单克隆抗体免疫比浊定量检测α-葡聚糖的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测α-葡聚糖的试剂盒，包括α-葡聚糖抗体冻干粉剂、抗体稀释液、样品稀释液以及标准品，α-葡聚糖抗体冻干粉剂是从注射保藏编号为CCTCCC2010107杂交瘤细胞株D9的小鼠腹水中纯化的IgM型单克隆抗体的冻干粉。本发明的定量检测试剂盒，具有操作简便，具有重复性好、灵敏度高、试验条件简单的特点，适宜用于测定反应体系中析出的α-葡聚糖免疫复合物，蔗汁、原糖、白砂糖、赤砂糖、糖浆、糖蜜等制糖工艺过程。
【专利说明】单克隆抗体免疫比浊定量检测Ct -葡聚糖的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高分子定量检测试剂盒，特别涉及单克隆抗体免疫比浊定量检测 葡聚糖的试剂盒。
【背景技术】
[0002]α -葡聚糖是一种完全由葡萄糖单体组成的多糖，分子式((C6HltlO5)n),分子量一般在几万至几百万之间，通常为白色的无定性粉末固体，呈胶粘状，粘度随分子量和浓度的增加而增加，无臭无味，易溶于水，溶解性随分子量的增加而下降。在常温、中性溶液中可稳定存在，遇强酸分解，在碱性溶解中其端基易被氧化，受热时可逐渐变色或分解。
[0003]从蔗汁到精制产品，制糖工艺过程自始至终存在着葡聚糖引起的不良影响，葡聚糖会引起糖份损失，明显增大糖液的粘度，降低糖液的过滤性，使蔗糖结晶时生成异常形态的晶体，增加精炼成本，同时也严重影响糖的品质，影响产品的适用性。因此，葡聚糖的实时监测成为糖厂生产控制的一个重要技术。
[0004]制糖工业中α-葡聚糖的测定一般可用Haze/ICUMSA法、Robert’s铜法、PoticalActivity Ltd.DASA法、酶解法等。但这些方法都有较大的局限性，如准确度不高、操作繁琐、不适用所有糖品等缺点。
[0005]免疫学检测法具有特异性高，操作方便，结果可信等优点，是当前α-葡聚糖的定量分析的主要发展方向。然而现有技术中缺乏性能优异的抗体，也未有实际可用的定量检测α-葡聚糖的试剂盒。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种单克隆抗体免疫比浊定量检测α -葡聚糖的试剂盒。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种定量检测α-葡聚糖的试剂盒，包括α-葡聚糖抗体冻干粉剂、抗体稀释液、样品稀释液以及标准品，α -葡聚糖抗体冻干粉剂是从注射保藏编号为CCTCC C2010107杂交瘤细胞株D9的小鼠腹水中纯化的IgM型单克隆抗体的冻干粉。
[0008]作为本发明的进一步改进，样品稀释液为pH为6.5?7.8，浓度为0.01?
0.02mol/L的PBS溶液，PBS溶液中添加有质量浓度为了 0.1?5%的反应促进剂，反应促进剂为非离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。
[0009]作为本发明的进一步改进，上述的检测试剂盒中所使用的非离子型表面活性剂选自PEG2000、PEG4000、PEG6000、吐温。阳离子型表面活性剂选自十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵。
[0010]作为本发明的进一步改进，上述的检测试剂盒中所使用的抗体稀释液为PH为
6.5?7.8，浓度为0.01?0.02mol/L的PBS溶液。
[0011]一种定量检测a -葡聚糖的方法，包括如下步骤:
I)在测试管中加入1.0mL抗体溶液，放入浊度仪中静置，2min后得出读数Nigtl ;在上述抗体溶液中加入10 μ L浓度为Ctl的α -葡聚糖标准溶液，混匀，避免产生气泡，2min后读数，记录其浊度数据Nm;
2)将样品溶解,稀释样品中α-葡聚糖含量不高于500mg/L并用0.45 μ m过滤器过滤；
3)在测试管中加入1.0mL抗体溶液，放入浊度仪中静置，2min后得出读数N#(l ;在上述抗体溶液中加入IOyL已过滤好的样品溶液加入其中，混匀，避免产生气泡，2min后读数，记录其浊度数据N#1;
4)计算得到的样品溶液中的α-葡聚糖浓度，计算方法如下:
ANTU标=Ne1-N标0;
转换系数CF=C0/Λ NTU标；
ΔΝΤυ#=Ν#1-Ν#0 ；
样品溶液中α-葡聚糖的浓度=ANTU样XCF;
或先行绘制标准浓度曲线，之后根据标准浓度曲线计算出样品溶液中α -葡聚糖的浓
度；
上述检测过程中所使用的试剂如上所述。
[0012]作为本发明的进一步改进，抗体溶液的浓度为0.2~2mg/L。
[0013]本发明的有益效果是:
本发明的定量检测试剂盒，具有操作简便，具有重复性好、灵敏度高、试验条件简单的特点，适宜用于测定反应体系中析出的α-葡聚糖免疫复合物，蔗汁、原糖、白砂糖、赤砂糖、糖浆、糖蜜等制糖工艺过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1 α -葡聚糖含量免疫比浊法线性范围。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实施例中的各成分含量，除标有明确的单位之外，均为所占质量百分比；所使用的单克隆抗体的制备方法为腹水法，具体操作如下:
1)采用健壮成年Balb/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前I周，预先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；
2)每只鼠腹腔注射含I~5X106杂交瘤细胞D9(保藏编号为CCTCCC2010107)的0.5mL的盐水；当小鼠产生腹水时，腹部穿刺放出腹水，离心腹水除去细胞，3000rpm离心15min ；
3)无菌储存或加0.01%叠氮钠置于-20°C冰箱冻存备用；
4)抗体纯化:
抗体的纯化采取亲和层析法，操作步骤如下:
(1)用 Buffer A (0.05mol/L Boric ocid，4.0mol/L NaCL, PH9.0)平衡柱子；
(2)加少量的腹水，用BufferA冲洗柱子；
(3)再用Buffer B (0.05mol/L Sodium phosphate, 0.05mol/L Sodiumcitrate, 0.3mol/L NaCl, pH3.0)洗脱；
(4)收集蛋白加入5%体积的1.0mol/L Tris-HCL，ρΗ8.0调节PH值； (5)收集蛋白进行SDS-PAGE进行纯度测定；
5)抗体的冻干:预冻至_20°C以下，在真空度低于IOOPa下冻干48小时，得到α -葡聚糖抗体冻干粉剂。
[0016]实施例1
各试剂的组成如下:
1、样品稀释液
磷酸盐(缓冲液)IOOmmoI/L (ρΗ7.2)
PEG6000 (表面活性剂)5%
KCl (电解质)10%
2、抗体稀释液
磷酸盐(缓冲液)IOOmmoI/L (ρΗ7.2)
KCl (电解质)5%
3、标准品
磷酸盐(缓冲液)IOOmmoI/L (ρΗ7.2)
PEG6000 (表面活性剂)5%
KCl (电解质)10%
葡聚糖 T-2000500mg/L
4、抗体冻干粉剂 葡聚糖抗体20mg
本实例选用的是高浓度单点参考标准品，葡聚糖T-2000添加浓度为500mg/L，然后用
0.45 μ m滤膜过滤，2-8°C保存。使用时用样品稀释液稀释成不同浓度梯度的标准品，绘制标准曲线。取抗体稀释液IOmL与抗体冻干粉剂混合摇匀，静置5min后作为单一试剂使用。
[0017]实施例2 各试剂的组成如下:
1、样品稀释液
磷酸盐(缓冲液)50mmol/L (ρΗ7.4)
十二烷基三甲基氯化铵0.5%
NaCl (电解质)10%
2、抗体稀释液
磷酸盐(缓冲液)50mmol/L (ρΗ7.4)
NaCl (电解质)5%
3、标准品
磷酸盐(缓冲液)50mmol/L (ρΗ7.4)
十二烷基三甲基氯化铵0.5%
NaCl (电解质)10%
葡聚糖 T-2000500mg/L
4、抗体冻干粉剂 葡聚糖抗体20mg
本实例选用的是高浓度单点参考标准品，葡聚糖T-2000添加浓度为500mg/L，然后用0.45 μ m滤膜过滤，2-8°C保存。使用时用样品稀释液稀释成不同浓度梯度的标准品，绘制标准曲线。取抗体稀释液IOmL与抗体冻干粉剂混合摇匀，静置5min后作为单一试剂使用。
[0018]实施例3 各试剂的组成如下:
1、样品稀释液
磷酸盐(缓冲液)100mmol/L (ρΗ6.8)
Tween-80 (表面活性剂)5%
KCl (电解质)10%
2、抗体稀释液
磷酸盐(缓冲液)100mmol/L (ρΗ6.8)
KCl (电解质)5%
3、标准品
磷酸盐(缓冲液)100mmol/L (ρΗ6.8)
Tween-80 (表面活性剂)5%
KCl (电解质)10%
葡聚糖 T-2000500mg/L
4、抗体冻干粉剂 葡聚糖抗体20mg
本实例选用的是高浓度单点参考标准品，葡聚糖T-2000添加浓度为500mg/L，然后用
0.45 μ m滤膜过滤，2-8°C保存。使用时用样品稀释液稀释成不同浓度梯度的标准品，绘制标准曲线。取抗体稀释液IOmL与抗体冻干粉剂混合摇匀，静置5min后作为单一试剂使用。
[0019]检测方法:
方便起见，以下检测实验中所的抗体浓度均为lmg/L，本领域技术人员可以根据需要使用其他浓度的抗体，只要抗体的浓度足以与葡聚糖反应发生足够量的沉淀即可。优选的，抗体的浓度在0.2~2mg/L。
[0020]以下实验中使用的试剂盒的组成与实施例3的配方相同。
[0021]1、标准曲线绘制:
根据技术路线的要求，计算葡聚糖标准品含水量。称取未经干燥的葡聚糖，使其含无水分的葡聚糖0.1OOg于烧杯内，充分溶解后定溶于IOOmL的容量瓶中，使用pH为6.8的PBS液配制成1.0mg/mL的葡聚糖标准溶液。配置浓度为800mg/L、600mg/L、500mg/L、400mg/L、300mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12mg/L 溶液(该溶液需新鲜配制)。
[0022]在测试管中加入1.0mL抗体溶液，放入浊度仪中静置，2min后得出读数Nigtl ;在上述抗体溶液中加入?ο μ L浓度为Ctl的α -葡聚糖标准溶液，混匀，避免产生气泡，2min后读数，记录其浊度数据Nm;
ANTU标=Ne1-N标0;
以各浓度葡聚糖标准品的浓度为横坐标，ANTU为纵坐标作图(图1):分析可知在浓度为500mg/L以下线性关系良好，线性回归方程为y=0.0759x+0.7437，相关系数R2=0.9967 ；而浓度为500mg/L以上偏离线性，原因可能是抗体量不足。本实验使用0.5mg/mL以下线性关系良好部分为标准曲线。结果见下表:
【权利要求】
1.一种定量检测α-葡聚糖的试剂盒，包括α-葡聚糖抗体冻干粉剂、抗体稀释液、样品稀释液以及标准品，其特征在于:α -葡聚糖抗体冻干粉剂是从注射保藏编号为CCTCCC2010107杂交瘤细胞株D9的小鼠腹水中纯化的IgM型单克隆抗体的冻干粉。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述样品稀释液为pH为6.5~7.8，浓度为0.01~0.02mol/L的PBS溶液，PBS溶液中添加有质量浓度为了 0.1~5%的反应促进剂，反应促进剂为非离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述非离子型表面活性剂选自PEG2000、PEG4000、PEG6000、吐温。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述阳离子型表面活性剂选自十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的试剂盒，其特征在于:所述抗体稀释液为pH为6.5~7.8，浓度为0.01~0.02mol/L的PBS溶液。
6.一种定量检测α-葡聚糖的方法，包括如下步骤: 1)在测试管中加入1.0mL抗体溶液，放入浊度仪中静置，2min后得出读数Nigtl ;在上述抗体溶液中加入10 μ L浓度为Ctl的α -葡聚糖标准溶液，混匀，避免产生气泡，2 min后读数，记录其浊度数据Nm; 2)将样品溶解,稀释样品中α-葡聚糖含量不高于500 mg/L并用0.45 μ m过滤器过滤； 3)在测试管中加入1.0mL抗体溶液，放入浊度仪中静置，2min后得出读数N#(l ;在上述抗体溶液中加入IOyL已过滤好的样品溶液加入其中，混匀，避免产生气泡，2 min后读数，记录其浊度数据N#1; 4)计算得到的样品溶液中的α-葡聚糖浓度，计算方法如下:
ANTUfe=Nfel- N标0; 转换系数CF= C0/Λ NTU标；
ANTU样=N#1- N#0 ； 样品溶液中α -葡聚糖的浓度=Λ NTU样XCF ； 或先行绘制标准浓度曲线，之后根据标准浓度曲线计算出样品溶液中α -葡聚糖的浓度； 上述检测过程中所使用的试剂如权利要求1~5任意一项所述。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:抗体溶液的浓度为0.2~2mg/L。
【文档编号】G01N33/577GK103698520SQ201310625649
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】梁达奉, 曾练强, 柳颖, 蚁细苗, 马步, 林荣珍, 黄曾慰, 李雨虹 申请人:广州甘蔗糖业研究所, 广西农垦糖业集团股份有限公司