一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用。使用保藏号为CCTCC?NO：V201349的大豆花叶病毒分离物侵染本氏烟草获得感染烟草的大豆花叶病毒。按照本发明所述的方法获得感染烟草的大豆花叶病毒在验证抗大豆花叶病毒抗性候选基因中的应用。本发明从众多分离物中筛选获得了能够侵染烟草的大豆花叶病毒，通过将该分离物侵染烟草并通过调查发病症状、南农1138-2回接实验、ELISA以及RT-PCR检测手段进行了证实。该发明获得了感染烟草的大豆花叶病毒，使得在烟草上验证大豆抗SMV候选基因功能成为现实，打破了大豆遗传转化难的限制。
【专利说明】一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用。
【背景技术】
[0002]大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus, SMV)病是全球最主要的大豆病害之一,分布十分广泛，大豆种植区几乎都有发生。SMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，大豆感染SMV后，会产生花叶和坏死等症状，造成大豆光合面积减少和光合能力降低，植株矮化，生长量下降，籽粒出现褐斑，一般造成大豆减产15%，甚至绝收。
[0003]培育抗病品种是控制SMV最有效方法，除了传统的抗病育种方法以外，大豆转基因技术已成为快速培育抗病品种的方法之一。转基因育种以及阐明抗病机理的理论研究都需要抗性功能明确的抗病基因作为物质基础。大豆起源于中国，许多大豆种质资源存在抗SMV基因，人们通过精细定位、酵母双杂交、生物信息学分析等技术手段能从抗性种质中获得SMV抗性候选基因.另外，人们也从其它物种中获得一些可能对SMV具有抗性的基因。这些候选抗性基因可在烟草等模式植物上进行基因功能的间接验证或者直接转化大豆验证这些基因的功能，在大豆上验证功能的同时也有机会获得转基因大豆抗病材料用于培育抗病品种。
[0004]目前，农杆菌介导遗传转化已成为大豆遗传转化的主要方法。尽管科学家们已经通过多种手段不断改进转化体系以提高大豆转化效率。但转化周期长、转化效率低、嵌合体比率高、成本高、工作量大等瓶颈问题还没有彻底解决，转化过程始终受到供体基因型、农杆菌菌株、载体、外植体类型、筛选剂、暗培养条件、操作手法等多方面的因素的限制，使得大豆仍然是世界上公认最难转化的作物之一。因此，大豆抗SMV候选基因直接转化大豆进行功能验证难度非常大。而烟草的遗传转化体系已经非常成熟，它具有省时、省力、花费低、成功率高等优点。但由于SMV的寄主范围较窄，主要侵染豆科植物，如大豆、四季豆、豇豆、豌豆、蚕豆、紫云英等。至今未发现可以侵染烟草的SMV类型。烟草虽然转化容易，但由于SMV不能侵染烟草，人们一直无法通过转化烟草验证大豆抗SMV候选基因的功能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法。
[0006]本发明的另一目的是提供感病烟草的应用。
[0007]一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法,使用保藏号为CCTCC V201349的大豆花叶病毒分离物侵染本氏烟草获得感染烟草的大豆花叶病毒。
[0008]本发明所述的感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法，优选具体步骤如下:
[0009](I)在感病大豆品种南农1138-2上人工接种保藏号为CCTCC V201349的大豆花叶病毒分离物，并进行繁殖，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片加入0.lmol/L、pH=7.3~7.4的磷酸缓冲液，再加600目的金刚砂，在研钵中研成匀浆；
[0010](2)人工气候箱中培养本氏烟草，25°C，光照16小时，黑暗8小时，湿度60%，确保气候箱中无蚜虫，以防止蚜虫传毒造成株系交叉侵染，待本氏烟长至5~6叶时期，用毛刷将步骤(1)制备的匀浆涂到每一片烟叶上，顶端嫩叶不接种，接种后用装有自来水的喷壶冲洗本氏烟，2~3周后观察发病情况，侵染反应划分为3种类型:
[0011]a.无症状:接种后没有症状或只在接种叶上出现局部枯斑而上位叶无症状；
[0012]b.坏死:接种后上位叶或顶端生长点出现坏死；
[0013]c.花叶:接种后上位叶出现花叶、皱缩、卷曲等:
[0014]在上位叶上出现坏死或花叶的视为感染大豆花叶病毒；
[0015](3)通过本氏烟草中SMV的血清检测、SMV CP基因RT-PCR以及染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2进行检测，结果呈阳性，说明烟草确实感染了大豆花叶病毒。
[0016]其中，步骤(1)中每Ig新鲜叶片加5ml所述的磷酸缓冲液。
[0017]所述的本氏烟草中SMV的双抗体夹心酶联免疫吸附分析方法优选:待烟草出现典型发病症状后，选取新鲜的、具有典型症状的叶片I~2片进行双抗体夹心酶联免疫吸附分析DAS — ELISA实验，每个样本3次重复，并设置阳性、阴性、空白对照，显色I小时后，将显色的酶标板放入酶标仪中，测定0D=405nm的吸光度，并参照以下标准分析实验结果:
[0018]a.底物孔 OD 值< 0.15
[0019]b.阳性对照OD值/阴性对照OD值> 10
[0020]c.样品OD值=原始值-底物孔OD值
[0021 ] d.样品OD值≥2倍阴性对照OD值，判为阳性，
[0022]e.样品OD值< 2倍阴性对照OD值，判为阴性；
[0023]之后，再次人工接种本氏烟对所述的大豆花叶病毒分离物进行验证，设置8次重复，每一个重复均通过ELISA检测到大豆花叶病毒。
[0024]所述的SMV CP基因RT-PCR检测方法优选:分别取经过8次重复的本氏烟叶各IOOmg,在液氮中充分研磨后提取总RNA,用引物Oligo dT合成cDNA第一链，以2XTaq mix聚合酶以反转录后的染病本氏烟草cDNA为模板，采用SMV CP基因的一对引物CP-F =SEQID N0.1/CP-RiSEQ ID N0.2进行PCR反应，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察产物的扩增情况，8个样本均在正确的位置出现了 CP条带，证明样品中含有病毒。
[0025]所述的染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2方法优选:将大豆花叶病毒侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2，2~3周后出现典型花叶症状，然后通过DAS—ELISA实验和SMV CP基因RT-PCR扩增均能检测到大豆花叶病毒，证实烟草确实感染了 SMV。
[0026]按照本发明所述的方法获得的感染烟草的大豆花叶病毒在验证抗大豆花叶病毒抗性候选基因中的应用。
[0027]一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用，将大豆花叶病毒抗性候选基因构建到植物表达载体，利用植物表达载体侵染通过本发明所述的方法获得的感染大豆花叶病毒的转基因烟草，通过观察烟草的感病情况，或者分析相关基因的表达从而验证候选基因对大豆花叶病毒的抗性。[0028]一种能够侵染烟草的SMV分离物SMV-S9，于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V201349。
[0029]有益效果:
[0030]本发明从本技术所获得的众多SMV分离物中筛选获得了能够侵染烟草的大豆花叶病毒，通过将该分离物侵染烟草并通过调查发病症状、南农1138-2回接实验、ELISA以及RT-PCR检测手段进行了证实。该发明获得了感染烟草的大豆花叶病毒，使得在烟草上验证大豆抗SMV候选基因功能成为现实，打破了大豆遗传转化难的限制。
[0031]说明书附图
[0032]图1本氏烟感染大豆花叶病毒后的症状，A:野生型本氏烟；B:SMV感染引起的花叶症状。
[0033]图2本氏烟草叶片双抗体夹心酶联免疫吸附分析实验，其中S9、S10以及阳性对照
孔呈亮黄色，其余孔呈无色。
[0034]图3本氏烟草叶片双抗体夹心酶联免疫吸附分析实验，其中，可侵染SMV分离物再次接种本氏烟8次重复和阳性对照孔呈亮黄色，其余孔呈无色。
[0035]图4RT-PCR检测本氏烟中SMV的CP基因
[0036]M:markerD2000; +:染病的南农1138-2作为阳性对照；wt:野生型本氏烟为阴性对照；1-8 =SMV接种本氏烟8个样品。
[0037]图5SMV侵染本氏烟`草后回接南农1138-2的症状
[0038]A:野生型南农1138-2 ；B感病烟草回接的南农1138-2的症状
[0039]图6SMV接种本氏烟后回接南农1138-2双抗体夹心酶联免疫吸附分析实验，其中回接南农1138-2的发病叶片和阳性对照孔呈亮黄色，其余孔呈无色。
[0040]图7RT-PCR检测南农1138-2中SMV的CP基因
[0041]M:markerD2000,1~8泳道分别为SMV侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2。
[0042]图8SMV病样的单斑分离纯化
[0043]注:接种SMV病样后，离体的Topcrop叶片上出现叶脉坏死斑，每个坏死斑被定义为一个纯化的分离物。
[0044]生物样品保藏信息
[0045]SMV-S9，分类命名为:马铃薯Y病毒属大豆花叶病毒SMV-S9 (Soybean mosaicvirus SMV-S9)，于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC V201349。
【具体实施方式】
[0046]实施例1
[0047]1、可侵染本氏烟草的SMV分离物获得
[0048](I)从全国大豆产区分离鉴定出37个SMV分离物(表1 )，这些分离物人工接种在感病大豆品种南农1138-2上繁殖，发病后取症状典型的叶片加入0.lmol/L、pH=7.3~7.4的磷酸缓冲液(约每Ig新鲜叶片加5ml缓冲液)再加少许金刚砂(约600目)在研钵中研成匀浆。[0049](2)人工气候箱中培养本氏烟草，25°C，光照16小时，黑暗8小时，湿度60%，确保气候箱中无蚜虫，以防止蚜虫传毒造成株系交叉侵染，待本氏烟草长至5~6叶时期，人工接种SMV。
[0050]用毛刷将匀浆涂到每一片烟叶上，顶端嫩叶不接种，接种后用装有自来水的喷壶冲洗本氏烟草。2~3周后观察发病情况，侵染反应划分为3种类型:
[0051]a.无症状(接种后没有症状或只在接种叶上出现局部枯斑而上位叶无症状)；
[0052]b.坏死(接种后上位叶或顶端生长点出现坏死)
[0053]c.花叶(接种后上位叶出现花叶、皱缩、卷曲等)。
[0054]在上位叶上出现坏死或花叶的(类型b、c)视为感染SMV，即该病毒可侵染本氏烟。结果发现S9、SlO两个分离物可侵染本氏烟并在上位叶呈现出花叶症状(表1，图1)。
[0055]表1
[0056]
【权利要求】
1.一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用，其特征在于使用保藏号为CCTCC V201349的大豆花叶病毒分离物侵染本氏烟草获得感染烟草的大豆花叶病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体步骤如下 (1)在感病大豆品种南农1138-2上人工接种保藏号为CCTCCV201349的大豆花叶病毒分离物，并进行繁殖，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片加入0.lmol/L、pH=7.3~7.4的磷酸缓冲液，再加600目的金刚砂，在研钵中研成匀浆； (2)人工气候箱中培养本氏烟草，25°C，光照16小时，黑暗8小时，湿度60%，确保气候箱中无蚜虫，以防止蚜虫传毒造成株系交叉侵染，待本氏烟长至5~6叶时期，用毛刷将步骤(I)制备的匀浆涂到每一片烟叶上，顶端嫩叶不接种，接种后用装有自来水的喷壶冲洗本氏烟，2~3周后观察发病情况，侵染反应划分为3种类型: a.无症状:接种后没有症状或只在接种叶上出现局部枯斑而上位叶无症状； b.坏死:接种后上位叶或顶端生长点出现坏死； c.花叶:接种后上位叶出现花叶、皱缩、卷曲等: 在上位叶上出现坏死或花叶的视为感染大豆花叶病毒； (3)通过本氏烟草中SMV的双抗体夹心酶联免疫吸附分析检测、SMVCP基因RT-PCR以及染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2进行检测，结果呈阳性，说明烟草确实感染了大豆花叶病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中每Ig新鲜叶片加5ml所述的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的本氏烟草中SMV的双抗体夹心酶联免疫吸附分析检测方法为:待烟草出现典型发病症状后，选取新鲜的、具有典型症状的叶片I~2片进行双抗体夹心酶联免疫吸附分析DAS — ELISA实验，每个样本3次重复，并设置阳性、阴性、空白对照，显色I小时后，将显色的酶标板放入酶标仪中，测定0D=405nm的吸光度，并参照以下标准分析实验结果: a.底物孔OD值<0.15 b.阳性对照OD值/阴性对照OD值>10 c.样品OD值=原始值-底物孔OD值 d.样品OD值≥2倍阴性对照OD值，判为阳性， e.样品OD值<2倍阴性对照OD值，判为阴性； 之后，再次人工接种本氏烟对所述的大豆花叶病毒分离物进行验证，设置8次重复，每一个重复均通过ELISA检测到大豆花叶病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的SMVCP基因RT-PCR检测方法为:分别取权利要求4中经过8次重复的本氏烟叶各IOOmg,在液氮中充分研磨后提取总RNA，用引物Oligo dT合成cDNA第一链，以2XTaq mix聚合酶以反转录后的染病本氏烟草cDNA为模板，采用SMV CP基因的一对引物CP-F:SEQ ID N0.1/CP-RiSEQ ID N0.2进行PCR反应，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像系统中观察产物的扩增情况，8个样本均在正确的位置出现了 CP条带，证明样品中含有病毒。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的染病本氏烟草叶片回接感病大豆品种南农1138-2方法为:将权利要求4中大豆花叶病毒侵染本氏烟草的8次重复分别回接南农1138-2，2~3周后出现典型花叶症状，然后通过双抗体夹心酶联免疫吸附分析和SMV CP基因RT-PCR扩增均能检测到大豆花叶病毒，证实烟草确实感染了 SMV。
7.按照权利要求1所述的方法获得的感染烟草的大豆花叶病毒在验证抗大豆花叶病毒抗性候选基因中的应用。
8.—种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用，其特征在于将大豆花叶病毒抗性候选基因构建到植物表达载体，利用植物表达载体侵染通过权利要求1所述的方法获得的感染大豆花叶病毒的转基因烟草，通过观察烟草的感病情况，或者分析相关基因的表达从而验证候选基因对大豆花叶病毒的抗性。
9.一种能够侵染烟草的SMV分离物SMV-S9，于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C CTCC V201349。
【文档编号】G01N33/569GK103756975SQ201310653591
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】智海剑, 高乐, 李凯, 任锐, 仲勇坤, 翟锐 申请人:南京农业大学