一种微载体制备系统的制作方法

一种微载体制备系统的制作方法
【专利摘要】一种微载体的制备系统，涉及将微量液体分配器与XYZ位移平台及不粘模板结合从而大规模地制备悬浮阵列芯片用微载体。将微载体原料液储液池连接微量液体分配器，将不粘模板放在XYZ位移平台上，通过微量液体分配器在XYZ位移平台将微量液体分配器与不粘模板空间位置定位的情况下，分配微载体原料液至不粘模板上固化，然后将固化的微载体与不粘模板分离以批量获得微颗粒，随后固化的微颗粒固定传感敏感材料后用于悬浮阵列芯片的检测，本发明的制备系统具有结构简单、易于自动化、适用材料广、可编码方法多等特点从而期盼能够有助于基于微载体的悬浮阵列芯片的进一步发展和应用。
【专利说明】一种微载体制备系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微载体制备系统，特别是将储液池、微量液体分配器、不粘模板及定位系统结合，通过储存在储液池中的液体原料藉由微量液体分配器在定位系统将微量液体分配器的喷嘴与不粘模板空间位置定位的情况下分配微量液体至不粘模板上固化以获得微颗粒，然后将固化的微颗粒与不粘模板分离以批量制备微载体。
【背景技术】
[0002]随着人类文明的进展，在医疗卫生、生物工程、环保及食品安全等众多领域人们对高通量、低成本、方便可靠的多功能生物传感器件的需求越来越多、越来越迫切。为此，在上个世纪九十年代，人们开发了以平面微阵列和悬浮微阵列为基础的生物芯片技术。近十多年来生物芯片技术以其无可比拟的高信息量、高通量、灵敏、快速、准确的特点而显示出了巨大威力，并因此受到世界各国学术界和工业界的瞩目，从而被公认将会给21世纪的生命与医学科学研究带来一场革命。
[0003]其中悬浮阵列芯片技术也称微载体技术，它是一种通过编码微颗粒上固定的传感敏感材料与待测样品间特异性相互作用而在流体中进行多目标检测分析的工具。它不仅具有通常多目标检测分析技术所具备的信息量大、检测时间短、所需检测样品体积小以及检测成本相对传统检测方法低的特点，而且无论是制备还是使用，它均较另外一种多目标检测分析技术-平面微阵列芯片技术有着许多突出的优势:更大的产量、更灵活的检测目标安排、更快速的反应以及更高质量的实验结果。因此，悬浮阵列芯片的研发正越来越受到了人们的高度关注。在国际上悬浮阵列芯片研发中取得巨大成功的具代表性的例子是美国的Luminex公司的双突光标记微球技术以及Illumina公司的微球阵列芯片技术。目前悬浮阵列芯片不仅广泛应用于包括药物筛选在内的科研领域，而且已被美国FDA批准而成功应用于临床诊断。
[0004]悬浮阵列芯片的关键技术主要包括三个方面。首先是微载体的制备技术。人们已经开发了包括液相合成法、模板法及石板印刷法在内的制备技术。其中液相合成法在液体环境中将液态微载体原料转化为固态微载体，它具有制备量大、廉价等优点，但存在质量控制及难以制备图案编码微载体等问题。模板法则通过复制包括阳极氧化铝等模板在内的特定形貌及尺寸而制备微载体，该方法通常在液态环境中实现，因此其方法简单且易于操作，但存在模板形貌及尺寸受限等问题。而石板印刷术则通过微电子工艺中成熟的光刻技术通过光刻胶制备微载体，该方法具有二维微载体形貌控制精确的优点，但存在难以制备三维形貌微载体及制备成本较高等问题。
[0005]悬浮阵列芯片的另外一个关键技术是其编码-解码技术。由于微颗粒在流体中进行检测而又难以采取平面微阵列的位置编码，因此需要对所有的微颗粒编码并在检测时解码识别。而包括核酸、蛋白在内的生物分子的检测数量常常非常大，因此人们需要的编码种类也非常多。例如高密度平面微阵列芯片检测核酸时常常需要在I平方厘米的区域固定数以万计的微探针以检测核酸序列。目前悬浮阵列芯片中人们常用的编码方法包括荧光及吸收光编码在内的光学编码、核酸编码在内的化学编码、尺寸及形状编码在内的物理编码、射频编码在内的电子编码、条纹及点阵列编码在内的图案编码。其中，采用荧光或者吸收光的光学编码方法编码数量相对有限。而包括核酸编码在内的化学编码虽然编码数量大，但如果通过平面微阵列进行解码则不仅复杂而且耗时，这些将影响其在高通量检测中的应用。包括尺寸及形状编码的物理编码同样存在编码量少的问题。射频编码编码量极大，其在250X250X100微米的微颗粒上编码数量接近无穷大-大于1012，但是其昂贵且慢速的合成限制了其大规模使用。图案编码中虽然编码条纹杆连接敏感材料繁杂困难，微坑图案修饰颗粒只在荧光强度足够大的时候才能够识别其图案，而光漂白编码微球无论合成还是解码都比较费时，但是2007年Daniel C等人采用微孔点阵列图案的悬浮微阵列芯片的编码工作首次提示图案编码在悬浮阵列芯片中的巨大潜力:该方法不仅编码量大-其所制备的90微米宽30微米厚180至270微米长的微颗粒编码数量可达百万级别，而且能够重复批量制备、检测灵敏并与流式细胞术兼容。微孔点阵列图案编码技术的问题在于其流式细胞术检测难以高速进行，因此限制了其在高通量检测中的应用。
[0006]悬浮阵列芯片的另外一个关键技术则是微载体的检测。其方法主要有两种:流式细胞术及显微成像方法。前者通过双激光系统对在设计通道内的单个微载体进行解码及信号读取。事实上，它已经成为目前微载体颗粒多目标分析的一个通用平台。流式细胞术检测方法的问题在于非在片检测且能够高速检测的是编码量小的光学编码微载体，而编码量大的图案编码微载体则难以高速检测，因此其高通量检测存在发展瓶颈。而后者则通过包括荧光显微镜在内的成像系统对编码微颗粒进行解码及信号识别，它是图案编码悬浮阵列芯片检测过程中必不可少的工具，目前多孔板中编码微颗粒的检测分析已经获得应用。该方法的主要问题是在流体中编码微颗粒取向的不确定、溶液中编码微颗粒的运动影响成像系统聚焦与识别等。而近些年产生的微颗粒捕捉及组装技术为这些问题的解决提供了可能。例如Illumina公司开发了将不同编码微球自组装到刻蚀过的数以万计的光纤束微井阵列或者平面硅微井阵列中进行检测的技术。这些微颗粒的捕捉或者组装技术使得悬浮阵列芯片通过显微成像技术进行解码及信号检测不仅可以克服微颗粒的取向确定及微颗粒的运动对检测的干扰，而且它可以采用如平面微阵列芯片中的显微图像拼接技术而实现更高通量的检测分析。事实上，Illumina公司开发的化学编码微珠阵列芯片已经发展成为全球最大平面微阵列芯片生产商Affymetrix公司的有力竞争者并在商业上取得巨大成功。对比流式细胞术及显微成像方法我们可以发现显微成像方法还具有特别的优势:显微成像方法是在片解码及信号读取。这对于需要多步骤检测分析体系尤其显得重要-其在片解码及信号读取意味着平行检测时间的节省及通量的提高。
[0007]纵观悬浮阵列芯片的关键技术，我们可以发现悬浮阵列芯片在通量的提高上受制于流式细胞术只能高速检测低编码量的光学编码微载体，及显微成像方法的快速检测只能用于编码量大但检测复杂费时的化学编码微载体。其通量的进一步提高有赖于显微成像方法与图案编码微载体的有机结合。然而人们开发的图案编码微载体难以满足这种要求。因此迫切需要开发能够与显微成像技术匹配的图案编码微载体技术以促使悬浮阵列芯片更好地服务社会。为此我们在组件式多功能传感器件(专利号ZL2005100406340)中首次提出了不倒翁状微载体的技术。然而在前期申请中我们采用了模压技术制备不倒翁状微载体。而随着包括喷墨打印技术在内微量液体分配技术的发展微量液体高速、高精度分配成为可能，但是目前包括喷墨打印技术在内的微量液体分配技术是将微量液体分配并附着在基底上以获取喷墨固态成分与基底一体化的包括打印文本、服装印染等产品，还无法制备可以检测用的微载体。为此本申请在国际上首次将储液池、微量液体分配器、不粘模板及定位系统结合，通过储存在储液池中微载体的液体原料藉由微量液体分配器在定位系统将微量液体分配器的喷嘴与不粘模板空间位置确定的情况下分配微量液体至不粘模板上固化，然后将固化的微颗粒与不粘模板分离以批量获得微载体的新系统。该系统有望为包括不倒翁状微载体在内的悬浮阵列芯片的进一步发展作出贡献。

【发明内容】

[0008]技术问题:本发明的目的是提供一种微载体的制备系统，将储液池、微量液体分配器、不粘模板及定位系统结合以批量制备微载体，该系统能够批量制备包括图案编码及不倒翁状微载体在内的多种微载体。
[0009]技术方案:本发明在国际上首次将微量液体分配器、不粘模板及定位系统结合，通过储存在储液池中微载体的液体原料藉由微量液体分配器在定位系统将微量液体分配器的喷嘴与不粘模板空间位置确定的情况下分配微量液体至不粘模板上固化，然后将固化的微颗粒与不粘模板分离以批量获得微载体的新系统。
[0010]该系统包括XYZ位移平台、校正器件、不粘模板、微量液体分配器、微载体原料液储液池；将微载体原料液储液池连接微量液体分配器，将不粘模板放在XYZ位移平台上，通过微量液体分配器在XYZ位移平台将微量液体分配器与不粘模板空间位置定位的情况下，分配微载体原料液至不粘模板上固化，然后将固化的微载体与不粘模板分离以批量获得微颗粒，随后固化的微颗粒固定传感敏感材料后用于悬浮阵列芯片的检测。
[0011]不粘模板为平整模板、或者含凹或者凸编码图案的模板。
[0012]不粘模板与固化的微载体通过流体冲击、液体浸泡、流体振荡而分离。
[0013]不粘模板非图案编码区域的表面能小于微载体的液体原料的表面能，以使得微载体的液体原料不能浸润不粘模板的非图案编码区域并且不粘模板与微载体液体原料间无化学键连接。
[0014]微量液体分配器的一次分配液体量介于0.1毫升至I飞升。
[0015]微量液体分配器为包括点样针在内点样器件或者包括压电喷头、热泡喷头在内的嗔头。
[0016]微量液体分配器分配在不粘模板上的微载体原料液通过溶剂挥发溶质析出、熔融物冷却或者液态材料通过化学反应而固化。
[0017]所述的XYZ位移平台设有位置校正器件，该位置校正器件包括显微镜、光栅尺，限位器中的一种或者多种。
[0018]有益效果:目前微载体的制备虽然已经发展了很多技术，但是受制于微载体编码方法的限制，微载体的制备及检测成本仍然较高并限制了其进一步的推广应用。为此本申请将成熟、廉价的喷墨打印技术或者点样技术引入微载体制备之中以制备易于检测的图案编码微载体，以期为悬浮阵列芯片的进一步发展做贡献。
【专利附图】

【附图说明】[0019]图1为微载体制备系统。
[0020]a、XYZ位移平台；al、校正器件；b、不粘模板；c、微量液体分配器；cl微载体原料液储液池。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本申请进行说明。本申请的微载体制备系统包括XYZ位移平台
a、不粘模板b、及微量液体分配器C。XYZ位移平台具有定位微量液体分配器及不粘模板的作用。示意图图例中XYZ位移平台控制微量液体分配器，而实际中也可以通过XY位移平台控制不粘模板，而Z位移平台控制微量液体分配器的运动或者分别由两套XYZ位移平台分别控制微量液体分配器及不粘模板。由于本系统中存在两个需要定位的部分-微量液体分配器及不粘模板，因此需要对这两个部分的相对位置进行校正。示意图中给出的校正器件al可以为显微镜系统也可以是高速光栅尺等其它相对位置校正器件。微量液体分配器c含有部件Cl微载体原料液储液池.其组成可以是点样针与微载体原料液储液池分离的结构即如示意图所示，也可以是如压电喷头在内的某种喷头与微载体原料液储液池连通的结构。当为点样针与微载体原料液储液池分离的结构时，分配液体需要通过XYZ位移平台将点样针运动至微载体原料液储液池取液，然后再运动至不粘模板上特定位置以分配微量液体。当为喷头与微载体原料液储液池连通的结构时，喷头通过XYZ位移平台运动至不粘模板特定位置时微载体原料液储液池可以连续对喷头进行供液。而不粘模板b则为其表面能低于微载体原料液的表面能的材料构成，其可以平整，也可以有编码图案。仅以示意图所示系统介绍其一种操作方式:
[0022]A、首先制备不粘模板并固定；
[0023]B、其次通过显微成像系统调节XYZ精密位移平台使得微量液体分配系统中的点样针头在XY方向上与模板特定区域(如图案)对齐；
[0024]C、通过微量液体分配系统中的针头与XYZ精密位移Z平台配合分配一定量微量液体至模板特定区域；
[0025]D、重复步骤B及C在模板基底上不同区域点样。
[0026]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0027]实施例一:
[0028]先通过石板印刷技术分别在不同硅片上制备图案尺寸为60微米(字符尺寸为10微米)，间隔为150微米，深度为5微米的阴文倒字符阵列Al，A2, A3。随后将这些硅片模板在70:30体积比的浓硫酸/双氧水溶液中80摄氏度处理2小时后用蒸馏水多次清洗、干燥后置于含1%的氟代烷基硅烷甲苯溶液中处理24小时后，用甲苯/丙酮/乙醇、蒸馏水依次清洗，并干燥后获得含有字符图案阵列的不粘模板。将含Al字符图案的模板固定在基底上备用。
[0029]另外配置含9.5%的丙烯酰胺，1%的甲叉双丙烯酰胺，5%的分子量为900的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，5%，10%的甘油，直径为10纳米的四氧化三铁及1%的2-羟基-2-甲基苯丙酮的水溶液作为微载体反应液并将其储存在作为储液池的96孔板的孔中。
[0030]购置点样直径为75微米的点样针并将其与总放大倍率为300倍的便携式显微镜的镜头一起固定在精度为10微米的XYZ位移平台上并组装至基底上。调整便携式显微镜的镜头使得能够从镜头在100倍率下清楚看见不粘模板上的图案阵列。将装置置于充满氮气的手套箱中，然后调整点样针使得其针头先在作为储液池的96孔板的孔洞中取液后再与不粘模板上字符图案对齐吻合以便分配亚纳升的微载体反应液体至不粘模板图案阵列上。重复该过程使得每一个图案上均分配有微载体反应液。然后将通过功率为100瓦的紫外光源进行照射约15秒以促使微载体反应液聚合固化以成为水凝胶。随后将不粘模板上的含有凸型字符图案Al的半球型水凝胶微载体先通过超声波清洗器在IOOw下振荡2分钟，然后通过蒸馏水冲至收集池中清洗备用。将上述含有凸型字符Al图案编码半球形水凝胶微载体置于1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升甲型肝炎抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠(NaN3)的1%BSA的PBS封闭液4°C冰箱封闭10h，37°C封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测甲型肝炎的字符Al编码的半球形微载体。
[0031]通过同样方法分别批量制备以A2编码的乙型肝炎检测微载体及以A3编码的丙型肝炎微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的凸型字符图案编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应Ih并清洗，随后在荧光显微镜下即可基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人血清是否含有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒。
[0032]实施例二:
[0033]首先选择14417氧化低密度脂蛋白受体I (0LR-1)的基因多态性选为寡核苷酸多态性SNP基因分型分析的目标以检测其中5’-TGC TGT GA G TG A ACC TGCTGT GTT GA-3’。然后据此设计聚合性的探针:
[0034]1:5’ -TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3’
[0035]I1:5，-TCA ACA CAG CAG CTT CAC TCA CAG CA-3’
[0036]II1:5，-TCA ACA CAG CAC GAT CAC TCA CAG CA-3’
[0037]IV:5，-TCA ACA CAG CAC CAT CAC TCA CAG CA-3’
[0038]其中I与目标序列完全匹配，而II，III，和IV分别在序列中间与检测器I有一个，两个和三个错配碱基。
[0039]然后以2mM的探针I至IV溶液浓度分别准备丙烯酰胺修饰寡核苷酸的溶液，含有3%的丙烯酰胺单体(29:1，丙烯酰胺:双丙烯酰胺)，30%的甘油和1%的过硫酸铵(APS)。这些溶液以Al对应探针1、A2对应探针I1、A3对应探针II1、A4对应探针IV、A5对应空白同浓度丙烯酰胺凝胶使用博奥生物芯片公司的微阵列仪(中国)中的压电喷头喷墨点分别在修饰过的实施例一所述的但图案编码尺寸为400微米，深度为10微米，间隔为500微米的有倒写阴文A1、A2、A3、A4、A5阵列图案模板的硅片上。点样后，硅片被放置到事先放有四甲基乙二胺(TEMED)潮湿的密封腔室中。密封腔中的压力降低至约1000帕斯卡(Pa)，并在室温下保持0.5小时。在这种压力下，TEMED被气化并扩散到载玻片表面上以诱发丙烯酰胺和丙烯酰氧基之间的共聚得到含有探针1-探针IV的聚丙烯酰胺凝胶微颗粒。随后模板硅片就在在室温Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液(TBE)中以20V/cm的电场电泳30分钟的以去除杂质。电泳在北京六一电泳仪器厂的40厘米长水平腔的DYCP-33A电泳槽中进行。模板硅片在电场中的位置是固定的，距离阴极约为5厘米。载玻片浸入深度为0.2厘米。电泳完成后，模板硅片用水漂洗，然后用去离子水将这些微颗粒从模板硅片上冲洗下来成为微载体备用。
[0040]分别取图案Al、A2、A3、A4、A5编码的微颗粒与cy5修饰的已知基因型的三个样品的基因片断进行室温杂交2小时，随后用TBE缓冲液清洗并用美国惠普生物科技公司的ScanArray Lite扫描仪设置70%的激光功率和70% PMT增益而获取并用GenePix Pro3.0的软件进行分析。这样就可以根据不同字符编码微载体上有无cy5荧光而了解三个样品的氧化低密度脂蛋白受体I (0LR-1)的基因多态性。
[0041]实施例三:
[0042]先通过石板印刷技术分别在不同硅片上制备图案尺寸为60微米(字符尺寸为10微米)，间隔为150微米，深度为5微米的倒写阴文字符阵列Al，A2, A3。随后将这些硅片模板在70:30体积比的浓硫酸/双氧水溶液中80摄氏度处理2小时后用蒸馏水多次清洗、干燥后置于含1%的氟代烷基硅烷甲苯溶液中处理24小时后，用甲苯/丙酮/乙醇、蒸馏水依次清洗，并于氮气中干燥备用。将含倒Al字符阴文图案的硅片模板放在平底烧杯中并灌注PDMS溶液，随后真空脱去其中的气泡并在100摄氏度固化1.5小时。将固化的PDMS与硅片模板一起从烧杯中取出并将硅片与固化的PDMS分离。分离的固化PDMS上有Al字符的阳文编码图案。将该PDMS在氧等离子中处理30秒并用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟后依次用丙酮、乙醇、去离子水清洗，得到低表面能的PDMS。将氟代烷基硅烷处理过的有Al阳文编码图案的PDMS放入平底烧杯中并灌注PDMS溶液，真空脱气后在100摄氏度固化，得到由氟代烷基硅烷修饰的阳文Al编码图案的固化PDMS与阴文倒Al图案编码的固化PDMS相互粘连的块体。将这两个固化PDMS分离，即可获得阴文倒Al图案编码的固化PDMS。将此固化PDMS在氧等离子中处理30秒后，用直径75微米的点样针取1%的PEG修饰硅烷偶联剂的乙醇溶液在阴文倒Al图案区点样，以确保图案区为PEG硅烷偶联剂处理，然后等乙醇挥发完毕，用氟代烷基硅烷蒸汽进一步处理30分钟后得到图案编码区域亲水，而非编码区域疏水的有阴文倒Al图案编码的PDMS模板。该模板由于在图案区应用了浸润性更好的基底，因此较实施例一中不粘模板能够获得编码图案质量更高的微载体。
[0043]另外配置含9.5%的丙烯酰胺，1%的甲叉双丙烯酰胺，5%的分子量为900的PFGDA，5%的直径为10纳米的四氧化三铁及1%的2-羟基-2-甲基苯丙酮的水溶液作为微载体反应液并将其储存在作为储液池的96孔板的孔中。
[0044]取直径为75微米的点样针并将其与总放大倍率为300倍的便携式显微镜的镜头一起固定在精度为10微米的XYZ位移平台上并组装至基底上。调整便携式显微镜的镜头使得能够从镜头在100倍率下清楚看见不粘模板上的图案阵列。将装置置于充满氮气的手套箱中，然后调整点样针使得其针头先在作为储液池的96孔板的孔洞中取液后再与不粘模板上字符图案对齐吻合以便分配亚纳升的的微载体反应液体至不粘模板图案阵列上。重复该过程使得每一个图案上均分配有微载体反应液。然后将通过功率为100瓦的紫外光源进行照射约15秒以促使微载体反应液聚合固化以成为水凝胶。随后将不粘模板上的含有凸型字符图案Al的半球型水凝胶微载体先在超声波清洗器中于150w下振荡2分钟，然后通过蒸馏水冲至收集池中清洗备用。将上述含有凸型字符Al图案编码半球形水凝胶微载体置于1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升甲型肝炎抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠(NaN3)的1%BSA的PBS封闭液4°C冰箱封闭10h，37°C封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测甲型肝炎的字符Al编码的半球形微载体。
[0045]通过同样方法分别批量制备以A2编码的乙型肝炎检测微载体及以A3编码的丙型肝炎微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的凸型字符图案编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应Ih并清洗，随后在荧光显微镜下即可基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人血清是否含有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒。
[0046]实施例四:
[0047]首先将PDMS溶液注入平底培养皿中，然后真空脱气并在90摄氏度固化。取出固化的PDMS并将其与平底培养皿接触一面向上用氧等离子处理30秒后，用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟后依次用丙酮、乙醇、去离子水清洗并在氮气中干燥得到疏水疏油的不粘模板。
[0048]另外分别配制含lwt%珠光染料及25wt%的分子量为10万的聚苯乙烯的N，N- 二甲基甲酰胺溶液。珠光染料选择红色、紫色及蓝色。通过尺寸为100微米的点样针从石英烧杯中选取混有红色珠光染料的聚苯乙烯溶液利用精度为10微米的XYZ平台在氟代烷基硅烷处理过的固化PDMS上以150微米的间隔进行点样。随后将点样过的PDMS在100摄氏度挥发干燥，得到附于PDMS上有红色珠光染料编码的聚苯乙烯微颗粒。将聚苯乙烯颗粒用乙醇从PDMS上冲下，并在氮气中干燥后，将红色珠光染料编码的聚苯乙烯微颗粒在氨等离子中处理30秒后用1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升甲型肝炎抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠(NaN3)的1%BSA的PBS封闭液4°C冰箱封闭10h，37°C封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测甲型肝炎的红色编码的聚苯乙烯微载体。
[0049]通过同样方法分别批量制备以紫色编码的乙型肝炎检测微载体及以蓝色编码的丙型肝炎微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的珠光染料编码聚苯乙烯微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与荧光素荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应Ih并清洗，随后在荧光显微镜下即可基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人血清是否含有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒。
[0050]实施例五
[0051]首先将PDMS溶液注入平底培养皿中，然后真空脱气并在90摄氏度固化。取出固化的PDMS并将其与平底培养皿接触一面向上用氧等离子处理30秒后，用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟后依次用丙酮、乙醇、去离子水清洗并在氮气中干燥得到疏水疏油的不粘模板。
[0052]配制含1%丙烯酰氧基在5’位修饰的核酸探针序列，0.5%珠光染料及0.1%偶氮二异丁腈光引发剂的35wt%的平均分子量为700的聚乙二醇双丙烯酸酯PBS缓冲溶液。核酸探针序列即传感敏感材料分别为:a:5’_丙烯酰氧基-TTT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGGGTT GT-3’；b:5’ -丙烯酰氧基-TAT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT_3’；c:5’ -丙烯酰氧基-TCT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’ ；d:5’ -丙烯酰氧基-TGT TGATGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT_3’;将含有a核酸探针序列的溶液配青色珠光染料通过压电喷头在氟代烷基硅烷处理过的固化PDMS模板上制备出间距为500微米尺寸约为300微米的青色半球形液滴。在饱和水蒸气及氮气的保护下于16瓦紫外灯的照射反应12小时后，用去离子水浸泡I小时后用水冲下并进行清洗，获得能够检测核酸序列a青色半球形微载体。重复制备能够检测核酸序列b的橙色半球形微载体、能够检测核酸序列c的紫色半球形微载体及能够检测核酸序列d的蓝色半球形微载体。从四种微载体中各取三个微载体与0.2M的氯化钠及含0.05%的Tween-20的Tris-EDTA缓冲液中的生物素连接待测样品杂交后用PBS缓冲液清洗。随后将微载体进一步与连接有藻红蛋白的抗生蛋白链菌素的PBST缓冲液在37摄氏度混合孵育30分钟。随后用PBS清洗。首先在不开启荧光光源的情况下在荧光显微镜下观察不同微载体的颜色编码，然后开启荧光光源观察不同微载体的荧光即可判断核酸序列a、b、c及d的有或者无。
【权利要求】
1.一种微载体制备系统，其特征在于该系统包括XYZ位移平台(a)、校正器件(al)、不粘模板(b )、微量液体分配器(c )、微载体原料液储液池(Cl);将微载体原料液储液池连接微量液体分配器，将不粘模板放在XYZ位移平台上，通过微量液体分配器在XYZ位移平台将微量液体分配器与不粘模板空间位置定位的情况下，分配微载体原料液至不粘模板上固化，然后将固化的微载体与不粘模板分离以批量获得微颗粒，随后固化的微颗粒固定传感敏感材料后用于悬浮阵列芯片的检测。
2.根据权利要求1所的述微载体制备系统，其特征在于不粘模板为平整模板、或者含凹或者凸编码图案的模板。
3.根据权利要求1所述的微载体制备系统，其特征在于不粘模板与固化的微载体通过流体冲击、液体浸泡、流体振荡而分离。
4.根据权利要求1所述的微载体制备系统，其特征在于不粘模板非图案编码区域的表面能小于微载体的液体原料的表面能，以使得微载体的液体原料不能浸润不粘模板的非图案编码区域并且不粘模板与微载体液体原料间无化学键连接。
5.根据权利要求1所述的微载体的制备系统，其特征在于微量液体分配器的一次分配液体量介于0.1晕升至I飞升。
6.根据权利要求1所述的微载体的制备系统，其特征在于微量液体分配器为包括点样针在内点样器件或者包括压电喷头、热泡喷头在内的喷头。
7.根据权利要求1所述的微载体的制备系统，其特征在于微量液体分配器分配在不粘模板上的微载体原料液通过溶剂挥发溶质析出、熔融物冷却或者液态材料通过化学反应而固化。
8.根据权利要求1所述的微载体的制备系统，其特征在于所述的XYZ位移平台设有位置校正器件，该位置校正器件包括显微镜、光栅尺，限位器中的一种或者多种。
【文档编号】G01N33/531GK103675258SQ201310662199
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】张继中 申请人:东南大学