能结合流感血细胞凝集素蛋白的合成肽的制作方法
【专利摘要】本发明提供能与流感血细胞凝集素（HA)蛋白结合及阻断pH-诱导的形状变化或流感血细胞凝集素（HA)蛋白的聚集的肽。本发明也提供流感血细胞凝集素蛋白中的可成药位点，所述可成药位点包含含有保守残基的肽序列。
【专利说明】能结合流感血细胞凝集素蛋白的合成肽 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及合成肽能结合流感血细胞凝集素（HA)蛋白及阻断pH-诱导的形状变 化/血细胞凝集素（HA)蛋白的聚集。本发明也涉及具有用于鉴定新可成药位点的全糖基 化的流感血细胞凝集素三聚体的溶液结构模型。 【【背景技术】】
[0002] 流感，古老的世界性病毒，其导致无法预测的周期性大流行病和季节性的暴发，及 给公共健康造成严重的负担。随时间增加，流感病毒的地理传播增加。最重要的是，此病毒 的物种间感染能力导致由随机基因排布出现更新株（1)。此特有的特征将其分类为最致死 的病毒之一。在针对流感株的一般的广谱治疗缺失下，形成了不同方法，包括使用病毒组分 作为疫苗（能逃脱此病毒的必要的通路的分子，除基于唾液酸部分的小分子筛选之外）而 发挥受体模拟物的作用。有趣的是，尽管流感已知经基因再排布而进化，以避开免疫系统和 对其表面组分的药物反应性，但此古老的世界性病毒的宿主细胞进入流程保持未变（2)。流 感感染，内体进入，与宿主膜融合，为复制而宿主遗传物质整合与及为进一步感染的原病毒 粒子的包装中不同事件的中枢点是低pH诱导的HA三聚体的打开。HA，病毒表面上的包膜 蛋白，聚合为三聚体，其在感觉低pH后打开，病毒进入的必要的事件（3)。HA的功能关联使 其成为相比其他表面表达的病毒分子更佳的治疗靶。但由于性质上可变，针对HA开发的分 子和/或抗体呈现株依赖性（4)。
[0003] 重要的是，HA可利用的结构数据仍缺乏与此分子结合的碳水化合物/糖部分的信 息（2)。用完整病毒的电子显微细节提示HA占总病毒表面的25?35%。HA糖蛋白作为近 似长度137A的穗存在（5)。功能性地，HA属于I类融合蛋白和I型TM类。I类融合蛋白 定义为蛋白中由构象变化介导的融合，和I型TM类表示蛋白的受体结合以及融合能力（6)。 起初，HA表达为无活性前体分子，HA0,其然后由宿主酶转变为有活性的，融合倾向于pH敏 感的分子（7)。有趣地，自然界在HA中编码了双活性，基于pH感知的活化及结合受体，及以 在将其遗传物质释放进宿主细胞之前克服2个障碍（8)。在遇到低pH后，HA分子的内部部 分经历环至螺旋转变，导致融合肽为有效病毒融合而向靶膜脱位100A(3)。不考虑HA是 糖基化的实体和对于病毒进入关键，无结构研究提供生理学关联糖基化的形式的信息。与 糖基化的HA相关的结构信息的缺乏限制可经HA分子靶向流感病毒的抗-流感药物/分子 的开发。
[0004] 在当前情景中，针对FDA批准的药物的药物抗性株的进化是令人担忧的（9, 10)。 为了克服株依赖性的屏障和病毒进化的快步幅，有开发更新靶位点和药物分子的需求。关 于HA的抗-流感药物开发的状态具有缺陷，如使用分子单体作为模板，使用非-糖基化的 晶体结构作为药物设计/筛选的起点，和株依赖性（4)。为了克服这些障碍，需在糖基化的HA分子中鉴定新靶位点。抗-流感治疗领域中的细节明显提示对糖基化的HA分子中靶位 点的鉴定及能阻断负责病毒-宿主膜融合的形状变化的小分子的需求。公开的本发明提供 实现这些需求的方式。
[0005]【发明目的】
[0006] 本发明的主要目的是提供能与流感血细胞凝集素（HA)蛋白结合及阻断pH-诱导 的形状变化或流感血细胞凝集素（HA)蛋白的聚集的肽。
[0007] 本发明的另一目的是提供具有用于鉴定新可成药位点的全糖基化的流感血细胞 凝集素三聚体的溶液结构模型及设计对此药物位点反应性的肽。
[0008]【发明概述】
[0009] 本发明提供能与流感血细胞凝集素（HA)蛋白结合及阻断pH-诱导的形状变化或 流感血细胞凝集素（HA)蛋白的聚集的肽。本发明的肽以独立于株的方式发挥作用。本发 明也提供流感血细胞凝集素蛋白中的可成药位点，所述可成药位点包含由SEQIDN0:21? 25表不的肤序列。
[0010] 【图表说明】
[0011] 图1表示随缓冲剂pH降低而HA三聚体粒径增加的基于SAXS的跟踪。在宿主膜 缺失下，在低pH，HA蛋白的成融设备被暴露，导致高分子量的寡聚体的形成（其通过使用SAXS跟踪）。随缓冲剂pH降低而H1N1HA三聚体尺度增加。通过分析溶液X-射线散射数 据来进行解析。重要的是，此图提供HA蛋白是三聚体及遵从导致此蛋白在低pH条件聚集 的pH诱导的形状变化的明确的证据。对来自其他流感株的HA蛋白以实验方式观察类似特 征：H5N1，H9N2，H3N2 和H14N5。在这些中，H1N1，H5N1 和H9N2 代表组 1，然而H3N2 和H14N5 分进流感株的组2。
[0012] 图2表示包括对保守的可成药位点反应性的肽的任何分子会干扰HA蛋白的天然 如行为和会阻断pH诱导的病毒进入宿主细胞的工作假说。此示意性模式图表示随低pH而HA三聚体中发生的结构变化（上方案）。基于已知道的文献，可总结，流感的包膜蛋白HA三聚体以可反转的方式经历动态打开及关闭，直到当平衡移向打开结构（其允许HA蛋白的 疏水段表露）时其遇到低pH。在缓冲剂中缺失任何去污剂情况下，疏水部分如在小图A中 所见聚集。下图表示我们的工作假说，当小分子（表示为黑色三角形）对HA蛋白的动态打 开及关闭关键的表位是反应性时，会干扰HA三聚体的pH诱导的打开（再下方案）。
[0013] 图3表示使用基于SAXS数据的模型鉴定蛋白中糖基化占据的体积。左图表示未 糖基化的模型的基于惯性轴的结构叠加，然而右图用基于SAXS的虚残基模型显示HA的糖 基化的模型。在这里SAXS包膜以黑色菱形显示，HA的基于同源性的模型以浅灰色表面表 示显示，和糖基部分以深灰色cpk表示显示。用基于SAXS的虚残基模型的HA三聚体的未 糖基化的（左）及糖基化的（右）模型的基于惯性轴的结构叠加。左侧显示的圆形区域显 示未占据的目标体积，然而右侧显示SAXS形状之内糖基部分的存在。
[0014] 图4显示在本发明中系统性鉴定的药物位点的视图。左图显示可成药袋的前视图 (白框显示HA三聚体中鉴定的袋），然而右图显示HA三聚体的俯视图，箭标指示袋打开。左 图显示HA三聚体的糖基化的形式的建模，其最佳-拟合基于SAXS-数据的以实验方式测量 的形状和体积特征。中图显示自生物信息学，分子建模及正常模式分析流程鉴定的位点的 俯视图。此位点由保守残基组成，及在HA三聚体的动态打开及关闭中起到整体作用。放大 视图（右图）显示可成药位点，其中为清晰，已去除第3链。得视图显示可成药位点如何存 在于HA三聚体的3侧。表1具有组成可成药位点的链间段的序列。
[0015]图5表示随缓冲剂pH而散射粒子的L值（与肽温育的HA分子结合的指标）的变 异。图显示HA单独及在抑制性肽存在下pH依赖性结合。左上部小图显示H1N1-HA的在不 同pH值的长度变化。此图中的其他图使用SAXS显示不同肽在溶液条件下，阻断HA三聚体 的pH依赖性打开的比较性能力。
[0016] 表1总结组成流感血细胞凝集素蛋白中的药物位点的链间段的序列。上标提及自 一级结构的残基数。
[0017] 表2总结由发明人合成及用于体外筛选能阻断来自不同流感株的HA三聚体的pH-诱导的打开的肽的不同肽序列。阻断pH-诱导的变化的能力通过估计溶液中粒径尺度 (相对于缺少任何肽的样品）定性地标位。发明人鉴定了PF11，PF12,PF13,PF31，PF32，PF41，PF42和LPF54表示的8种优选的肽，其显示阻断来自5种不同病毒株H1N1，H5N1，H9N2,H3N2和H14N5的HA蛋白的pH引发的形状变化的能力。符号+，++，+++及-分别表 示低活性（即，在基于SAXS的长度中0?33%增量），中等活性（在基于SAXS的长度中 33?66 %增量），良好活性（在基于SAXS的长度中66?100 %增量）和无活性肽。
[0018]【发明详述】
[0019] 如本文所用，"SAXS"指称用来研究分子的初级溶液结构的小角X-射线散射方法。
[0020] 如本文所用，"散射形状"指称导致特定散射特征的分子的形状。
[0021] 如本文所用，"可成药位点"指称在与药物分子反应之后会停止病毒进入和增殖的 表面。
[0022] 如本文所用，"生理学关联"指称最佳或紧密表示生理条件的状态。
[0023] 如本文所用，"聚集物或结合物"指称在低pH条件下，在HA蛋白中发生的多聚体结 合。
[0024] 如本文所用，"有效量"指称实施或足以达到期望的生物学活性的肽量。本领域技 术人员会能通过常规实验确定有效量。
[0025] 如本文所用，"载体"指称发挥能携带外源基因进入宿主细胞的媒质的作用的DNA分子。优选地，载体应能复制，具有将本身导入宿主细胞的系统和应具有可选择的标志物。 而且，优选，载体应能表达DNA分子及编码肽序列。
[0026] 如本文所用，"药学可接受的"指称物质诸如载体或添加剂，其不消除组合物或疫 苗的任何组分的生物学活性或性质。
[0027] 如本文所用，"载体"指称辅助化合物进入细胞或组织的相对非-毒性化合物或剂。
[0028] 流感由于暴发规模，时机及引发由于当病毒存在于不同物种中时发生的基因排布 而仍无法预测的病原性病毒的亚-株而仍是生物医学挑战。本发明旨在开发以株独立方式 具有抗-流感效力的小肽/模拟物。
[0029] 因此，本发明提供能结合流感血细胞凝集素三聚体蛋白及阻断其低pH诱导的形 状变化或聚集的肽。如设计的及筛选的，这些肽通过结合病原性流感的HA三聚体中保守的 表位和阻断它们的低pH感觉的打开和进入宿主细胞（为复制）来发挥作用。这些肽和它 们的类似物或变体以株独立方式阻断HA三聚体的低pH诱导的打开（其对于HA蛋白在宿 主细胞内体中与其受体融合必要）。
[0030] 在此方向上，发明人制备了HA三聚体的生理学关联结构。尽管此蛋白是糖蛋白， 其结构仅已在去糖基化的形式中解析，和晶体结构不辅助认识HA蛋白的动态性质。如此， 发明人对来自不同流感株的HA三聚体蛋白获取了溶液SAXS数据。本领域技术人员会同意， 使用各种流感株实施此研究是可能的。为当前研究，发明人鉴定及使用了 5种不同流感株， 即H1N1，H5N1，H9N2,H3N2和H14N5及构建了它们的散射形状。在这些形状约束之内，发明 人使用基于相似性的方法对残基-水平结构建模，及设糖基化部分，散射数据及知道的质 量值为参照。而且，pH变化显示三聚体蛋白的聚集，其指示，这些蛋白在自病毒表面切除后 是正确地折叠的。通过分析此结构的形状特征之内的病原性流感数据库，发明人鉴定了由 链间接触形成的及由缺少向糖基化的倾向的保守残基组成的区域。由发明人鉴定的区域包 含在不同流感株之中保守的小肽序列。由此，区域能用作可成药位点。
[0031] 因此，本发明提供包含由SEQIDN0:21?25表示的肽序列的可成药位点。表1 提供可成药位点的链间段的序列。
[0032] 表 1 rnnqql
【权利要求】
1. 能与由SEQIDN0:21?25表示的流感血细胞凝集素（HA)蛋白的肽序列结合的肽， 其中所述肽能阻断pH-诱导的形状变化或流感血细胞凝集素（HA)蛋白的聚集。
2. 权利要求1的肽，其中所述肽阻断流感血细胞凝集素（HA)三聚体蛋白的低pH-诱导 的打开。
3. 权利要求1的肽，其中所述肽以独立于株的方式发挥作用。
4. 权利要求1的肽，其中所述肽是合成肽及选自SEQIDNO: 1?8,且其中所述肽也包 括其类似物和变体。
5. 组合物，其包含权利要求1的肽，及药学可接受的添加剂和载体。
6. 流感疫苗，其包含权利要求1的肽作为活性成分。
7. 抗体，其识别由SEQIDNO:21?25表示的肽序列之任一个。
8. 试剂盒，其包含用于治疗由流感病毒导致的疾病的权利要求1的肽，及使用说明手 册，及任选地添加剂和载体。
9. 治疗由流感病毒导致的疾病的方法，所述方法包括给有需求的受试者施用有效量的 权利要求1的肽或包含所述肽的组合物或缀合物。
10. 权利要求9的方法，其中所述肽通过使用可生物降解的纳米粒子递送。
11. 权利要求9的方法，其中所述肽由下列途径施用：静脉内，肌内，脊柱，硬膜上，经 皮，皮下，肠胃外，鼻内粘膜，口腔或直肠途径。
12. 权利要求9的方法，其中所述肽在治疗选自下列的生物中有效：人，圈养动物，鸟和 家禽。
13. 权利要求8的方法，其中所述肽单独或组合使用。
14. 能与由SEQIDN0:21?25表示的流感血细胞凝集素（HA)蛋白的肽序列结合的肽 用于治疗由流感病毒导致的疾病的用途。
15. 核苷酸序列，其编码权利要求1的肽的氨基酸序列。
16. 载体，其包含编码权利要求1的肽的核苷酸序列。
17. 流感血细胞凝集素蛋白中的可成药位点，所述可成药位点包含由SEQIDN0:21? 25表不的肤序列。
18. 权利要求17的可成药位点，其中可成药位点对于筛选抗流感/流感药物有用。
19. 流感血细胞凝集素（HA)蛋白作为药物靶位点的用途，其中所述流感血细胞凝集素 蛋白包含由SEQIDNO:21?25表示的肽序列。
20. 流感血细胞凝集素（HA)蛋白用于筛选潜在抗-流感药物的用途，其中所述流感血 细胞凝集素蛋白包含由SEQIDNO:21?25表示的肽序列。
21. 制备权利要求1的肽的方法，其包括下列步骤： (a) 使血细胞凝集素蛋白经历SAXS分析， (b) 使用步骤（a)中获得的散射数据产生基于溶液散射的虚残基模型， (c) 比较步骤（b)中获得的基于溶液的模型与为用于散射分析的蛋白产生的基于同源 性的模型，以鉴定百分率糖基化， (d) 向血细胞凝集素的结构覆盖溶液模型和自步骤（c)获得的百分率糖基化，以鉴定 糖基化位点， (e) 自步骤（d)获得糖基化位置，其中对基于同源性的模型实施计算的糖基化，以拟合 步骤（b)中获得的溶液结构，及获得代表性的模型， (f) 在自步骤（e)获得代表性的模型之后实施全部病原性序列的多序列分析，以鉴定 保守残基， (g) 将步骤（f)中鉴定的残基定位在自步骤（e)获得的结构上， (h) 使用步骤（f)中产生的模型，自相邻链鉴定涉及维持链间接触的残基， (i) 从自步骤（f)，（g)及（h)获得的信息鉴定保持保守的，未糖基化的，表面暴露的及 涉及维持链间接触的袋， (j) 使用步骤（a)?（i)鉴定糖基化的血细胞凝集素三聚体的头区中的可成药位点， (k) 基于步骤（j)中鉴定的袋导出形成袋的肽序列， (l) 使用在2-C1三苯甲基珠上使用F-moc化学的固相肽合成来合成互补于步骤（k)中 获得的序列的肤， (m) 通过使用4当量的保护的Fmoc-氨基酸，用HBTU(2-(1H-苯并三 唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸盐）作为偶联剂来执行步骤（1)中获得的肽的 链延伸； (n) 由HOBT(n-羟基苯并三唑）或C0MU(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基） 二甲基氨基-吗啉代-碳鎗六氟磷酸盐抑制步骤（m)中获得的肽的外消旋化； (〇)由Kaiser测试确认步骤（n)中各偶联反应的完成， (P)使用TFA切割切割步骤（〇)中获得的肽， (q) 在切割步骤（P)中获得的肽之后合成肽， (r) 使用反相HPLC将步骤（q)中获得的肽纯化至同质， (s) 由质量光谱法表征步骤（r)中获得的肽， (t) 使用基于SAXS的pH实验针对血细胞凝集素体外筛选步骤（s)中获得的肽。
22. 权利要求21的方法，其中步骤（a)?（j)包括鉴定血细胞凝集素蛋白中的"可成 药位点"的过程。
23. 权利要求21的方法，其中步骤（j)中鉴定的血细胞凝集素蛋白的"可成药位点"对 于筛选抗流感/流感药物有用。
24. 权利要求21的方法，其中糖基化的HA蛋白从选自下列的流感病毒株分离：H1N1，H5N1，H9N2,H3N2 和H14N5。
【文档编号】G01N23/201GK104220091SQ201380019490
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年2月14日 优先权日:2012年2月14日
【发明者】A·福纳, K·潘迪, Y·S·拉托尔 申请人:科学与工业研究会