一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法【专利摘要】一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，包括以下步骤：（1）CdTe量子点的制备；（2）用于检测反应的母液配制；（3）量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立；（4）检测大米谷蛋白样品时的前处理。本发明中的制备CdTe量子点的原料价格较低，量子点制备简单，采用量子点快速测定大米谷蛋白含量时用量少，检测成本低。【专利说明】一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种测定大米谷蛋白含量的方法，尤其是涉及一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法。【
背景技术：
】[0002]大米蛋白被公认为优质食用蛋白，最初Osborne(1924年)根据溶解性质将大米蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中谷蛋白和醇溶蛋白也叫贮藏蛋白，是大米中的主要蛋白成分，谷蛋白占总蛋白的80%以上(OsborneTB.TheVegetableProteins,2nded[Μ].NewYork:Longmans,Green&Co,1924,154.)。从营养学分析，大米蛋白中只有谷蛋白和球蛋白能被人体消化吸收(KumamaruT,SatohH,LwataN,etal.Mutantsforricestorageproteins[J].THEORAPPLGENET,1988,76:11-16.)，而且，在谷蛋白中，稻米第一限制性氨基酸一赖氨酸(Lys)含量最高，因而谷蛋白不但本身具有较高的营养价值，而且其在大米中的含量能间接反映大米整体的营养价值，因此，建立一种快速检测大米谷蛋白含量的方法可以便捷、准确、可靠的鉴定大米营养品质，为大米品质评级、大米食品安全鉴定提供可靠依据。[0003]现有国内大米蛋白的检测方法主要为一凯氏定氮法(KjeldahlMethod),国外有少量利用考马斯亮蓝G2250和大米谷蛋白结合，产物引起染料最大吸收峰，反应的速率约2min，产物稳定性也较好(约Ih)，但存在灵敏度较低，选择性较差且检测成本高等问题，在大规模工业生产应用上还存在很大的局限性。【
发明内容】[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种灵敏度和回收率高，选择性和重复性好，操作简便，适于广泛使用的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法。[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，包括以下步骤:(I)CdTe量子点的制备称取15~30mgTe粉、2(T60mgNaBH4放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入ImL蒸馏水，注射器针头留在玻璃瓶的盖子上，且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖，低温2~8°C避光反应2飞小时，获反应前体物质；称取20(T260mgCdCl2和28(T360mg2-巯基乙胺，将其溶于160mL蒸馏水，然后采用0.5^1.5moI/L盐酸将混合溶液pH调至5飞.5，混合溶液再转入三颈烧瓶中；向三颈烧瓶通入N2，磁力搅拌混合溶液，待混合溶液温度上升至85、8°C，冷凝回流，反应2(T40min后，注入反应前体物质，反应6(Tl20min，获得CdTe量子点；CdTe量子点的粒径大小、形态和性质分析:采用高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)对CdTe量子点粒径大小和形态进行表征；将CdTe量子点分别置于不同pH、温度和NaCl离子强度条件下，分析CdTe量子点的荧光强度变化；将CdTe量子点分别置于不同pH条件下为3~11(3、4、5、6、7、8、9、10和11);不同温度条件下为0~55V(01:、251:、351:、451:和55°0;不同恥(:1离子强度条件下为0.1~0.9mol/L(0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L)；(2)用于检测反应的母液配制在IOOmL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，获得pHll的检测反应的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，浓度均为0.04mol/L；(3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立大米谷蛋白校准液的制备，即将大米谷蛋白溶于步骤(2)所得母液中，配制成浓度为0.004~0.132mg/L的大米谷蛋白校准液(0、0.004,0.02,0.036,0.052,0.068,0.084,0.1、0.116和0.132mg/L)，利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点(浓度>0.1g/L)在1OmL棕色瓶避光的条件下反应2(T40min，采用荧光光谱仪在激发波长365nm，夹缝宽度5nm，发射波长550nm，夹缝宽度5nm，根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线，并进行非线性拟合，以此作为大米谷蛋白检测标准方法；检测方法的特异性和回收率分析:分别准确称取1.00mg大米谷蛋白和0.05mg、0.50mg和5.00mg大米清蛋白，将谷蛋白和清蛋白一起添加到步骤(2)所得50mL反应的母液中，混合均匀，其余测定操作程序参考大米谷蛋白检测标准方法，确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰；另外检验Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Cr和S042_对谷蛋白测定的干扰试验；(4)检测大米谷蛋白样品时的前处理大米粉碎:每次称取准备好的原料大米，放入粉碎机里研磨1-3min，磨成粉末状后，取50g大米粉末，加pHll的NaOH溶液浸泡提取2~3h，再用离心机4500~6500r/min离心15^25min，收集蛋白上清液，采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。[0006]本发明之基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，可以简便、快速的测定大米中的谷蛋白的含量，和现有的凯氏定氮法和考马斯亮蓝法相比，能提高灵敏度、回收率和抗干扰能力，缩短检测时间，提高检测效率。[0007]本方法采用CdTe量子点作为荧光探针与大米谷蛋白进行反应，根据不同浓度的大米谷蛋白与稍过量的CdTe量子点反应时，导致CdTe量子点荧光强度有规律性的变化而建立测定蛋白的含量方法，与现有技术中采用的考马斯亮蓝G2250法相比，具有以下优势:其一、灵敏度高，最低蛋白质检测量可达0.4yg;其二、抗干扰能力强，特别是抗大米中清蛋白的干扰，这样能有效提高检测大米样品中谷蛋白的准确度；其三、CdTe量子点制备简单，受环境温度的影响小，因此对检测环境要求低，而且每次检测用量少，一次性制备的量子点可常温避光长期贮藏备用；其四、量子点测定大米谷蛋白含量的操作简便，使用时间较短(20min),提闻了检测的效率。[0008]本发明中的制备CdTe量子点的原料价格较低，量子点制备简单，采用量子点快速测定大米谷蛋白含量时用量少，检测成本低。【专利附图】【附图说明】[0009]图1为本发明之CdTe量子点高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)观察图；图2为pH对CdTe量子点荧光强度的影响图；图3为温度对CdTe量子点荧光强度的影响图；图4为NaCl浓度对CdTe量子点荧光强度的影响图；图5为不同浓度的谷蛋白标准溶液对CdTe量子点荧光强度的影响；注:a—j对应谷蛋白标准溶液的浓度分布是0,0.004,0.02,0.036,0.052,0.068,0.084,0.1,0.116,0.132mg/L；图6为量子点快速测定大米中谷蛋白含量的标准曲线图。[0010]【具体实施方式】以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。[0011]实施例1本实施例包括以下步骤:(I)CdTe量子点的制备:称取25mgTe粉、40mgNaBH4放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入ImL蒸馏水，注射器针头留在玻璃瓶的盖子上，且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖，低温4°C避光反应4小时,获反应前体物质；称取200mgCdCl2和28011^2-巯基乙胺，将其溶于160mL蒸馏水，然后采用lmol/L盐酸将混合溶液PH调至5.5，混合溶液再转入三颈烧瓶中；向三颈烧瓶通入N2，磁力搅拌混合溶液，待混合溶液温度上升至90°C，冷凝回流，反应40min后,注入反应前体物质,反应60min,获得CdTe量子点；CdTe量子点粒径大小、形态和性质分析采用高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)对CdTe量子点粒径大小和形态进行表征，结果如图1，表明CdTe量子点呈现球状，平均粒径大小为7nm，粒度分布均匀。将CdTe量子点分别置于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10和11)下测试荧光强度，结果如图2，表明CdTefi子点在碱性条件下荧光特性较好。将CdTe量子点分别置于不同温度条件下(0、25、35、45和55°C)测试荧光强度，结果如图3，表明CdTe量子点在温度0-55°C荧光强度高。将CdTe量子点分别置于不同NaCl离子强度条件下(0.1,0.3,0.5,0.7,0.9mol/L)测试荧光强度，结果如图4所示，结果表明NaCl离子强度在0.1-0.5mol/L内对CdTe量子点的荧光强度影响不明显，NaCl离子强度在0.7~0.5mol/L内对CdTe量子点的荧光强度影响较大，因此采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量要求NaCl浓度<0.5mol/L。[0012](2)用于检测反应的母液配制在IOOmL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，获得pHll的检测反应的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，浓度均为0.04mol/L。[0013](3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立在10个25mL容量瓶中，编号为O—9，首先分别添加步骤(2)所制得的反应母液2.0mL(含约3μg/L量子点)，在编号O~9的容量瓶中分别加入谷蛋白，并用pH11.0的母液稀释至刻度，摇匀，最终定容后编号O~9的容量瓶中谷蛋白浓度分别是，0.000,0.004、0.020,0.036,0.052,0.068,0.084,0.100,0.116,0.132mg/L,在25°C温度下避光反应20min，在激发波长365nm(夹缝宽度5nm)，发射波长550nm(夹缝宽度5nm)的条件下测定，实验重复三次，结果如图4，结果表明量子点强度随谷蛋白浓度增加呈现有规律的增加，且呈线性关系，结果如图5，回归系数#为0.9985，说明线性关系良好，建立检测谷蛋白的直线回归方程为7=3143^+187.74。检测灵敏度达4μg，检测范围为0.004~0.132mg/L。[0014]检测方法的特异性和回收率分析分别准确称取1.00mg大米谷蛋白和0.05mg、0.50mg和5.00mg大米清蛋白，将谷蛋白和清蛋白一起添加到50mL的母液中，混合均匀，其余测定操作参考上述大米谷蛋白检测标准方法，确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰。另外检验Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、CF和SO/—对谷蛋白测定的干扰试验。上述共存物质对检测的干扰如表1。[0015]【权利要求】1.一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)CdTe量子点的制备称取15~30mgTe粉、2(T60mgNaBH4放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入ImL蒸馏水，低温2~8°C避光反应2飞小时，获反应前体物质；称取20(T260mgCdCl2和28(T360mg2-巯基乙胺，将其溶于160mL蒸馏水，然后采用0.5^1.5moI/L盐酸将混合溶液pH调至5飞.5，混合溶液再转入三颈烧瓶中；向三颈烧瓶通入N2，磁力搅拌混合溶液，待混合溶液温度上升至85、8°C，冷凝回流，反应2(T40min后，注入反应前体物质，反应6(Tl20min，获得CdTe量子点；(2)用于检测反应的母液配制在IOOmL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，获得pHll的检测反应的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，浓度均为0.04mol/L；(3)量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立大米谷蛋白校准液的制备，即将大米谷蛋白溶于步骤(2)所得母液中，配制成浓度为.0.004~0.132mg/L的大米谷蛋白校准液(0、0.004,0.02,0.036,0.052,0.068,0.084,0.1、.0.116和0.132mg/L)，利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点(浓度>0.1g/L)在IOmL棕色瓶避光的条件下反应2(T40min，采用荧光光谱仪在激发波长365nm，夹缝宽度5nm，发射波长550nm，夹缝宽度5nm，根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线，并进行非线性拟合，以此作为大米谷蛋白检测标准方法；(4)检测大米谷蛋白样品时的前处理大米粉碎:每次称取准备好的原料大米，放入粉碎机里研磨1~3min，磨成粉末状后，取50g大米粉末，加pHll的NaOH溶液浸泡提取2~3h，再用离心机4500~6500r/min离心15^25min，收集蛋白上清液，采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。【文档编号】G01N21/64GK103604790SQ201310615554【公开日】2014年2月26日申请日期:2013年11月28日优先权日:2013年11月28日【发明者】孙术国,林亲录,杨涛,徐友志,丁玉琴,罗非君,周慧,翁光辉申请人:中南林业科技大学