一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法
【专利摘要】一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法属于城市污水处理中影响因素范畴。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定，具体涉及试剂的制备、标准曲线的测定、污泥的预处理、蛋白质的提取与测定等步骤。本发明提供了一种简捷、高效测定污泥中蛋白质含量的方法。
【专利说明】一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于城市生活污水处理与再生领域，具体涉及污泥中蛋白质的提取与测定方法。
【背景技术】
[0002]随着我国城市化、工业化进程的加快，水污染及生态环境不断恶化，给人民的生产生活带来严重影响。近年 来，国家加大了对水环境的治理力度，污水处理得到了很大提高，然而所面临的水污染问题仍没有得到根本解决，其中最主要的就是氮磷的去除问题。
[0003]污水的脱氮除磷主要采用活性污泥法和生物膜法，控制污水处理效果的参数主要有T、pH、D0、SRT等，并且随着研究的深入，研究人员发现，通过测量污泥中的蛋白质和多糖的含量，亦能够反映其处理效果，因此人们开始对污泥的组分进行分析研究。
[0004]胞外聚合物，又称EPS，是微生物在一定条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的聚合化合物，包括荚膜、粘液层以及其他表面物质。EPS具有复杂的化学组成，包括蛋白质、多糖、核酸、糖醛酸、脂类、氨基酸、腐殖酸等物质，其中蛋白质和多糖是其主要成分，占EPS总量的70%~80%。EPS具有重要的生理功能，对于污泥的物理化学性质产生重大影响，可影响污泥的表面特性、污泥的絮体结构、污泥表面电荷、絮凝过程、沉降性能以及脱水过程，同时影响污泥对金属离子、非金属离子和大分子物质的吸附性能，在废水生物处理领域有较好的研究价值和应用前景。
[0005]胞外聚合物是MBR膜污染防治的一个重点内容，同时适量的EPS能够促进污泥的颗粒化，并且对重金属的吸附和生物除磷都有较好的效果，因此准确测定EPS中各种成分及含量的关系，是分析研究其作用的重要前提条件。
【发明内容】
[0006]本发明旨在寻找一种简捷、高效的提取方法，便于确定EPS中蛋白质的含量。
[0007]本发明采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。具体操作步骤如下:
[0008]1)试剂的制备:将0.1000g考马斯亮蓝G-250溶于50ml体积百分比浓度为95%乙醇溶液中，加入100ml质量百分比浓度为85%的浓磷酸，然后用蒸馏水补充至200ml，得到Bradford储备液，此储备液放置在4°C冰箱中，可稳定保存6个月。使用时，按体积比为1:5的比例用蒸懼水稀释Bradford储备液，即200ml储备液加800ml蒸懼水，得到Bradford使用液；配制0.15mol/L的NaCl溶液；
[0009]2)标准曲线的测定:首先确定牛血清蛋白的纯度，配制浓度为100ug/ml的蛋白溶液。所购牛血清蛋白纯度≥98%，因此可称取0.1000g牛血清蛋白溶于玻璃烧杯中，并移至1000mL的容量瓶中，蒸馏水定容，配制100 μ g/mL的牛血清蛋白标准液；在试管中分别加Λ 0.00,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.0OmL 牛血清蛋白溶液，不足 lml 者，添加 0.15mol/L的NaCl溶液使成lml ;然后加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀；显色5-8min后，用分光光度计在λ =595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，获得校正吸光度值，并以此绘制标准曲线；标准曲线如图1所示。
[0010]3)污泥的预处理:取50ml污泥样品于离心管中；另取一离心管，加自来水与污泥样品配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min ;倒掉上清液,加入磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液Na3P04浓度为0.05mol/L, NaCl浓度为0.15mol/L且pH值为7，将污泥稀释至原体积；然后将污泥摇散，超声处理3min ；
[0011]4)蛋白质的提取:将预处理的污泥放在80°C水浴锅内，加热30min，每隔lOmin将污泥摇匀一次；然后冷却配平；最后在8000r/min离心机内离心15min，取上清液测定，剩余污泥测定MLSS和MLVSS ；
[0012]5)蛋白质的测定:取一定体积待测溶液于试管中，加入0.15mol/L的溶液使成lml ;再加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀，另取lmlNaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照；显色5_8min后，用分光光度计在λ =595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量。
[0013]为了提高测定结果的准确性和可靠性，测定时，将包括空白在内的每个样品做三个平行样进行对照。
[0014]本发明与现有的蛋白质测定方法相比，具有以下优点:
[0015]1)本发明综合了不同类型的蛋白质提取方法，步骤简捷、易于操作，并且能够温和、高效地提取出污泥中的蛋白质，同时不引起细胞的破裂或溶解；
[0016]2)本发明测试灵敏度高，平行性好，测量时段内，颜色稳定，能够准确测定污泥中蛋白质的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是蛋白质的标准曲线图
[0018]图2是亚硝化颗粒污泥的蛋白质含量图
[0019]图3是MBR活性污泥的蛋白质含量图
【具体实施方式】
[0020]取第10天、第20天和第40天的亚硝化颗粒污泥及MBR活性污泥作为样品，测量其中的蛋白质含量。
[0021]污泥的预处理:将样品放置于50ml离心管中；另取一离心管，加自来水与污泥样品配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min ;倒掉上清液,加入由0.05mol/L Na3P0j[I
0.15mol/L NaCl组成且pH值为7的磷酸盐缓冲溶液，将污泥稀释至原体积；然后将污泥摇散，超声处理3min。
[0022]蛋白质的提取:将预处理后的亚硝化颗粒污泥和MBR污泥放在80 V水浴锅内，加热30min，每隔lOmin将污泥摇匀一次；然后冷却配平；最后在8000r/min离心机内离心15min，取上清液测定蛋白质含量，剩余污泥测定MLSS和MLVSS。[0023]蛋白质的测定:分别取0.lmL的亚硝化颗粒污泥样品和0.2mL的MBR活性污泥样品于试管中，添加NaCl溶液使成lml，再加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇勻，另取lml NaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照；显色5_8min后,用分光光度计在λ=595ηπι测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量，每个样品做三个平行样。
[0024]亚硝化颗粒污泥的蛋白质含量参看附图2，MBR活性污泥的蛋白质含量参看附图3。
【权利要求】
1.一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法，其特征在于:1)试剂的制备:将0.1000g考马斯亮蓝G-250溶于50ml体积百分比浓度为95%乙醇溶液中，加入100ml质量百分比浓度为85%的浓磷酸，然后用蒸馏水补充至200ml，得到Bradford储备液,使用时，按体积比为1:5的比例用蒸懼水稀释Bradford储备液，即200ml储备液加800ml蒸馏水，得到Bradford使用液；配制0.15mol/L的NaCl溶液；2)标准曲线的测定:称取0.1000g牛血清蛋白溶于玻璃烧杯中，并移至1000mL的容量瓶中，蒸馏水定容，配制100μ g/mL的牛血清蛋白标准液；在试管中分别加入0.00,0.10、.0.20,0.40,0.60,0.80、1.00mL牛血清蛋白溶液，不足lml者，添加0.15mol/L的NaCl溶液使成lml ;然后加入5.0ml Bradford使用液，立即用镟润振荡器摇勻；显色5_8min后，用分光光度计在λ=595ηπι测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，获得校正吸光度值，并以此绘制标准曲线；3)污泥的预处理:取50ml污泥样品于离心管中；另取一离心管，加自来水与污泥样品配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min ;倒掉上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液Na3P04浓度为0.05mol/L,NaCl浓度为0.15mol/L且pH值为7，将污泥稀释至原体积；然后将污泥摇散，超声处理3min ；4)蛋白质的提取:将预处理的污泥放在80°C水浴锅内，加热30min，每隔lOmin将污泥摇匀一次；然后冷却配平；最后在8000r/min离心机内离心15min，取上清液测定，剩余污泥测定 MLSS 和 MLVSS ；5)蛋白质的测定:取一定体积待测溶液于试管中，加入0.15mol/L的NaCl溶液使成lml ;再加入5.0ml Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀，另取lml NaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照；显色5_8min后，用分光光度计在λ =595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量。
【文档编号】G01N21/78GK103674942SQ201310598562
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】李冬, 张玉龙, 范丹, 张肖静, 梁瑜海, 何永平, 张翠丹, 吴青, 门绚, 杨胤, 苏庆岭, 周元正, 曾辉平, 张 杰 申请人:北京工业大学