专利名称：检测倍他米松残留的胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体涉及一种检测倍他米松残留的胶体金试纸条。
背景技术：
倍他米松属于肾上腺皮质激素类药物，具有抗菌、消炎的作用。由于其具有广谱高效的杀菌作用，常被添加到祛痘类产品中以达到消炎、祛痘、除螨及抗粉刺的目的。但这种药物的不良反应较多，有滁钠作用，对生长的抑制作用较强；还能引起皮质炎固醇激素引起的各种不良反应，如肌肉骨骼、胃肠道、皮肤、神经系统、内分泌系统的异常和水电解质紊乱等。鉴于以上这些不良反应，长期使用添加有倍他米松的化妆品或皮肤性接触此种药物可严重影响人体健康，因此，我国卫生部颁布的2007年版《化妆品卫生规范》中规定，化妆品中不得添加倍他米松。目前关于倍他米松检测的文献报道大都是针对倍他米松原料和药品，也有关于动物组织中倍他米松检测的研究，主要有旋光法、分光光度法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法等。旋光法影响因素较多，需要标准对照品和样品的量较多，不适宜微量分析；分光光度法操作繁琐，样品处理过程中损失较多，且检出限较高，重复性较差；高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。因此，在实践中有必要建立一种特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品筛选检测的方法，以能够更好地满足我国化妆品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。
实用新型内容本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测倍他米松的试纸条。本实用新型的试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其中结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。这样可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收，与结合物释放垫上喷涂的金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效地减少误差，还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。所述反应膜上具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线。本实用新型试纸条的底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；样品吸收垫可由玻璃棉或聚酯材料制成；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放垫喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物；吸水垫为吸水纸。偶联倍他米松的载体蛋白可用牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线和质控线相互平行且与样品液流动方向垂直。本实用新型试纸条具有如下有益效果:1、灵敏度高。倍他米松快速检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的灵敏度，对化妆品(霜、乳液、化妆水)中倍他米松的检测灵敏度为 lmg/Lo2、操作简便快速。使用快速检测试纸条时无需任何其他试剂，只要将样品前处理后用滴管滴入试纸条加样孔内，滴加2 3滴，加样后计时，5 10min内观察结果。3、显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸条以显示红线印迹作为试纸条的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上只有质控线显示红色表示在被检测样品液中倍他米松浓度高于或等于检测限，检测线和质控线均显色红色表示在被检测样品中不含倍他米松或其浓度低于检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4、成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5、易于大范围推广应用。快速检测试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、化妆品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图1为倍他米松快速检测试纸条结构示意图，其中，1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；图2为倍他米松快速检测试纸条阴性(图2.a)、阳性(图2.b)、无效(图2.c)显色示意图，其中T为检测线，C为质控线。
具体实施方式
实施例1试纸条的组装参见图1:样品吸收垫I用聚酯材料制成，结合物释放垫2由纤维制成，喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜3为硝酸纤维素膜，吸水垫4为吸水材料层制成，检测线5包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物，位于距离结合物释放垫一侧0.4cm处，质控线6包被有羊抗鼠抗抗体，底板7为PVC背衬，在PVC背衬上按顺序粘贴反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样品吸收垫，将样品吸收垫覆盖在结合物释放垫三分之一处。要制成倍他米松快速检测试纸条首先需制备倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物，用于制备检测线，制备胶体金，用于制备金标抗体；其次需制备羊抗鼠抗抗体，用于制备质控线。以下是相关材料的制备方法:1.倍他米松半抗原将0.39g倍他米松溶解在10 ml吡啶中，室温下缓慢滴加入0.3ml I, 3_丙二胺，滴加完毕后，升温至60°C，继续反应20h，旋蒸除去吡啶和未反应的丙二胺，在正己烷-乙酸乙酯体系中重结晶得到白色结晶，即为目标半抗原倍他米松-3-氨丙基烯胺。2.倍他米松半抗原-载体蛋白的偶联(I)免疫原的制备取半抗原15mg用2.2ml 二甲基甲酰胺(DMF)溶解完全，制成溶液I ;取牛血清白蛋白(BSA) 70mg用6.8ml 0.lmol/L PBS (ρΗ7.0)溶解完全，制成溶液II ;将溶液I加入溶液II中，制成溶液III ;取碳化二亚胺(EDC) IOOmg用Iml水溶解后加入溶液III中，室温反应24h ;用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得到免疫原。(2)包被原的制备取半抗原15mg用2.2ml DMF溶解完全，制成溶液I ;取卵清蛋白(OVA) 70mg用
6.8ml 0.lmol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液II ;将溶液I加入溶液II中，制成溶液III ；取EDC IOOmg用Iml水溶解后加入溶液III中，室温反应24h ;用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得到包被原。3.倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将倍他米松半抗原、载体蛋白、倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L ρΗ7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长20(T800nm范围内扫描，得到倍他米松半抗原、载体蛋白、倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明倍他米松半抗原与载体蛋白偶联成功。4.抗倍他米松单克隆抗体的制备( I)动物免疫将免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生抗血清。(2)细胞融合和克隆化小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将倍他米松的单克隆抗体杂交瘤细胞株用冻存液制成I X IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射倍他米松的单克隆抗体杂交瘤细胞株5X IO6个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20°C保存。5.羊抗鼠抗抗体的制备以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。6.倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将质量分数为1%的氯金酸稀释成0.01%，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，在持续搅拌下每IOOml 0.01%氯金酸加入2.5ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水，4°C保存。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2，每毫升胶体金溶液加入50 μ g倍他米松单克隆抗体,继续搅拌混勻30min,加入10%牛血清白蛋白(BSA)至体积分数为1%，静置30min。12000r/min, 4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液:含酪蛋白0.02% 0.1%、吐温-20 0.05% 0.2%、ρΗ7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。7.倍他米松快速检测试纸条检测原理当倍他米松检测试纸条样品吸收垫端滴加待测样品溶液后，待检溶液通过样品吸收垫与结合物释放垫上的金标抗体一起向反应膜扩散，并最终渗入吸水纸中，扩散过程中样品中的倍他米松可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上倍他米松的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上包被的倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线不显色，而羊抗鼠抗抗体则可与金标抗体结合，质控线显色，呈阳性；相反样本溶液中无倍他米松则不能阻止金标抗体与反应膜上包被的倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线显示红色，同样羊抗鼠抗抗体也与金标抗体结合，质控线也显示红色，呈阴性；如果反应膜上没有红色标记显示，则试纸条无效。8.倍他米松快速检测试纸条检测操作方法( I)样本前处理称取0.lg±0.0lg (霜状、乳液)或0.1ml (化妆水)样品于IOml离心管中，加入IOml 0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液，涡动lmin，待检。(2)用试纸条检测用吸管吸取稀释后的待检样品溶液滴入试纸条加样孔内，滴加2 3滴于加样，力口后计时，5 10min内观察结果。超过15min样品检测判读无效。(3)检测结果分析倍他米松在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物与倍他米松结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测线上因为竞争反应，不会与倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图2所示。阴性:当质控线显示一条红色条带，检测线同时也显示出一条红色条带，且检测线颜色接近或浅于质控线时，判为阴性，如图2.a所示。阳性:当质控线显示一条红色条带，而检测线不显色，判为阳性，如图2.b所示。无效:当质控线不显示出红色条带，则无论检测线显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效，如图2.c所示。
权利要求1.一种检测倍他米松残留的胶体金试纸条，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，结合物释放垫的三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
3.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜上具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线。
4.如权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述的检测线与质控线平行。
5.如权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述检测线位于距离结合物释放垫一侧0.4cm 处。
6.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述样品吸收垫由玻璃棉或聚酯材料制成，所述结合物释放垫由纤维制成，所述吸水垫为吸水纸。
7.如权利要求1或2所述的试纸条,其特征在于,所述结合物释放垫喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物。
专利摘要本实用新型提供了一种检测倍他米松残留的胶体金试纸条，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。反应膜上具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，结合物释放垫喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物。本实用新型试纸条样品吸收垫可以将检测液体充分吸收，与结合物释放垫上喷涂的金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效地减少误差，操作简单快速、结果显示形象直观准确、成本低、灵敏度高，可以在倍他米松残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/74GK203069603SQ20132002872
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月19日 优先权日2013年1月19日
发明者何方洋, 万宇平, 付军权, 吴鹏, 聂雯莹, 尚朋朋, 蒲小容, 乔然 申请人:北京勤邦生物技术有限公司