一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法
【专利摘要】一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，步骤包括：将待检牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成成10～100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液，脱蛋白后过阳离子交换树脂柱脱钙，将脱钙后所得洗脱液过阳离子交换树脂柱，除杂和富集，将收集液在温度60～70℃，转速为50～60rpm下真空旋转蒸发，过膜后作为液相检测样品；然后进行液相检测，按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。本发明在减少了实验初期试剂、仪器等资金投入的同时，运用相对简单高效的纯化步骤进行操作，实现酪蛋白磷酸肽的分离，保证了定量精度，并有效去除其他蛋白质和脂类等杂志干扰，提高了最终检测的灵敏度，有利于酪蛋白磷酸肽含量相对较低的样品检测。
【专利说明】一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检测【技术领域】，尤其涉及一种酪蛋白磷酸肽(CPP)的液相检测方法。
【背景技术】
[0002]酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，通过生物技术制得，再经分离纯化而得到的含有磷酸丝氨酸族的天然生物活性的多肽，可用于各种营养、保健食品中，能有效促进人体对钙、铁、锌等二价矿物营养素的吸收和利用。德国和日本已把酪蛋白磷酸肽(CPP)定性为功能性食品。我国目前已广泛的把酪蛋白磷酸肽(CPP)作为食品添加剂应用于婴幼儿奶粉和保健食品中。
[0003]虽然人们对酪蛋白磷酸肽(CPP)的功能组分、化学特点、生理功效等方面进行了广泛深入的研究，但其在添加酪蛋白磷酸肽(CPP)的食品及保健品中的酪蛋白磷酸肽(CPP)检测方面报道较少。据文献报道，目前普遍采用乙醇沉淀法测定酪蛋白磷酸肽的含量，但该种方法只能检测原料中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量大于10%的样品，不能检测牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量。在牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量检测方面，存在一些难点问题，如牛奶中的蛋白质及一些盐类成分会严重干扰测定结果。目前国内已有大公司将酪蛋白磷酸肽(CPP)添加在乳制品中，如内蒙古伊利实业集团股份有限公司等，但都没有建立有效的评价酪蛋白磷酸肽(CPP)的检测方法，因此急需找到一种能检测牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法。基于目前的方法不能检测牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量，已经不能满足方便、快捷、灵敏度高的检测方法的需求，建立一种高效液相色谱法测定牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法迫在眉睫，这也显示出了高效液相色谱一定的优势。
[0004]
【发明内容】
[0005]本发明的目的:针对现有检测酪蛋白磷酸肽(CPP)的技术中不适用于测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的不足，提供一种可有效地检测出牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的高效液相色谱方法，该方法旨在将基本包括现有牛奶所可能涉及的各种主要酪蛋白磷酸肽(CPP)，使其能更加快速、灵敏、简便地检测酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量，以满足实际工作的需要。
[0006]本发明的目的是实现所述的利用高效液相色谱，测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，具体步骤为:
(1)将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准溶液，混匀，加标成l(Tl00ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脱蛋白，方法是取5?IOg酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料离心管中，加入5?IOg水，混匀后再加入5%。?1.5%三氯乙酸5?10g，漩涡混匀并超声5?15min，然后以400(T4800rpm离心5?15min，离心后将离心管放入65?75°C的水浴锅中水浴5?15min，再以400(T4800rpm离心5~15min，取上清液滤纸过滤后备用；
(3)将预先处理好的阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3~5mL，用2~3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞；将步骤(2)处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为1-2滴每秒；用水做洗脱剂，洗脱体积为广2倍柱体积，收集洗脱液；
(4)将预先处理好的阴离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3~5mL，用2~3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞；将步骤(3)收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为广2滴每秒；首先用2~3倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0.1-0.4mol/L HCl做洗脱剂，洗脱体积为2~3倍柱体积，收集洗脱液；
(5)将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为6(T70°C，转速为5(T60rpm，进行真空旋转蒸发至f2mL，准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；
(6)液相检测:色谱柱DiamosilC18(2) 5u，250 X 4.6_，流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脱程序:从O到45min，流动相B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20 μ L，柱温常温，波长，215nm ；
(7)按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。
[0007]步骤(2)中，所述脱蛋白的方法也可以是:取5~10g事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入5^10g水，混匀后再加入5%。~1.5%三氯乙酸5~10g漩涡混匀并超声5~15min，然后以400(T4800rpm离心5~15min。取上清液滤纸过滤后备用。
[0008]或取5~IOg事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入5~IOg的水，混匀后再加入氯仿:正丁醇溶液(预先配成体积比4:1混合液)2.5~5mL，漩涡混匀并超声5~15min，然后以400(T4800rpm离心5~15min，取出上层重复上述操作处理3次。取上清液滤纸过滤后备用。
[0009]或取5~IOg事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入5~IOg的水，漩涡混匀并超声5~15min，将离心管放入65~75°C的水浴锅中水浴5~15min，然后以400(T4800rpm离心5~15min。取上清液滤纸过滤后备用。
[0010]步骤(3)中，所述阳离子交换树脂为001X7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树月旨、罗门哈斯AMBERJET UP6040阳离子交换树脂、三菱WK60L阳离子交换树脂中的一种。
[0011]步骤(4)中，所述阴离子交换树脂为FPA98C1罗门哈斯离子交换树脂、德国Lewatit M500阴离子交换树脂,美国Amberlite IRA-400阴离子交换树脂、阿拉丁阴离子交换树脂中的一种。
[0012]本发明方法的检测限为大约10 μ g/mL (信噪比≤3)，回收率在85%~105%之间。
[0013]本发明的检测方法的主要特点:
本发明方法灵敏度高、准确度和精密度好，专属性及确证性可靠，而且非常简便并可易于实际检测应用，且可非常好地满足实际检测中的需要。采用高效液相色谱对牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)检测的方法，目前尚未见有相应的报道。
[0014]本发明优点为:本发明建立了用高效液相色谱检测牛奶实际样品中酪蛋白磷酸肽(CPP)的定量分析方法，减少了实验初期在实验试剂、仪器设备等方面的资金投入的同时，运用相对简单高效的纯化步骤进行操作，实现酪蛋白磷酸肽(CPP)的分离，保证了定量精度，并有效去除其他蛋白质和脂类等杂志干扰，提高了最终检测的灵敏度。方法的检出限为15 μ g/mL,有效地确保实验数据的准确度，有利于酪蛋白磷酸肽(CPP)含量相对较低的样品检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为酪蛋白磷酸肽(CPP)标准品色谱图。
[0016]图2为牛奶中添加酪蛋白磷酸肽(CPP)色谱图。
[0017]图3为牛奶中添加酪蛋白磷酸肽(CPP)后再加入酪蛋白磷酸肽(CPP)定性色谱图。
[0018]图4为空白液态牛奶样品色谱图。
[0019]图5为酪蛋白磷酸肽(CPP)标准品、实际样品和空白液态牛奶样品重叠色谱图。
[0020]图6为IO μ g/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP )标准品色谱图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施实例对本发明进行详细说明。
[0022]实验方法
I材料、试剂和仪器
乙腈(色谱纯)，三氯乙酸(分析纯)，酪蛋白磷酸肽(CPP)标准品，实验用水为超纯水(18MQ*cm, TOC 3 ppb)，FPA98C1罗门哈斯离子交换树脂(北京慧德易科技有限责任公司)，001 X 7 (732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(杭州争光树脂有限公司)，德国LewatitM500阴离子交换树脂，罗门哈斯AMBERJET UP6040阳离子交换树脂，美国AmberliteIRA-400阴离子交换树脂，阿拉丁阴离子交换树脂，三菱WK60L阳离子交换树脂，岛津LC-15C高效液相色谱仪配STO-15C紫外检测器，XW-80A型旋涡混合器，L530台式低速离心机，电子天平，JP-040型洁盟牌超声清洗机，R201型旋转蒸发器，恒温水浴锅。
[0023]2实验用试剂
0.1%三氟乙酸乙腈溶液:吸取ImL三氟乙酸用乙腈稀释至IOOOmL ；
0.1%三氟乙酸水溶液:吸取ImL三氟乙酸用水稀释至IOOOmL ；
0.5%三氯乙酸溶液:称取0.5g三氯乙酸加水至IOOg ；
酪蛋白磷酸肽(CPP)标准品用超纯水稀释，配制成不同浓度的标样进行检测，可得到较好的色谱峰形，并且配制简单。
[0024]标准物质:酪蛋白磷酸肽(CPP)，纯度不低于90%。
[0025]按外标法以峰面积计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽(CPP)的浓度。
[0026]实施例1:本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步骤:
(1)将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准溶液，混匀，加标成IOOppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脱蛋白。方法是取5g事先配置好的酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料离心管中，加入5g水,混勻后再加入5%。三氯乙酸5g镟润混勻并超声5min,然后以4800rpm离心lOmin，离心后将离心管放入70°C的水浴锅中水浴lOmin，再以4800rpm离心lOmin。取上清液滤纸过滤后备用；
(3)过001X7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的001X7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为5mL，用2倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞。将步骤(2)处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为2滴每秒。用水做洗脱剂，洗脱体积为I倍柱体积，收集洗脱液；
(4)将洗脱液过FPA98C1罗门哈斯离子交换树脂柱，除杂和富集。将预先处理好的FPA98C1罗门哈斯离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为5mL。用2倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞；将步骤(3)收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为2滴每秒；首先用2倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0.2mol/L HCl做洗脱剂，洗脱体积为2倍柱体积，收集洗脱液；
(5)将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为60°C，转速为50rpm，进行真空旋转蒸发至ImL,准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；
(6)液相检测。色谱柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6mm，流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脱程序:从O到45min，流动相B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20 μ L，柱温常温，波长，215nm ；
(7)按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。
[0027]实施例2:本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步骤:
(1)将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准溶液，混匀，加标成IOppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脱蛋白。方法是取IOg事先配置好的酪蛋白磷酸肽分散溶液样品于50mL塑料离心管中，加入IOg水,混勻后再加入1%。三氯乙酸IOg镟润混勻并超声IOmin,然后以4000rpm离心15min,离心后将离心管放入75°C的水浴锅中水浴15min,再以4000rpm离心15min。取上清液滤纸过滤后备用；
(3)过三菱WK60L阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的三菱WK60L阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3mL，用3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞。将步骤(2)处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为I滴每秒。用水做洗脱剂，洗脱体积为2倍柱体积，收集洗脱液；
(4)将洗脱液过阿拉丁阴离子交换树脂柱，除杂和富集。将预先处理好的阿拉丁阴离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3mL。用3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞。将步骤(3)收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为I滴每秒。首先用3倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0.4mol/L HCl做洗脱剂，洗脱体积为3倍柱体积，收集洗脱液；
(5)将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为70°C，转速为60rpm，进行真空旋转蒸发至2mL,准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；
(6)液相检测。色谱柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6_，流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脱程序:从O到45min，流动相B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20 μ L，柱温常温，波长，215nm ；
(7)按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。
[0028]实施例3:本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步骤:
(1)将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准溶液，混匀，加标成50ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脱蛋白。方法是取5g事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入5g水，混匀后再加入氯仿:正丁醇溶液(预先配成体积比4:1混合液)2.5mL，漩涡混匀并超声15min，然后以4800rpm离心5min,取出上清重复上述操作处理3次。取上清液滤纸过滤后备用；
(3)过罗门哈斯AMBERJETUP6040阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的罗门哈斯AMBERJET UP6040阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3mL，用3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞。将步骤(2)处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为I滴每秒。用水做洗脱剂，洗脱体积为2倍柱体积，收集洗脱液；
(4)将洗脱液过德国LewatitM500阴离子交换树脂柱，除杂和富集。将预先处理好的德国Lewatit M500阴离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3mL。用2倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞。将步骤(3)收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为I滴每秒。首先用3倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0.4mol/L HCl做洗脱剂，洗脱体积为3倍柱体积，收集洗脱液:
(5)将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为70°C，转速为60rpm，进行真空旋转蒸发至2mL,准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；
(6)液相检测。色谱柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6mm，流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脱程序:从O到45min，流动相B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20 μ L，柱温常温，波长，215nm ；
(7)按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。
[0029]实施例4:本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步骤:
(1)将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准溶液，混匀，加标成50ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脱蛋白。方法取IOg事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入IOg水，混匀后再加入1.5%。三氯乙酸IOg镟润混勻并超声15min,然后以4400rpm离心15min,离心后将离心管放入65°C的水浴锅中水浴15min，再以4400rpm离心15min。取上清液滤纸过滤后备用；
(3)过001X7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的001X7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为5mL，用3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞。将步骤(2)处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为I滴每秒。用水做洗脱剂，洗脱体积为2倍柱体积，收集洗脱液；
(4)将洗脱液过美国AmberliteIRA-400阴离子交换树脂柱，除杂和富集。将预先处理好的美国Amberlite IRA-400阴离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为5mL。用2倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞。将步骤(3)收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为I滴每秒。首先用3倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0.2mol/L HCl做洗脱剂，洗脱体积为3倍柱体积，收集洗脱液；
(5)将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为65°C，转速为50rpm，进行真空旋转蒸发至2mL,准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；
(6)液相检测。色谱柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6_，流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脱程序:从O到45min，流动相B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20 μ L，柱温常温，波长，215nm ；
(7)按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。
[0030]结果与讨论
1、前处理方法讨论
前处理中有几个注意点，首先是样品加入液态奶中需要充分混匀，以免重复取样检测时结果相差较大。其次脱蛋白`时使用的三氯乙酸溶液的浓度及水浴温度要适宜，防止产生因三氯乙酸溶液浓度过高或温度过高对酪蛋白磷酸肽(CPP)的影响及过低导致除杂效果不好的问题。因此适宜的三氯乙酸溶液的浓度及水浴的温度是本方法的一个关键点。
[0031]2、方法的线性相关性及检出限
浓度分别为 0.0800,0.1200,0.1600,0.2000,0.2400,0.2800mg/mL 的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准品溶液依次进样，进样量均为20 μ L，外标法定量。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标进行线性回归，得到Α=9.9Χ 105C-21143，相关系数R2=0.9999。酪蛋白磷酸肽(CPP)在0.0800mg/mL-0.2800mg/mL范围内有良好的线性关系。
[0032]经实验测定，方法检测限为10 μ g/mL,图6为10 μ g/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)标准品色谱图，此浓度下信噪比达到了 3。
[0033]3、实际样品检测结果 HPLC检测结果见图2和表5。
[0034]表5牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)检测结果
【权利要求】
1.一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤包括：(1)将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5mg/mL的酪蛋白磷酸肽（CPP)标准溶液，混 匀，加标成l(Tl00ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；(2)脱蛋白，方法是取5?10g酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料离心管中，加入 5?10g水，混匀后再加入5 %。?1. 5%三氯乙酸5?10g，漩涡混匀并超声5?15min，然后以 400(T4800rpm离心5?15min，离心后将离心管放入65?75°C的水浴锅中水浴5?15min，再以 400(T4800rpm离心5?15min，取上清液滤纸过滤后备用；(3)将预先处理好的阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3?5mL，用2?3倍 柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞；将步骤（2)处理好的样品缓慢地加入 层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为广2滴每秒；用水做洗脱剂，洗脱体积为广2 倍柱体积，收集洗脱液；(4)将预先处理好的阴离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3飞mL，用2?3倍 柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞；将步骤（3)收集的洗脱 液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为广2滴每秒；首 先用2?3倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0. ro. 4mol/L HC1做洗脱剂，洗脱体 积为2?3倍柱体积，收集洗脱液；(5)将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为6(T70°C，转速为5(T60rpm，进行真空旋转 蒸发至f2mL，准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；(6)液相检测:色谱柱DiamosilC18(2) 5u，250 X 4. 6mm，流动相A :0. 1%三氟乙酸水溶 液，流动相B ：0. 1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脱程序：从0到45min，流动相 B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20 y L，柱 温常温，波长，215nm ；(7)按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。
2.根据权利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述脱蛋白的方法是：取5?10g事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入 5?10g水，混匀后再加入5 ?1. 5%三氯乙酸5?10g漩涡混匀并超声5?15min，然后以 400(T4800rpm离心5?15min，取上清液滤纸过滤后备用。
3.根据权利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤（2) 中，所述脱蛋白的方法是取5?10g事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入5?10g 的水，混匀后再加入氯仿和正丁醇混合溶液2. 5?5mL，漩涡混匀并超声5?15min，然后以 4000^4800rpm离心5?15min，取出上层重复上述操作处理3次，取上清液滤纸过滤后备用， 所述氯仿和正丁醇混合溶液的体积配比为4:1。
4.根据权利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤（2) 中，所述脱蛋白的方法是：取5?10g事先配置好的样品于50mL塑料离心管中，加入5?10g 的水，漩涡混匀并超声5?15min，将离心管放入65?75°C的水浴锅中水浴5?15min，然后以 4000^4800rpm离心5?15min，取上清液滤纸过滤后备用。
5.根据权利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述阳离子交换树脂为001X7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、罗门哈斯 AMBERJET UP6040阳离子交换树脂、三菱WK60L阳离子交换树脂中的一种。
6.根据权利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述阴离子交换树脂为FPA98C1罗门哈斯离子交换树脂、德国Lewatit M500阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-400阴尚子交换树脂、阿拉丁阴尚子交换树脂中的一种。
【文档编号】G01N30/06GK103760246SQ201310712472
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】曹庸, 李双祁, 刘飞, 彭维, 郭斌, 吴成顺 申请人:广州绿萃生物科技有限公司