究提供参考，最终为茶尺蠖的致病机制等一系列问题找到解答途径。而目前常用的染色法，同时染色细胞核、细胞质的效果不佳，存在界限不清，胞质颗粒染色效果差等问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种胞质胞核同时具有好的染色效果的染色液及染色方法，特别适用于茶尺蠖血淋巴中的血细胞。
[0006]本发明的目的是通过这样的技术方案实现的:
[0007]茶尺蠖血细胞的染色液，包括瑞氏粉(Wright)和茶多酚粉(TP)，瑞氏粉和茶多酚粉的质量比为4?8:1，染色时间为I?3min。优选地，瑞氏粉和茶多酚粉的质量比为6:I，染色时间为3min。
[0008]上述茶尺蠖血细胞的染色液，包括瑞氏粉、茶多酚粉、甘油和甲醇配制的瑞氏-茶多酚染液；甘油为瑞氏粉和茶多酚粉总重量的10倍体积，甲醇为瑞氏粉和茶多酚粉总重量的500倍体积。此染色液既具有好的染色效果，又可延长染色液的使用期限，一股可存放I
年左右。[0009]使用上述茶尺蠖血细胞染色液的染色方法，瑞氏粉和茶多酚粉配制的染色液染色时间为I~3min,磷酸缓冲液染色时间为5~lOmin。
[0010]上述茶尺蠖血细胞的染色方法，包括以下步骤:
[0011]?配制试剂:
[0012]瑞氏-茶多酚染液:取瑞氏粉和茶多酚粉，按照4~8:1的质量比，放入研钵中，再加入瑞氏和茶多酚粉总重量10倍体积的甘油，研磨直至无颗粒为止，溶入瑞氏和茶多酚粉总重量500倍体积的甲醇；
[0013]磷酸缓冲液:10g/L的磷酸二氢钾，10g/L的磷酸氢二钠，PH6.8~7.4 ;
[0014]?取样:茶尺蠖幼虫冰浴lOmin，取腹足的血淋巴液；
[0015]?染色:将染色液滴于步骤(1)的血淋巴液上，染色l_3min后，加磷酸缓冲液于血淋巴液的染色液中，染色5~lOmin，冲洗，晾干。
[0016]具体地，上述茶尺蠖血细胞的染色方法，包括以下步骤
[0017]?配制试剂:
[0018]瑞氏-茶多酚染液:按照4~8:1的质量比取瑞氏粉和茶多酚粉，放入研钵中，再加入瑞氏和茶多酚粉总重 量10倍体积的甘油，研磨直至无颗粒为止，溶入瑞氏和茶多酚粉总重量500倍体积的甲醇；
[0019]磷酸缓冲液:10g/L的磷酸二氢钾，10g/L的磷酸氢二钠，PH6.8~7.4 ;
[0020]?取样:茶尺蠖幼虫用蒸馏水清洗干净后，用75%的酒精消毒，冰浴IOmin后，剪去一个腹足，滴一滴血淋巴到经乙醇清洁的载玻片上，备用。
[0021]?染色:待茶尺蠖幼虫血淋巴液自然干燥后，滴瑞氏-茶多酚染色液数滴，染色l-3min，然后加上述磷酸缓冲液于染色液中，混匀，染色5-10min，自来水冲洗，晾干，封藏。
[0022]有益效果
[0023]1.本发明提供的专用于鉴别茶尺蠖血细胞的染色液和染色方法，对鉴别茶尺蠖血细胞的种类，具有快捷、准确、直观的特点，丰富了茶尺蠖生理生化研究技术。对进一步深入研究茶尺蠖病毒等生物防治措施的入侵规律、生物防治药物筛选等有重要意义。
[0024]2.本发明染色的茶尺蠖血细胞染色清晰、均匀，细胞核和细胞质对比明显，细胞轮廓清晰，便于观察和鉴定。
[0025]3.本发明既具有防止血淋巴黑化功能，又保持了茶尺蠖血细胞的活性，尽可能的维持细胞原始的生命状态，以使染色结果能够直观、真实的反映细胞的免疫、抗干扰等生理生化性能。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1-2是瑞氏-茶多酚染液配比为6:1，染色时间为3min后，滴加PBS染色5min的染色结果；
[0027]图3是瑞氏-茶多酚染液配比为6:1，染色时间为3min后，滴加PBS染色IOmin的
染色结果；
[0028]图4是瑞氏-茶多酚染液配比为8:1，染色时间为3min后，滴加PBS染色5min的
染色结果；
[0029]图5是瑞氏-茶多酚染液配比为8:1，染色时间为3min后，滴加PBS染色IOmin的染色结果；
[0030]图6是瑞氏-茶多酚染液配比为5:1，染色时间为3min后，滴加PBS染色5min的
染色结果；
[0031]图7是瑞氏-茶多酚染液配比为5:1，染色时间为3min后，滴加PBS染色IOmin的
染色结果；
[0032]图8是是瑞氏-茶多酚染液配比为4:1，染色时间为3min后，滴加PBS分别染色5?IOmin的染色结果。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明做详细说明，但不仅限如此。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0034]实施例1
[0035]瑞氏-茶多酚染液的配制:按照4:1的比例取瑞氏粉和茶多酚粉共0.5g，放入研钵中，再加入5mL甘油，研磨至无颗粒为止，溶入250mL甲醇，用脱脂棉过滤后，放置阴暗处，充分溶解，一股I个月以上为宜。
[0036]取茶尺蠖4?5龄幼虫，用蒸馏水清洗干净后，用75%酒精消毒，再冰浴lOmin，手术剪剪去一个幼虫腹足，滴一滴血淋巴液于经乙醇清洁后的载玻片上，以盖玻片的一边接触血滴，然后以45。夹角紧贴载玻片向右移动拉成均匀的一层血膜。在晾干的血膜上滴加上述瑞氏-茶多酚染液，至覆盖整个血膜，多余染液用滤纸吸去，染色I?3min。然后加入覆于血膜上瑞氏-茶多酚染液体积2-4倍的磷酸缓冲液(PH6.8?7.4)于混合染液上，用移液枪头轻轻混匀(不碰到载玻片为宜)，继续染色5?IOmin后，控制自来水水流，成小股，慢慢冲洗(以免将大量的血细胞从载玻片上冲落下来从而影响以后的观察)，至载玻片表面不再有染色液。放到阴凉处晾干后，用中性树胶封片。于1000倍光学显微镜下观察。
[0037]实施例2
[0038]瑞氏-茶多酚染液的配制:取瑞氏粉和茶多酚粉共0.3g，分别按照5:1的比例，放入研钵中，再加入3mL甘油，研磨直至无颗粒后，溶入150mL甲醇，用脱脂棉过滤后，放置阴暗处，充分溶解，一股I个月以上为宜。
[0039]具体染色过程同实施例1。
[0040]实施例3
[0041]瑞氏-茶多酚染液的配制:按照6:1的比例取瑞氏粉和茶多酚粉共0.35g，放入研钵中，再加入3.5mL甘油，研磨至无颗粒后，溶入175mL甲醇，用脱脂棉过滤后，放置阴暗处，充分溶解，一股I个月以上为宜。
[0042]具体染色过程同实施例1。
[0043]实施例4
[0044]瑞氏-茶多酚染液的配制:按照8:1的比例取瑞氏粉和茶多酚粉共0.36g，放入研钵中，再加入3.6mL甘油，研磨直至无颗粒后，溶入ISOmL甲醇，用脱脂棉过滤后，放置阴暗处，充分溶解，一股I个月以上为宜。
[0045]具体染色过程同实施例1。[0046]表1是根据实施例所给的瑞氏-茶多酚染色液(W-G)不同配比、染色时间及磷酸缓冲液(PBS)不同染色时间对血细胞(以浆血细胞为例)染色效果的对比情况。
[0047]表1
[0048]
【权利要求】
1.一种茶尺蠖血细胞的染色液，其特征在于:包括瑞氏粉和茶多酚粉，瑞氏粉和茶多酹粉的质量比为4~8:1,染色时间为l-3min。
2.如权利要求1所述的茶尺蠖血细胞的染色液，其特征在于:瑞氏粉和茶多酚粉的质量比为6:1,染色时间为3min。
3.如权利要求1或2所述的茶尺蠖血细胞的染色液，其特征在于:包括瑞氏粉、茶多酚粉、甘油和甲醇配制的瑞氏-茶多酚染液，以及磷酸缓冲液；甘油为瑞氏粉和茶多酚粉总重量的10倍体积，甲醇为瑞氏粉和茶多酚粉总重量的500倍体积，磷酸缓冲液为瑞氏-茶多酚染液体积的2~4倍；所述磷酸缓冲液为10g/L磷酸二氢钾，10g/L磷酸氢二钠，PH6.8~7.4。
4.使用权利要求3所述的茶尺蠖血细胞的染色液的染色方法，其特征在于:瑞氏-茶多酚染液染色时间为l_3min，磷酸缓冲液染色时间为5-10min。
5.如权利要求4或5所述的茶尺蠖血细胞的染色液的染色方法，包括以下步骤: ?配制试剂: 瑞氏-茶多酚染液:取瑞氏粉和茶多酚粉，按照4~8:1的质量比，放入研钵中，再加入瑞氏和茶多酚粉总重量10倍体积的甘油，研磨直至无颗粒为止，溶入瑞氏和茶多酚粉总重量500倍体积的甲醇； 磷酸缓冲液:10g/L的磷酸二氢钾，10g/L的磷酸氢二钠，PH6.8^7.4 ； ?取样:茶尺蠖幼虫冰浴lOmin，取腹足的血淋巴液； ?染色:将染色液滴于血淋巴液上，染色l_3min后，加磷酸缓冲液于血淋巴液的染色液中，染色5-1Omin,冲洗,晾干。
6.如权利要求6所述的茶尺蠖血细胞的染色液的染色方法，包括以下步骤: ?配制试剂: 瑞氏-茶多酚染液:按照4~8:1的质量比取瑞氏粉和茶多酚粉，放入研钵中，再加入瑞氏和茶多酚粉总重量10倍体积的甘油，研磨直至无颗粒为止，溶入瑞氏和茶多酚粉总重量500倍体积的甲醇； 磷酸缓冲液:10g/L的磷酸二氢钾，10g/L的磷酸氢二钠，PH6.8^7.4 ； ?取样:茶尺蠖幼虫用蒸馏水清洗干净后，用75%的酒精消毒，冰浴IOmin后，剪去一个腹足，滴一滴血淋巴到经乙醇清洁的载玻片上，备用； ?染色:待茶尺蠖幼虫血淋巴液自然干燥后，滴瑞氏-茶多酚染色液染色l_3min，然后加上述磷酸缓冲液于染色液中，混匀，染色5-10min，自来水冲洗，晾干，封藏。
【文档编号】G01N1/30GK103792126SQ201310586918
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】王晓庆, 彭萍, 冉烈, 胡翔 申请人:重庆市农业科学院