血液样品预处理方法
【专利摘要】一种血液样品预处理方法，包括：在试管中加入乙腈溶剂和血浆，血浆与乙腈溶剂的体积比大于等于1∶3，血浆中的杂蛋白分离形成絮状物，锁链素附着在絮状物中；提取絮状物；在所述絮状物中加入高效液相色谱级酸性水溶液，絮状物中的锁链素以离子形态游离在所述高效液相色谱级酸性水溶液；提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液。锁链素附着在絮状物中，后续絮状物加入高效液相色谱级酸性水溶液中，锁链素溶解，提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液用于HPLC检测。本技术方案的血液样品预处理方法无需现有技术的萃取、氮气吹干等步骤，简化了血液样品预处理步骤，节省预处理时间，也不需操作人员实时监测，降低对人的依赖性。
【专利说明】血液样品预处理方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗【技术领域】，特别涉及一种血液样品预处理方法。
【背景技术】
[0002]对血液样品进行预处理是指从血液样品中提取待测物。后续将通过检测该待测物的含量、成分等参数，达到疾病检查、健康检查的目的。
[0003]例如，在现有技术中，肺损伤患者由于肺部富含的弹性纤维组织降解生成特异性产物锁链素(desmos ine，DES )，造成血浆中锁链素浓度的升高。因此，使用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)检测血衆中 DES 浓度，根据 DES 浓度可实现对肺损伤的临床检验及研究。但是，HPLC对血液样品上样前的预处理有较为苛刻的要求。
[0004]由于血浆中成分复杂，其中DES含量相对较低，传统的预处理方法较为繁复。传统的血液样品预处理方法包括:在试管中加入A溶液和血浆，A溶液用于分离血浆中的杂蛋白；涡旋振荡，使试管中的A溶液和血浆充分混匀，血浆中的杂蛋白形成絮状物，锁链素以离子态游离于溶液中；离心，将试管置于离心机中进行离心处理，絮状物与溶液分离，并沉积在试管底部；萃取，从试管中的上层溶液中提取含有锁链素的溶液至另一试管中；氮气吹干，使用氮气吹拂另一试管中的溶液，至液体完全吹干，试管中的干燥粉末包括锁链素成分，整个氮气吹干过程大概需要7至8个小时；复溶，向装有吹干的干燥粉末的试管中加入B溶液，干燥粉末再溶解，其中的锁链素以离子状态游离于B溶液中；过滤，去除复溶溶液中的其他微粒杂质，得到具有锁链素的溶液。具有锁链素离子的溶液用于HPLC检测。
[0005]对传统的血液样品的预处理方法进行分析，整个过程过于繁琐，整个血液样品预处理时间总耗时长达十几个小时。氮气吹干步骤中，在吹干后需要及时停止氮气吹拂，否则干燥粉末可能被吹跑。而且氮气吹干步骤花费时间太长，这对操作人员的技术要求和依赖性特别高，需要操作人员实时监测。另外，传统的血液样品预处理方法所需血浆样品较多，一般至少需要0.5?lmL，而且利用率也低。
【发明内容】
[0006]本发明解决的问题是，传统的血液样品预处理方法的过程过于繁琐。
[0007]为解决上述问题，本发明提供一种血液样品预处理方法，所述血液样品预处理方法包括:
[0008]在试管中加入乙腈溶剂和血浆，血浆与乙腈溶剂的体积比大于等于1:3，血浆中的杂蛋白分离形成絮状物，锁链素附着在絮状物中；
[0009]提取絮状物；
[0010]在所述絮状物中加入高效液相色谱级酸性水溶液，絮状物中的锁链素以离子形态游离在所述高效液相色谱级酸性水溶液；
[0011]提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液。[0012]可选地，所述高效液相色谱级酸性水溶液为甲酸溶液或三氟乙酸溶液，所述甲酸溶液、三氟乙酸溶液的体积浓度范围为0.5%。?1%。。
[0013]可选地，在提取所述絮状物之前，对装有乙腈溶剂和血浆的试管进行涡旋振荡。
[0014]可选地，所述提取絮状物的方法为:进行离心过滤处理，得到甩干的絮状物，在所述离心过滤过程，离心机的转速范围为4000?5000rpm。
[0015]可选地，在所述絮状物中加入高效液相色谱级酸性酸溶液后，静置2?3min。
[0016]可选地，静置后，对装有高效液相色谱级酸性水溶液的试管进行涡旋振荡。
[0017]可选地，所述涡旋振荡的时间范围为20?30s。
[0018]可选地，提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液的方法为:进行离心过滤处理，得到具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液，在所述离心过滤过程，离心机的转速为lOOOOrpm。
[0019]可选地，所述离心过滤时间范围为2?3min。
[0020]可选地，在所述血液样品预处理方法中，使用的试管包括第一管、可分离套装于第
一管中的第二管，
[0021 ] 所述第二管具有第一开口和第二开口，所述第一开口具有可横亘在第一管开口边缘的延伸件，乙腈溶剂、血浆和高效液相色谱级酸性水溶液通过第一开口进入第二管中；
[0022]所述第二管中设置有滤膜，所述滤膜表面与所述第一开口相对，所述滤膜边缘与第二管内壁贴合，所述滤膜与第一开口之间的第二管部分用于盛装乙腈溶剂、血浆和高效液相色谱级酸性水溶液；
[0023]提取絮状物过程，使用滤膜过滤第二管中的溶液，第二管中的溶液流入一第一管，絮状物沉积在滤膜表面；
[0024]在提取絮状物后，分离第一管与第二管，将第二管套装于另一第一管中；
[0025]提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液过程，具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液流入另一第一管。
[0026]与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点:
[0027]血浆与乙腈溶剂的体积比大于等于1:3，可以使锁链素附着在絮状物中。由于锁链素附着在絮状物中，后续絮状物加入高效液相色谱级酸性水溶液中，锁链素从絮状物中释放并溶解，之后提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液用于HPLC检测。本技术方案的血液样品预处理方法无需现有技术中的萃取、氮气吹干等步骤，简化了血液样品预处理步骤，节省血液样品预处理时间，也不需要操作人员实时监测，降低对人的依赖性。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明具体实施例的血液样品预处理过程使用的试管的剖面结构示意图。【具体实施方式】
[0029]本发明提供一种血液样品预处理方法，该预处理方法操作简单，步骤少，节省时间。
[0030]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。[0031]第一步，取一干净试管，在试管中加入乙腈溶剂和血浆，血浆与乙腈的体积比大于等于1:3，在乙腈溶剂的作用下，血浆中的杂蛋白分离形成絮状物，血浆中的锁链素以离子态附着在絮状物中，絮状物位于试管的溶液中。在本实施例中，血浆的体积范围为75μ L?100 μ L,与现有技术相比，本实施例所需血浆体积很小。
[0032]在本实施例中，血浆与乙腈溶剂的体积比为1:3，这样可以保证血浆中的锁链素基本全部吸附在絮状物中，避免混合溶液中存在锁链素残留，而影响检测结果。在具体实施例中，血浆与乙腈溶剂的体积比不限于1:3，大于1:3也是可行的。
[0033]在本实施例中，可以遵循先加入质量密度较小的液体，后加入质量密度较大的液体的原则，先向试管中加入乙腈溶剂，乙腈溶剂的质量密度小于血浆的质量密度；接着向乙腈溶剂中加入血浆。质量密度较大的血浆会快速向乙腈溶剂中扩散，保证血浆与乙腈溶剂充分混合。
[0034]在血浆与乙腈溶剂混合时，在乙腈溶剂的作用下，血浆中的杂蛋白凝聚形成絮状物，同时血浆中的锁链素呈离子态，并随着杂蛋白的凝聚附着在絮状物中。在本实施例中，乙腈溶剂为高效液相色谱级乙腈溶剂，所谓高效液相色谱级是指乙腈的纯度很高，可以在高效液相色谱中使用的试剂纯度。在具体实施例中，除了本实施例的高效液相色谱级乙腈溶剂，还可使用其他可行的高纯或超纯乙腈溶剂。
[0035]第二步，涡旋振荡。将试管置于涡旋振荡器中，塞住试管的开口，进行涡旋振荡处理，涡旋振荡使得血浆与乙腈溶剂充分混匀，促进絮状物的形成。在涡旋振荡过程中，可同时进行搅拌，使得试管中的较大块絮状物被打散。由于锁链素除附着在于絮状物表面，还可能包裹在絮状物中，打散絮状物可以使锁链素充分暴露在絮状物表面，这样在后续过程的溶液中，絮状物中的锁链素能得到充分溶解，以保证测得的锁链素含量准确。
[0036]在具体实施例中，涡旋振荡的时间范围为20?30s，可以实现血浆与乙腈溶剂充分混匀，并打散较大块絮状物。在本实施例中，涡旋振荡的时间为30s。
[0037]第三步，离心过滤。进行离心过滤处理。在离心过滤过程中，溶液与絮状物分离，溶液被遭离心过滤至其他容器中，絮状物中的液体基本被甩干，得到干燥的絮状物，将干燥的絮状物放入另一试管中。在本实施例中，过滤过程使用的滤膜14为有机相滤膜，允许有机溶剂通过。滤膜14的滤孔孔径不大于0.5 μ m，可过滤掉溶液中的绝大多数难溶微粒杂质。
[0038]在具体实施例中，离心过滤过程使用低温超速离心机，离心机的转速范围为4000?5000rpm,所述低温温度为4°C,整个离心过程持续2?3min。如果离心机的转速低于4000rpm，不利于甩干絮状物，在絮状物中可能会有乙腈残留。如果离心机的转速高于5000rpm，会使絮状物在滤膜表面过度粘合压实，不利于后续絮状物分离再溶解。
[0039]第四步，在进行离心过滤后，絮状物盛于另一新试管中，向该新试管中加入高效液相色谱级酸性水溶液，静置，静置时间范围2?3min，以实现絮状物在高效液相色谱级酸性水溶液中充分浸透。在本实施例中，静置时间为2min。
[0040]锁链素是由三个醛赖氨酸侧链和一个赖氨酸侧链形成的交联体，在絮状物表面以离子形态吸附，在高效液相色谱级酸性水溶液作用下，絮状物表面的锁链素容易脱离絮状物表面，锁链素以离子形态游离在高效液相色谱级酸性水溶液。
[0041 ] 在具体实施例中，所述高效液相色谱级酸性水溶液为甲酸溶液或三氟乙酸溶液，高效液相色谱级酸性水溶液的体积浓度范围为0.5%。?1%。(包括端点)。在本实施例中，所述高效液相色谱级酸性水溶液为三氟乙酸溶液，三氟乙酸溶液的体积浓度为1%。。在后续高效液相色谱分析过程中，高效液相色谱级酸性水溶液作为流动相。
[0042]在具体实施例中，高效液相色谱级酸性水溶液的体积约等于血浆体积，可以实现絮状物的充分浸透。
[0043]第五步，在静置后，进行涡旋振荡，涡旋振荡的时间范围为20?30s，以使絮状物与高效液相色谱级酸性水溶液充分混匀。在涡旋振荡时，可以进行搅拌，打散絮状物，利于絮状物中的锁链素释放。在本实施例中，涡旋振荡的时间为30s。
[0044]第六步，离心过滤。在离心过滤过程中，溶解有锁链素的高效液相色谱级酸性水溶液通过滤膜快速进入至下一试管管中，溶液中的其他杂质、微粒则残留在滤膜上，溶解有锁链素的高效液相色谱级酸性水溶液即为所需溶液。在本实施例中，离心机的转速范围为IOOOOrpm,以保证溶液尽可能完全被离心到下一试管中。在具体实施例中，离心所处环境温度为4°C，离心时间范围为2?3min。在本实施例中，离心时间为2min。
[0045]经过以上血液样品预处理过程，得到具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液，该高效液相色谱级酸性水溶液可用于后续高效液相色谱检测。
[0046]在本发明的血液样品预处理方法中，可使用现有的试管。在具体实施例中，除使用现有试管外，还可使用一种新的试管，下面将详细阐述该新试管在本发明中的应用。
[0047]参照图1，使用的试管包括第一管101和可分离套装于第一管101中的第二管102。
[0048]第二管102具有第一开口 121和第二开口 122。液体，如血浆、乙腈溶剂、高效液相色谱级酸性水溶液，通过第一开口 121进入第二管102，第二开口 122用于液体流出。所述第一开口 121具有可横亘在第一管101开口边缘的延伸件123，在第一管101与第二管102套装时，延伸件123架在第一管101的开口边缘上。
[0049]参照图1，所述第二管102中设置有滤膜104，所述滤膜104靠近所述第二开口122，所述滤膜104表面与所述第一开口相对，所述滤膜边缘与第二管内壁贴合，例如滤膜104的边缘表面与第二管内壁使用胶水粘合，避免第二管102溶液中的杂质从滤膜104与第二管102的内壁之间的缝隙通过。
[0050]对于本实施例的试管，第一，滤膜104的滤孔孔径较小，孔径范围不大于0.5 μ m。这样，当血浆、乙腈溶剂和高效液相色谱级酸性水溶液通过第一开口 121进入第二管102，液体不会快速通过滤膜104而泄露，液体通过滤膜104的速率极其缓慢，滤膜104与第一开口 121之间的第二管部分用于盛装血浆、乙腈溶剂和高效液相色谱级酸性水溶液。而且，第二管102套装于第一管101中，即使液体缓慢通过滤膜104，流下的液体进入第一管101，不会出现液体洒出，也不会影响检测结果。
[0051 ] 第二，在本发明血液样品预处理方法的第三步，提取絮状物的离心过滤过程，第二管102中的乙腈溶剂和血浆中的液体成分快速通过滤膜104，进入第一管101中，在该过程中滤膜104起到过滤作用。在高速离心时，絮状物中的乙腈溶剂基本完全被甩干，得到干燥絮状物，干燥絮状物沉积在滤膜104表面，并贴合在滤膜104表面。在本发明血液样品预处理方法的第六步，提取具有锁链素的高效液相色谱级酸性水溶液过程，滤膜104起到过滤作用，溶液中的杂质留在滤膜104表面。具有锁链素的高效液相色谱级酸性水溶液快速通过滤膜104，进入另一干净第一试管101中，并作为用于高效液相色谱分析的所需滤液。
[0052]在使用传统试管提取絮状物和具有锁链素的高效液相色谱级酸性水溶液时,需使用专门的离心过滤机，而且需要将过滤的溶液由一个试管转移到另一试管中。与之相比，使用本实施例的新试管，在一般离心机中就可实现离心过滤，而且过滤掉的溶液从第二管转移到第一管中，简化了操作。
[0053]在具体实施例中，参照图1，在滤膜104与第二开口 122之间设置有多孔支架103，第二管内壁在支架103的边缘与支架103固定连接，支架103呈片状，支架103的表面与滤膜104的表面紧密贴合。支架103用于承载滤膜104，避免滤膜104在本发明血液样品预处理方法的涡旋振荡过程、高速离心过程中破裂。在具体实施例中，支架103呈蜂窝状且允许第二管102中的液体流出。
[0054]在具体实施例中，参照图1，在所述第一开口 121与滤膜104之间的第二管内壁设置有环形件109，所述环形件109环绕第二管102的中轴线，所述滤膜104与环形件109之间的空间作为容置空间106，在所述容置空间106中设置有多孔切割件107。在提取所述絮状物之前，对装有乙腈溶剂和血浆的试管进行涡旋振荡时；或者，在提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液之前，对装有絮状物和高效液相色谱级酸性水溶液的试管进行涡旋振荡时，切割件107可切割絮状物，实现打散絮状物的目的。与使用传统试管的涡旋振荡过程，本实施例的试管更容易操作，简便易行。
[0055]在具体实施例中，该多孔切割件107呈片状，多孔切割件107位于滤膜104的表面，切割件107的直径小于第二管102的内径。切割件107的多孔呈现网格分布，切割件107可在容置空间106中活动。在涡旋振荡过程中，由于切割件107的直径小于第二管102内径，切割件107在第二管102中的液体中晃动，晃动过程中网格线切割絮状物，实现打散絮状物的目的。在其他实施例中，也可以不设置容置空间，切割件107与第二管内壁固定连接，且切割件107与滤膜104之间稍微隔开一定距离，在涡旋振荡时，网格线也可以切割絮状物。因此，使用本实施例的试管，可以在涡旋振荡的同时，打散絮状物。
[0056]在具体实施例中，参照图1，试管还包括一中空截顶的锥形部108，该锥形部108的两端具有开口，锥形部108的一端开口与第二管102的第二开口 122对接，锥形部108的另一端开口位于第二管102外侧，且锥形部108的另一端开口内径小于第二开口 122内径。在离心过滤过程的高速旋转中，通过滤膜104的溶液液滴被高速甩出，锥形部108可以阻挡飞溅的液滴飞向第一管101内壁，液滴会顺着锥形部108的内壁缓缓通过锥形部108的具有较小内径的开口进入第一管101的底部。
[0057]在具体实施例中，参照图1，所述试管还包括盖子105，盖子105包括盖设于第二管第一开口 121的本体151、与本体151连接的把手152，第一管外壁在把手152与本体151之间的连接处与盖子105连接。在涡旋振荡、离心过滤过程，盖子105盖住第二管102的第一开口 121，避免第二管102中的液体从第一开口 121飞溅出去。
[0058]使用本实施例的新试管，第二管中的滤膜起到过滤作用，第二管中的切割件能实现打散絮状物作用。与传统试管相比，新试管具有多个功用，可以提高血液样品预处理效率，节省预处理时间。另外，第二管与第一管能实现可分离套装，这使得第一管的更换过程特别方便，而第一管在一次预处理过程中也可重复多次使用。
[0059]虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
【权利要求】
1.一种血液样品预处理方法，其特征在于，包括: 在试管中加入乙腈溶剂和血浆，血浆与乙腈溶剂的体积比大于等于1:3，血浆中的杂蛋白分离形成絮状物，锁链素附着在絮状物中； 提取絮状物； 在所述絮状物中加入高效液相色谱级酸性水溶液，絮状物中的锁链素以离子形态游离在所述高效液相色谱级酸性水溶液； 提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液。
2.如权利要求1所述的血液样品预处理方法，其特征在于，所述高效液相色谱级酸性水溶液为甲酸溶液或三氟乙酸溶液，所述甲酸溶液、三氟乙酸溶液的体积浓度范围为0.5%0?1%0。
3.如权利要求1所述的血液样品预处理方法，其特征在于，在提取所述絮状物之前，对装有乙腈溶剂和血浆的试管进行涡旋振荡。
4.如权利要求1所述的血液样品预处理方法，其特征在于，所述提取絮状物的方法为:进行离心过滤处理，得到甩干的絮状物，在所述离心过滤过程，离心机的转速范围为4000 ?5000rpm。
5.如权利要求1所述的血液样品预处理方法，其特征在于，在所述絮状物中加入高效液相色谱级酸性酸溶液后，静置2?3min。
6.如权利要求5所述的血液样品预处理方法，其特征在于，静置后，对装有高效液相色谱级酸性水溶液的试管进行涡旋振荡。
7.如权利要求3或6所述的血液样品预处理方法，其特征在于，所述涡旋振荡的时间范围为20?30s。
8.如权利要求1所述的血液样品预处理方法，其特征在于，提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液的方法为:进行离心过滤处理，得到具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液，在所述离心过滤过程，离心机的转速为lOOOOrpm。
9.如权利要求4或8所述的血液样品预处理方法，其特征在于，所述离心过滤时间范围为2?3min。
10.如权利要求1所述的血液样品预处理方法，其特征在于，在所述血液样品预处理方法中，使用的试管包括第一管、可分离套装于第一管中的第二管， 所述第二管具有第一开口和第二开口，所述第一开口具有可横亘在第一管开口边缘的延伸件，乙腈溶剂、血浆和高效液相色谱级酸性水溶液通过第一开口进入第二管中； 所述第二管中设置有滤膜，所述滤膜表面与所述第一开口相对，所述滤膜边缘与第二管内壁贴合，所述滤膜与第一开口之间的第二管部分用于盛装乙腈溶剂、血浆和高效液相色谱级酸性水溶液； 提取絮状物过程，使用滤膜过滤第二管中的溶液，第二管中的溶液流入一第一管，絮状物沉积在滤膜表面； 在提取絮状物后，分离第一管与第二管，将第二管套装于另一第一管中； 提取具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液过程，具有锁链素离子的高效液相色谱级酸性水溶液流入另一第一管。
【文档编号】G01N30/06GK103645264SQ201310687036
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】许骥, 陈杰, 陈锐勇, 刘晓波, 何佳, 陈新, 向导 申请人:中国人民解放军海军医学研究所