复杂生物样品如血清的深度maldi tof质谱及其用途
【专利摘要】本申请描述了一种采用MALDI-TOF质谱仪分析生物样品(例如血清或其他基于血的样品)的方法。该方法包括以下步骤：将样品施加于MALDI-TOF样品板上的样品点，引导超过20,000次激光射击至样品点的样品，并从仪器收集质谱数据。在一些实施方案中，至少100,000次激光射击和甚至500,000次射击被引导至样品上。已经发现，该方法(被称为“深度MALDI”)导致质谱中噪音水平的降低，并且可以从样品获得显著量的额外的谱信息。此外，在较少射击可见的峰变得更容易界定并使得样品之间的比较更加可靠。
【专利说明】复杂生物样品如血清的深度MALDI TOF质谱及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U. S. C. § 119要求2012年5月29日递交的序列号为61/652, 394 的美国临时申请的优先权，该申请的内容通过引用并入本发明。
[0003] 背景
[0004] 本申请公开的内容涉及质谱法、生物标记物发现、测定开发和临床测试领域。
【背景技术】
[0005] 在 MALDI (matrix assisted laser desorption ionization，基质辅助激光解析 电离）TOF(time-of-flight,飞行时间）质谱法中，样品/基质混合物被置于金属板（被称 为MALDI板）上规定的位置（本文中的"点"或"样品点"）上。激光束被引导至该点上的 位置上持续非常短的瞬间（被称为"射击（shot)"），导致该样品的分子或其它成分的解吸 和电离。该样品成分"飞"至粒子检测器。仪器测量该样品中以质谱形式存在的成分（分 子）的质荷比（m/z)和相对强度（intensity)。
[0006] 通常，在MALDI-T0F测量中，有数百次射击被施加于MALDI板上的每个点并且所得 到的谱（每次射击一个）相加或相平均以对每个点产生一个总质谱。美国专利7, 109, 491 公开了在MALDI-T0F质谱中所使用的代表性的MALDI板。这些板包括多个单独位置或点并 且样品在此被施加于板上，通常以或许数百个这样的点的阵列的形式布置。
[0007] 至少在复杂生物样品（例如血清和血浆）的质谱领域中，传统的观点是没有必要 使样品经受超过大约1，〇〇〇次射击，否则蛋白量会耗尽，仪器中的激光和探测器会造成过 度磨损，并且另外，额外的射击不会显示该样品显著量的额外信息。因此，当从复杂生物样 品获得质谱数据时，例如在生物标记物发现研究过程中，通常每个样品点采用500-1000次 射击。
[0008] 血清或血浆的标准MALDI-T0F MS中的可检测的蛋白的数目被认为受循环中的 蛋白丰度的大的动态范围所限制。（Hortin G.L., The MALDI-T0F mass spectrometric view of the plasma proteome and peptidome. Clin. Chem. 2006;52:1223-37)。因此， 通常认为血清的MALDI-T0F MS只能用于在微摩尔每升的范围中的高丰度蛋白。这与观 察到MALDI-T0F质谱可能是非常灵敏的技术从而检测在纯化样品中甚至是痕量的量的情 况才目反。（Albrethsen J. The first decade of MALDI Protein profiling:A lesson in translational biomarker research. J. Proteomics 201174:765-73)。本专利申请解释了 这种差异并提供了扩大了从简单样品至复杂生物样品（如血清或血浆）的MALDI-T0F MS 的高灵敏度的方法学。
[0009] 美国专利7, 736, 905 (受让给本发明的受让人）部分描述了峰鉴定、质谱比对、标 准化方法和用于生物（如血清）样品的质谱的其它预处理技术及其在预测患者施用抗癌药 物的反应中的用途。该'905专利其全文通过引用并入本文。
[0010] 发明概述
[0011] 在最近的探索性研究中，本发明人已经发现，收集并平均来自同一 MALDI点或来 自同一样品的多个点的累计谱的组合的多次（超过20, OOO次，并且通常为100, OOO至 500, 000次）射击，导致噪音对信号的相对水平降低，并且发现显示了来自复杂生物样品的 质谱的显著量的额外的谱信息。此外，多个使用MLDI TOF MS的标准范例似乎是完全错误 的。首先，在点上的蛋白量完全耗尽之前对单个点进行数十万的射击是可能的。其次，通过 平均化多次射击产生的噪音降低导致之前不可见的峰的出现（即在1，〇〇〇次射击时不明显 的峰）。再次，当样品经受非常大量的射击时（远远超过1，〇〇〇)，即便之前可见的峰变得也 更容易界定并使得峰强度的测量和样品之间的比较更加可靠。
[0012] 作为一个例子，本发明人已经令人惊讶地发现，当血清或其它基于血的样品以每 点大于20, 000次射击，并且通常每点250, 000或更多次射击，并且甚至采用多个MALDI点 2, 800, 000次射击进行MALDI-T0F时，每个实验均显示并没有使得点的蛋白量不可用。进一 步发现，在这些射击数所获得的谱中含有非常显著量的谱信息（峰），而当该样品经受通常 的500或1，000次射击时这些谱信息并不显示。在例如200, 000次射击所显示的峰被认为 相对应于在血清样品中存在的微量完整的（未消化的）蛋白。采用本发明所述的技术和 被本文称为"深度MALDI"方法（即每点大于20, 000次射击，并优选从同一点或从多个点的 组合大约250, 000至750, 000或更多次射击），认为可以以半定量和可再现的方式检测非常 大量的蛋白，并且可能是存在于血清样品中的所有蛋白的至少一半。以半定量方式的检测 意味着强度的测量（峰高、峰下面积）与样品中蛋白的绝对丰度或浓度有关。以可再现方 式的检测意味着可以多次测量同一样品并且在某种可接受的变异系数内获得相同的结果。
[0013] 从单个MALDI点获得超过20, 000次射击可能超出现代MALDI-T0F仪的参数；但是 在本文中我们描述了解决此限制的几种方法。理想的，MALDI-T0F仪器的设计适合本文中 所述的"深度MALDI"方法，并且在下文中提供了用于此类机器的几种具体建议，包括自动光 栅扫描性质和在单个点上大幅进行更多次射击的能力。
[0014] 采用来自MALDI样品点的数十万次射击的最迫切的问题是，通常点制备仅在点内 的一些射击位置产生足够的离子流以基本上形成组合谱中的信号。虽然采用耗费劳力的手 动处理在MALDI板上给定点内通过视觉选择用于激光射击的高离子产率的位置而已经获 得了初步结果，并且可能继续进行该方法，但是可能使选择用于激光射击的位置的过程自 动化并且优选用于本发明的高通量实施（如果不是出于不浪费太多激光射击和降低激光 寿命的简单原因）。另一种方法是某种方式改善MLDI点的质量从而使大多数随机选择的 位置产生高离子流。两种方法都可用于深度MALDI谱的产生。
[0015] 本文描述了几种使谱的获取自动化的方法。获取的自动化可以包括定义光栅形式 的点的激光扫描的最佳移动图，以及在点内离散的X/Y坐标位置的多个光栅扫描的特定化 序列的产生以导致来自一个或多个点的比如说750, 000或3, 000, 000次射击。例如，从每 四个样品点各自的250, 000次射击获得的谱可以组合形成1，000, 000次射击的谱。如前所 述，在含有同一样品的多个点上收集到的数十万次射击至数百万次射击可以一起平均以建 立一个谱。一种自动化的方法包括产生用于样品点的非连续X/Y光栅扫描的光栅文件。另 一种方法包括将所述点分成子点的网格（例如，3X3或5X5的网格）并产生用于子点的离散 X/Y坐标位置的光栅扫描的光栅文件。公开的第三种方法采用图像分析技术鉴定含有相对 高浓度的样品材料的用于获得质谱（多次射击）的感兴趣的区域和/或蛋白浓度相对低的 那些区域，并在相对高蛋白浓度的区域中进行谱获取。
[0016] 本发明的另一个方面涉及优化将样品施加到MALDI板（"点样"）的方法以在单个 点内产生样品/基质的均一、均匀的晶体。该方法有利于采用自动化方法从MALDI板上单 个点获得数十万次射击。
[0017] 本发明的这个发现和方法具有许多应用，包括生物标记物发现、测试研发、物质测 试、现有测试的验证以及假说产生，例如在生物标记物发现工作中。通过与当前方法学相比 能够以高通量的形式可再现地定量复杂样品中的更多蛋白的量，所述方法进一步强化了质 谱研究中的"稀释上样（dilute and shoot)"方法的潜力。例如，所述方法可以用于运动员 的兴奋剂测试，药物测试，例如用于检测THC分析物，代谢物测试，癌症抗原125 (CA-125)、 前列腺特异性抗原（PSA)或C反应蛋白的存在和量的测试，以及环境或食物测试。其它应 用的例子包括通过相关研究根据患者来自回顾性样品的临床样品的蛋白含量继续临床测 试的开发，和后续临床验证。
[0018] 本文中所用的术语：
[0019] 1.术语"瞬态谱"是从指向MLDI点中的单个位置或x/y位置的单个激光射击包 所获得的谱（每个包由规定数量的射击组成，例如100、500、800次射击等）。
[0020] 2.术语"位置谱"是指在激光射击MALDI点中同一位置X次时一个或多个瞬态谱 的累计总和。
[0021] 3.术语"点谱"是指在完整的单个MALDI点上射击过程中所获得的所有位置谱的 总和。点谱可以仅采用加法操作以将位置谱加和而得，或在进行比对和/或标准化操作（例 如总离子流标准化）之后对位置谱采用加法操作获得。通常可以从MLDI点上的100, 000 至500, 000次射击获得点谱。获得点谱的其它选择是可能的，包括：a)对位置谱进行背景 减除和标准化，然后加和；b)对位置谱进行背景减除和比对，然后加和；c)对位置谱进行背 景减除、比对和标准化，然后加和。我们已经发现通过位置谱的总离子流标准化（详见美国 专利7, 736, 905)然后加和，获得了最佳动态范围；可在点谱中进行任意背景减除。
[0022] 4.术语"射击位置"是指激光束在此拦截用于射击的MALDI点的给定位置。为了 在每个MALDI点获得200, 000或500, 000次射击，激光束被引导在MALDI点上多个（例如， 数百个）单独的射击位置，例如，采用在该点上的激光束的光栅扫描以手动的形式或更优 选地以自动的形式。如下所述，光栅图设计是重要的，因为通常不希望连续地射击紧邻点位 置。因此，光栅图设计依次选择具有一些空间间隔的射击位置并以空间位移的方式在整个 MALDI点上重复扫描以避免该点中紧邻位置的连续射击。
[0023] 5.术语"瞬态谱过滤"是指用于或接受或拒绝瞬态谱的过滤或选择过程。作为一 个例子，在瞬态谱过滤中，为了使瞬态谱被接受，在预定m/z范围内的最小数量（例如5个） 的峰必须存在于该瞬态谱中，并且该瞬态谱中信噪比必须高于指定阈值。也可以采用其它 过滤标准，例如谱的总离子流需要超过某一预定阈值，或通过采用如下所述的排除列表或 包含列表。谱过滤从整体上或接受或拒绝该瞬态谱。
[0024] 6.如本发明所用的，术语"复杂生物样品"定义为含有数百或数千种分析物（例如 完整蛋白）的样品，分析物的丰度分布于一个大的动态范围，通常为许多个数量级。此类复 杂生物样品的例子包括血或其成分（血清或血浆）、淋巴、导管流体、脑脊液以及表达的前 列腺分泌物。此类复杂生物样品还可以由环境样品或食物样品组成。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1A-1C是所选择的质/荷范围（m/z比为7, 000至8, 000)中同一样品的三个 MALDI质谱的示意图，示出了随着射击数的增加可检测峰量的增加。图IA的谱是由2, 000 次射击造成的，图IB的谱是由100, 000次射击造成的，以及图IC的谱是由500, 000次射击 造成的。请注意由我们的方法得到的图IB和IC的谱是如何显示出样品的丰富的谱信息， 其在图IA的谱中不存在的，其基本上显示为噪音。
[0026] 图ID和IE是显示在我们的深度MALDI方法中所获得的巨大动态范围的谱的质谱 的进一步的例子。在图ID中，7140至7890Da的m/z范围内的部分谱在图ID的插图中放大 显示，其显示了在大约500, 000次射击获得的丰富谱信息。在图IE中，在Y轴放大的插图 中显示谱，目的是显示在m/z大约9520的区域中的额外谱信息和峰，其采用深度MALDI方 法可以显示而在通常?1，〇〇〇次射击的谱中是不可见的。
[0027] 图2A是含有384个样品点或排列成矩形阵列的"点"的MALDI-T0F靶板的俯视 图。这些点通过列号1…24和行A…P来确定，例如左上点被确定为A1。图2B是单个样 品点Pl的放大图，显示其被分成具有X/Y位置坐标并且在该点的中心具有原点（0,0)的 5X5的矩形网格。如本文详述的，矩形网格和位置坐标用于自动化光栅扫描方法以从该点的 100, 000或更多次射击获得谱。
[0028] 图3是图2A的MALDI板中的单个点中沉积的生物样品/基质混合物的照片。理 想情况下，该点含有在该点内的均一、匀质的结晶样品，如图3所示。
[0029] 图4是用于从图3的点获得100, 000或更多次射击中使用的一个可能的光栅扫描 图的示意图。光栅扫描该点多次，例如25次。图4中所示的每组符号（三角形、正方形、 X等）描述了一组单独的、离散的X/Y位置，其中该点以在单个光栅扫描中在此被扫描（射 击）。在每个位置，该点可以经受:多次射击，例如700或800次射击。
[0030] 图5是显示图4的光栅扫描图叠加到图3的样品点上的示意图。
[0031] 图6是来自MALDI-T0F仪用户界面的屏幕截图，其显示了来自每位置/光栅800 次激光射击的，例如在图2B或5的光栅扫描中的，用于加和累计谱的命令。
[0032] 图7是部分样品点的图，显示样品/基质混合物没有以空间均一的方式结晶的区 域。
[0033] 图8是来自MALDI-T0F仪用户界面的屏幕截图，显示由仪器中的照相机捕捉到的 部分点的图像，以及选择一组点用于点的自动光栅扫描。
[0034] 图9是另一个来自MLDI-TOF仪用户界面的屏幕截图，显示用于评价谱、谱的累计 以及用于以不同方式发射（firing)的跨越点激光的移动。
[0035] 图10是在数据获取过程中用于接受或拒绝瞬态谱的评估页面的屏幕截图。
[0036] 图11是显示用于消除背景峰的排除列表的屏幕截图。
[0037] 发明详述
[0038] L 概览
[0039] 业已发现，在MALDI-T0F质谱中使复杂生物样品（例如基于血的样品）在单个 点上接受大量射击（>20, 000并甚至100, 000或500, 000次射击）导致噪音水平的降低 和之前不可见峰（即在2, 000次射击时不明显的峰）的显现。此外，这可以在不耗尽样 品的蛋白量的情况下完成。另外，之前的可见峰变得更容易界定，使得样品之间的比较更 加可靠。在基于血的样品的标准谱（?1，OOO次射击）中，通常可见60-80个峰是，而用 200, 000次射击通常可见?200-220个峰，用500, 000次射击通常可见?450-480个峰， 并且用2, 800, 000次射击通常可见?760个峰。应当理解的是，本文所报道的峰的数量与 MALDI-TOF仪器设置有关并且这些数量仅仅是一个粗略的指导；根据仪器设置并且还根据 具体的峰检测算法（以及当然还根据真实的样品），将可见更多或更少的峰。还必须注意 的是，峰的质量和强度定量（与丰度相关）还至少在某种程度上较好，如下面所讨论的图 1A-1D所示。
[0040] 图1A-1C是所选择的质/荷范围（m/z比为7, 000至8, 000)的图，该图显示了同 一样品的三个谱，显示了可检测峰量随着射击数增加而增加。图IA的谱是由2, 000次射击 造成的，图IB的谱是由100, 000次射击造成的，图IC的谱是由500, 000次射击造成的。特 别注意图IA的谱是如何基本上显示为噪音的并且似乎含有少量或无法分辨的感兴趣的谱 信息。将图IB与IA相比，其中图IB的谱（由100, 000次射击获得的谱）含有许多单独 峰，例如在10)的地方鉴定的峰，其不存在于图IA的谱中。在图IC的谱中，在该谱中显示 了许多没有在其它谱中显示过的峰，或者是可能已经被视为在底部谱中的噪音的峰。将图 IC和IB与图IA相比，很明显，在100,000次射击和500,000次射击时显示出在图IA的谱 (2, 000次射击）中不存在的丰富的谱信息，并且如图IB和IC所证明的，深度MALDI方法降 低了噪音水平。
[0041] 图IB和IC的谱将谱的灵敏度提高至可以具体化并且可以将峰强度与丰度关联起 来的动态范围。可以采用峰强度分析复杂生物样品中给定浓度的分子的存在。例如，在该 方法中可以定义样品中感兴趣的分子（已知质量），掺杂样品至目标丰度水平（摩尔浓度， 或ppm)并施加于MALDI板；对板上进行若干射击（例如超过100, 000次）直到该分子可靠 地以特定丰度（强度）存在于该谱中（已知m/z坐标（position)处的峰），并记录射击的 数量（"x"）。这种产生所谓"参考谱"的过程用于常规定量和标准化方法以确保可靠性， 这对于本领域技术人员来说是明显的。然后，使用于测试的感兴趣的样品经受MALDI-T0F 以及数量为X的射击。如果所得到的谱显示在对应于感兴趣分子的已知位置的峰强度小 于参考谱中峰轻度，那么样品中该感兴趣的分子的浓度低于用于产生参考谱的样品中该分 子的浓度。该方法可以同时用于多个分析物。此外，可以针对感兴趣的分子在已知浓度范 围内在X次射击处获得多个参考谱，并且测试谱可以与参考谱相比以确定该感兴趣的分子 在测试样品中的大致浓度。该方法可以用于多种目的，例如药物测试，例如运动员的代谢物 浓度测试，环境样品测试等。感兴趣的分子可以是蛋白，例如，代谢物、癌症抗原（CA) 125、前 列腺特异性抗原（PSA)、C反应蛋白等，质量范围大约IK道尔顿至50K道尔顿。
[0042] 图ID是在深度MALDI方法中显示的谱中的巨大动态范围的示意图。图ID中的插 图是m/z范围在7140kDa至7890kDa之间的部分谱，显示大约?500, 000次射击获得的谱 和多个峰10。背景估算（虚线）被叠加在谱上，其可被减除以产生背景减除的谱。注意插 图中的谱信息并且尤其是许多峰10在图ID的主要部分中是不可见的。在图IE中，为了显 示在m/z大约9520的区域中峰的额外的谱信息并且尤其是强度信息（其采用深度MALDI 方法可以显示而在通常?1，〇〇〇次射击的谱中是不可见的），在Y轴放大的插图中显示谱。
[0043] 图2A是含有384个样品点或"点"14的排列成矩形阵列的MALDI-T0F靶板的俯视 图。这些点通过列号1…24和行A…P来确定，例如左上点被确定为A1。图2B是单个样品 点Pl (14)的放大图，其与具有原点（0,0)的X/Y坐标系统16叠加。显示样品点14被分成 5X5的矩形网格，25个单独的子点18。如下详述，矩形网格18和位置坐标系统16用于自动 光栅扫描方法以从点获取100, 〇〇〇或更多次射击。
[0044] 初步注意到，自动产生大量射击（>20, 000)不是绝对必须的并且可以使用在现有 的MALDI-T0F仪器中存在的特征。总的来说，在本发明的深度MALDI技术中，重要的是在 MALDI点上选择当暴露于激光射击时产生高蛋白产率的位置。现有质谱仪器中的标准软 件允许采用常规预定路径在点上移动，即正方形图、六边形图、螺旋图（从一个点的中心）。 MALDI板上的射击位置被定义在被称为'教导（teaching)'的过程中，其是Bruker公司的 现有MALDI-T0F仪器中的FlexControlTM(Bruker)质谱控制软件的一部分。（虽然本文偶 尔提到Bruker公司仪器的特征，但本发明的方法显然不限于任何特定的仪器或特定制造 商的仪器。）
[0045] 图3显示了含有在点中均匀分散的样品/基质混合物的MALDI点的例子。来自 Bruker公司的质谱仪包括显示MALDI点的区域的内置照相机；在手动选择中可以选取明亮 位置30以瞄准激光。应当避免黑暗位置32。有时候明亮位置不产生好的视野（yield)，其 可能与盐结晶的存在有关。在射击程序的过程中，点中的区域可能被耗尽；因此，需要避免 黑暗区域（低视野（low yield)的耗尽区域）。手动方法会在射击过程中持续获取并显示 点的图像。
[0046] 在我们的初步实验过程中，我们发现由于使用越来越多次射击，找到好的位置变 得越来越难。在重复使用同一个点时见到这种效果，例如在前一个五十万次射击之后加入 第二个五十万次射击。第二轮并没有使质谱中的噪音水平降低如预期的那么多。实际上，所 得到的平均谱可能具有糟糕的整体质量，可能是由来自太多空位置的平均射击导致的。如 果单独采用眼睛选择射击位置并接受或拒绝谱而不采用瞬态谱过滤，这可能会导致针对早 期位置的获取偏差，并且这种偏差需要受到控制。如果采用自动光栅扫描和位置谱过滤，可 以消除该偏差。
[0047] 然而，为了提高通量，期望自动化位置选择的过程并从给定点获得高的射击数。下 文描述了几种方法。下文所述的方法能够在13-15分钟里从位于MALDI板中三个点上的样 品获取750, 000次射击（每个点250, 000次射击），样品需要量为3微升血清。
[0048] 2.质谱采集的自动化
[0049] 虽然通过采用耗费劳动力的手动过程在MALDI板上的给定点内通过视觉选择用 于多次射击的位置以实现每点1〇〇, 〇〇〇或500, 000次射击而已经获得了结果，并且可能继 续进行该方法，但仍可能使选择用于激光射击的位置的过程自动化，并且在本文中描述了 几种方法。获取的自动化可以包括定义光栅形式的点的激光扫描的最佳移动图，以及在 点内离散的X/Y位置的多个光栅扫描的序列产生，以产生来自样品点的比如说100, 000、 250, 000或500, 000次射击。一个自动化方法包括样品点的非连续X/Y光栅扫描的光栅文 件的产生。光栅图设计是重要的，因为通常不希望连续地射击紧邻点的位置。因此，光栅图 设计依次选择具有一些空间间隔的射击位置并以空间位移的方式在整个MALDI点上重复 扫描以避免连续射击该点中的紧邻位置并选择新的射击位置。
[0050] 另一种方法包括将所述点分成子点的网格（例如，3X3或5X5的网格）（参见图2B) 并在子点的离散的X/Y坐标位置产生用于光栅扫描的光栅扫描文件。
[0051] 公开的第三种方法采用了图像分析技术鉴定含有相对高浓度的样品材料的用于 获得质谱（多次射击）的感兴趣的区域和/或样品（例如蛋白）浓度相对低的那些区域， 避免了在相对低样品（例如蛋白）的区域内获取谱。A.非连续X/Y坐标的光栅扫描
[0052] 使从点获得大量射击的过程自动化的一个方法包括产生用于样品点的非连续X/Y 光栅扫描的光栅文件。这可以结合图4和5来描述。
[0053] 图4是用于从图3的点获得100, 000或更多次射击的光栅扫描图案400的示意图。 以连续的方式光栅扫描该点14多次，例如25次。图4中所示的符号组描述了一组独立的、 离散的X/Y位置，在此该点以单个光栅扫描的方式被扫描（射击）。根据图中所示的具有 中心原点（位置〇,〇)的坐标系统定义X/Y位置。在扫描过程中，当激光被引导到每个位置 时，该位置的样品可以经受大量的射击，例如每个坐标位置/位置700或800次射击。从图 4所示的图案可以注意到，每个光栅扫描由对该点内的单独的、离散的位置的射击组成。顺 次完成单独的光栅扫描，由此避免射击点内的紧邻位置。图5显示的是图4的光栅图叠加 到图3的点上的图。
[0054] 如图4所示的具有用于光栅扫描的非连续X/Y坐标的25个光栅文件的产生过程 描述于附录1中，其是本公开内容的一部分。
[0055] B.采用网格将点分成子点以及子点的光栅扫描
[0056] 该方法的目的是使在样品点上手动选择位置/光栅（即点A1、点A2等）的过程自 动化，这导致在数据获取过程中"可接受的"谱并如此做直到数十万谱被加至加和缓冲区。 如前所述，加和/平均数十万谱增加了信噪比，并因此允许对显著更多峰的检测。
[0057] 如上述利用非连续光栅扫描的情况，如图3所示，当所述样品/基质混合物基本上 均匀地并均质地分布于整个点时，在该章节中所述的网格的使用效果最好。实现这一目标 的目前优选的方法描述在本文后面用于稀释上样血清和芥子酸（基质）的部分。因为这种 均匀的分布，我们由此可以从样品点上几乎所有的位置/光栅获取谱，这省去了对所有位 置/光栅的"可接受"谱的初步评估。
[0058] 通过定义将点14细分成覆盖样品点的子点或网格元素18的网格（图2B)，并收 集来自各子点18内每个位置/网格点的所定义的谱数直至所需谱数已经被加至加和缓冲 区，可以实现样品点上数十万谱的收集。Bruker软件之前的版本仅允许以自动模式每个样 品点最多20, 000个总谱的加和（图6)。
[0059] 为了避免这种限制，我们最初定义一个5X5的网格区域（图2B，16)，其将每个样品 点分成二十五个8x8的网格或子点18 (图2B)。对每个网格或子点18产生一个单独的光 栅文件。指示仪器对网格18内的每个位置/光栅获取800个谱（射击）直到20, 000个谱 已经被加至（谱）加和缓冲区。此时，自动方法1指示仪器移至下一个网格或子点18并使 用下一个光栅文件并产生另一个20, 000个谱。在实践中，设计25个光栅文件，针对每个子 点18设计一个，每个光栅文件与单独的autoExecuteTM(Bruker)方法连接，所述方法根据 该方法内的评估标准设定获取数据。
[0060] 该过程允许在20, 000次射击的批量中获取500, 000次射击谱（每个网格20, 000 次射击谱X 25个网格），每个采用Bruker's flexcontrolTM软件工具而不必采用如 flexImagingTM(Bruker)的成像程序。该过程的结果是一个样品点25个谱文件，每个均含 有一个由20, 000次射击谱组成的加和谱。然后，这25个谱文件可以被加和以产生针对由 500, OOO次射击所获得的MALDI板上单个点的总谱，如图1C、ID和IE所示。
[0061] 最新版本的f lexcontrol TM(Bruker)允许从达500, 000次射击累计加和谱。例 如，在图6中，所述autoExecuteTM(Bruker)方法编辑器允许在800次射击步骤（每个位置 /光栅800次射击）中20, 000次射击的加和。
[0062] 但是，针对每个样品点仅可以收集一个加和谱（X个瞬态谱之和）。为了从单个样 品点获取几批加和谱，我们必须对MS仪器中现有软件性质进行调整。有了这些调整，我们 可以从一个或几个构成如上所述的网格的光栅获取谱，并分别保存每个瞬态谱或位置谱。 例如，可以指示仪器收集并保存在图2B中的网格或子点18中每个光栅（x，y位置）获得的 每800次射击位置谱，而不必加至加和缓冲区。对样品点A1、A2、A3等内的所有子点重复同 样的过程（例如,可以从每个样品点的250个光栅获取800次射击谱=每个样品点200, 000 次射击）。该位置谱可以通过在autoExecuteTM(Bruker)中应用或不应用谱过滤来获取。
[0063] C?图像分析
[0064] 用于谱获取的自动化的一个选择是图像处理技术，以在具有高蛋白收率/高样品 浓度的点上，尤其是在样品在空间上没有均匀分布于点上而是集中于离散的区域中的情 况下，鉴定空间位置。在一个可能的实施方案中，仪器中所包含的照相机用于获取训练点 (training spot)的光学图像。然后，从该训练点上位置的光栅获取质谱。所得的质谱与点 的光学图像组合使用，用于产生一种分类机制以从该光学图像检测由给定样品制剂所制备 的其它点的高收率位置。然后，该分类被应用于实际的样品点。虽然这是一个很好的解决 方案，我们遇到的问题是捕获相机摄像头（camera feed)，以及从照相机图像的位置到激光 射击位置的重复校准。
[0065] 另一种方法是以质谱成像法的形式直接采用质谱仪研究点。该观点（idea)是对 点上的精密标度（方格）图的每个位置首先运行初步扫描并射击少量的射击（数十个）。 对这些光栅位置的每一个收集谱，并且会对每个位置记录总离子流，或某个预定m/z范围 内的离子流。基于来自初步扫描运行的N最高强度位置产生新的光栅文件，并将其用于质 谱的最终获取。该方法采用Bruker FlexImagingTM软件作为最可行的解决方法以在质谱 成像运行中产生多个谱。软件分析这些谱，并产生最终的光栅扫描图。虽然该方法可能可 用于采用芥子酸作为基质的标准稀释上样过程，对其它基质和对预分级（pre-fractioned) 的样品组（例如 CLCCA，参见 Leszyk, J. D. Evaluation of the new MALDI Matrix4 - Chloro-a-Cyanocinnamic Acid, J. Biomolecular Techniques, 21:81-91 (2010)),以及其 它方法，如 NOG 沉淀（precipitation) (Zhang N.et al.，Effects of common surfactants on protein digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of the digested peptides using two-layer sample preparation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18:889-896(2004))，可能次佳。该另一种方 法的一个重要方面是在MS成像部分找到获取设置以便不产生太大的文件。一个标准获取 文件是一兆字节（megabyte)的级别，而对于400x 400的光栅扫描（400个位置，每个位置 400次射击），产生16, 000个谱。由于对这些谱的要求一点也不繁琐，以及我们只需要估 计总离子流，我们可以用低分辨率设置进行工作。可能从自动谱获取设置直接获得有用位 置的列表，即得到成功或失败的获取的列表。从我们的研究来看，可以使用质量过滤（mass filtering)作为MS成像包的一部分来产生通过了一定标准的位置的列表（通过文件列表 识别）。虽然这将非常有助于产生原型工作流（prototype workflow)，但这需要通过专门 软件进行优化来避免半手动过程。
[0066] 图7显示的是采用CLCCA作为基质的MALDI点的区域，其中高收率区域由线性 结构组成并且低收率的区域显示为黑暗区域。对于这些情况，当基质样品结晶非常不均 匀时，如图7中所示，该图像分析方法似乎是最合理的。图像分析鉴定出相对高收率区域 (120, 122)。相对低收率区域，例如左下的区域124和基质区域126被图像分析软件鉴定出 并在射击过程中被忽略。
[0067] 鉴定点上的高和低收率区域的图像分析软件可以采取各种形式，并且可以由本领 域技术人员开发。例如，点的白色和黑色图像（图7)由像素阵列组成，每个具有8比特量化 值，0为黑色（没有信号）并且255为白色（饱和的）。可以使用过滤鉴定相对高收率的区 域，例如通过鉴定像素值大于例如100的像素被鉴定为"高收率"并且像素值低于40的像素 被鉴定为相对"低收率"。然后对相应像素为100或更高的样品点的这些区域进行扫描。还 可能过滤出其中像素值为240-255的点位置，原因是此区域可能被确定为具有盐结晶或导 致低收率的其它性质。再次参见图7,晶体结构120, 122的像素具有的像素值落在100-240 范围内并因而被扫描，而黑色区域124和126将不会被扫描。还可以使用形态学处理技术 鉴定诸如图7的结晶120的结构。图像分析软件可以包括形态学处理和过滤二者以确定扫 描区域。此外，该点可以在扫描过程中改变（由于样品的耗尽）并且可以在扫描过程中运 行图像处理以优化在从点产生100, 〇〇〇或更多次射击的过程中的射击，并且在射击过程中 避免了那些低样品浓度的位置。
[0068] 图8是来自MALDI-T0F仪器的屏幕截图，显示仪器工作站130的显示内容，包括点 14的图像132,该情况下为板的点F17。该板的布局在12'所示，其中在14'显示点F17。选 择点134的组（D9至F20)用于运行采用如上所述的图像分析方法的自动模式。
[0069] 图9是来自仪器的另一张屏幕截图。当前的仪器允许用户设置评估区域以接受 或拒绝瞬态谱（使用评估标签），设置每个点累计多少谱（使用累计标签）以及跨越点"移 动"使得激光可以以某种图案发射（使用所示的"移动"标签）。选项包括在图中随机游走 (walk)或移动，例如六边形或螺旋形。该软件还允许用户根据这样的参数持续发射激光并 获取和加至总谱直到从一次射击位置收集完来自750次射击的谱，并且然后移至下一次射 击位置。可以设置在射击位置被认为是失败的点之前尝试的数量。该图像分析方法，其中 鉴定出了低收率的可能区域并避免了在这些区域中的射击，有助于大大降低或消除那些失 败的判断。
[0070] 图10显示了一张评估页面，其中选择了如150所示的接受或拒绝瞬态谱的质量范 围。在获取过程中，如果瞬态谱在预定范围内（在该情况下为5, 000至18, OOODa)不具有通 过了阈值设定（基于分辨率、信号强度或其它因素）的峰，那么它将会被拒绝。也就是说， 瞬态谱不会被加至加和缓冲区以形成位置谱（加和来自所有射击的谱）。
[0071] 图11显示了一张评估页面，其中如果有不想包括于评估中的具体峰，可以产生一 个排除列表并将这些峰标记为"背景峰"。该软件已经预先定义了定义背景峰的基质的"对 照列表"，或者可以导入峰的列表。
[0072] 3.来自多个点的谱的收集
[0073] 总的来说，可以将深度MALDI技术扩展至整合来自多个点的谱。例如，可以自标准 MALDI板上的点A1、A2、A3、A4和A5的每个点获得样品的500, OOO次射击，并将所得到的谱 整合（加和）成一个由2, 500, 000个谱（射击）的总和组成的总谱。先验地，我们没有理 由相信不能整合来自多个点的谱而达到极高数量的射击，即，每100个点X 1百万次射击， 均可以给我们提供来自1亿次射击的结果。该过程可能存在实践限制，例如激光可能无法 太过频繁。 实施例
[0074] 在该方法的一个实施例中，采用之前所述的技术，采用手动或自动产生的光栅用 于扫描该多个点，可以从MALDI板上相同血清的多个点从5百万次射击收集谱。在该方法 中，优选可再现地获得MALDI板上单个样品的均一的点。这可以采用本发明所述的方法实 现。
[0075] L将稀释的血清点样至MALDI靶板上。
[0076] 工序：
[0077] 用HPLC级水1:10稀释血清并涡旋振荡。将样品与基质（在50% ACN/0. 1 % TFA 中的20mg/ml的芥子酸）I: I (v/v)混合在0. 5ml的离心管中并润旋振荡。将4 ii 1的基质 /样品混合物点样到MALDI祀上的一个或多个点上。
[0078] 在该实施例中使用了 MALDI板中的三十六个点（位置）：
[0079] 管1 :点样于MALDI板的位置E13、E14和E15(参见图2A)
[0080] 管2 :点样于位置E16、E17和E18
[0081] 管3 :点样于位置E19、E20和E21
[0082] 管4 :点样于位置E22、E23和E24
[0083] 管5 :点样于位置Fl、F2和F3
[0084] 管6 :点样于位置F4、F5和F6
[0085] 管7 :点样于位置F7、F8和F9
[0086] 管8 :点样于位置FKKFll和F12
[0087] 管9 :点样于位置F13、F14和F15
[0088] 管10 :点样于位置F16、F17和F18
[0089] 管11 :点样于位置F19、F20和F21
[0090] 管12 :点样于位置F22、F23和F24
[0091] 样品点E13至F18(管1-10)在涡旋振荡后采用相同的移液管枪头直接施加3次 (每个管中15111的；^ 4ul);而最后六个样品点F19-F24(管11和12)如点E13-F18那样 施加，但还在板上用移液管上下吹吸。
[0092] MALDI板上的点被允许通过将祀板置于平台（bench-top)上室温干燥。
[0093] 结果：
[0094] 对于点E13至F17 (其直接施加至板而没有进一步的板上混合）每管的第三个点 样明显比开始的两个点样更均匀。用肉眼评估均匀性：第三个点样最好，第二个点样第二 好，第一个点样最不均匀，例外的是E23,其是来自管4的三个点样的第二个，但看上去更像 每个管的第三个点样而不是第二个点样。
[0095] 样品点F18、F19、F20、F21、F23和F24,其通过在管中涡旋振荡混合并在板上用移 液管上下吹吸混合，是非常相似的并具有如E13至F17组中的第三个点样均一的外观。F22 看上去大致与E23相同。
[0096] 2.来自5百万次射击的谱的获取
[0097] 在进行以上步骤后，从十六个MLDI点获得来自每个点大约312, 500次射击的质 谱数据：
[0098] E15、E18、E21、E23、E24、F3、F6、F9、F12、F15、F18、F19、F20、F21、F23 和 F24。
[0099] 采用如上文和附录中所述的光栅扫描文件，将来自每个点的谱加和以产生来自大 约5, 000, 000次射击的总的样品谱。
[0100] 4?样品施加至MALDI板（点样）的优化
[0101] 优化样品施加至MALDI板以使结晶样品均匀并且均一的分布至MALDI板上的每个 样品点，其一个例子如图3所示。如下所述，进行了几个实验以找到将样品混合物施加至 MALDI板上的点（点样）的最优步骤。这些实验描述于该章节中。
[0102] 起初，制备几种不同的带有血清的制剂。除非另有说明，否则点样2iU的基质。除 非另有说明，否则将稀释的样品和基质介质在样品制备管中混合。除非另有说明，否则我们 不从单个制备管点超过1个点的样，因为从样品制备管中取出多份试样影响结晶。
[0103] 进行接地钢板（Ground Steel Plate)实验，其产生均勻的点。工序如下：
[0104] 1. 1:10稀释样品（2iil样品+18iil水），然后在50% ACN/0. 1% TFA中与基质 (芥子酸25mg/ml)l:l(v/v)混合并点样2iU基质。该步骤没产生好的、均匀的结晶。
[0105] 2?填装基质头（primed matrix tip)。用移液管将2 ii 1基质吸入点样头 (spotting tip)并使它静置30秒。1:10稀释样品（2iU样品+18iU水），然后在50% ACN/0. 1 % TFA中与基质（芥子酸25mg/ml) I: I (v/v)混合。从移液管枪头弹出过量的基质。 将移液管枪头置于基质混合物中并用移液管上下吹吸3次。不换头点样2 iU样品基质混 合物。该工序形成均匀的好结晶。因为这是接地钢板，样品基质混合物不如在抛光钢板上 摊开的多。留在移液管枪头中的干燥的结晶可能通过作为进一步结晶形成的种子而提高了 结晶。
[0106] 3.研究了温度对结晶的影响。1:10稀释样品（2iil样品+18iU水），然后在50% ACN/0. 1 % TFA中与基质（芥子酸25mg/ml) I: I (v/v)混合。将样品置于37°C水浴中5分 钟。从水浴中取出样品并立即点样。该工序并没有产生均匀的好结晶。
[0107] 4.重复上面的实验2.，但点样4 ill样品混合物而不是2 ill。该工序形成了均匀 的好结晶。点样4iU完全覆盖了该点直径并产生好的结晶和数据。这是目前被认为最佳 的方法。
[0108] 注：这里的点样工序以实例的方式提供而不是限制，并且所公开方法的变体当然 是可以的。例如，可以在管中混合基质和样品材料并让它在点样前静置几分钟。已经注意 至_是，采用同一移液管枪头从同一管制得的点越多，得到的均匀结晶越多。例如，可以采 用同一移液管枪头从同一管点样10个点并仅收集最后5个左右的点的数据；或者替代地， 在开始点样于MALDI板上之前可以丢弃来自管的前五个4 iU试样。
[0109] 我们还已经发现进行1的工序之后但采用同一移液管枪头来点样同一样品管10 次（每点2. 5 iU)至抛光的钢靶板上获得了相似的结果（谱质量）。
[0110] 5.分析性能评估
[0111] 技术可再现性
[0112] 技术可再现性研究科通过例如每天以100的批次运行1，000个技术重复来进行。 可以研究样品（点）制备（在板上或不在板上）的依赖性，尤其是看是否存在产生更均一 的离子流产率的制备方法，例如样品稀释的变化。还可以监控高收率位置的数量如何随点 改变，以及如何使妻子的改变最小化。监控和记录高粒度水平上的所有获取和制备是很好 的做法。
[0113] 样品至样品的可再现性
[0114] 对于样品至样品的变异，可以研究样品至样品的可再现性的相似问题。可能出现 新的现象：可能是一些样品是富含蛋白质的，并导致具有更高收率位置的点。可以从样品属 性（光学密度和色彩）的某种方式获得手段，或将样品获取装置（例如用于血清）标准化 以产生更可再现的工序。可以采用带有尽可能非均质来源的组合的样品组以试图覆盖最多 的变异。应当从研究现有的组并根据已知样品收集和条件匹配来获得这样的组，其更好地 利用了现有的样品数据库。
[0115] 灵敏度
[0116] 在谱中观察到更多的峰时产生的问题是，在该方法中我们可以看到什么丰度范 围，并且什么蛋白类型是实际上可见的。这与在复杂样品的MALDI MS中由于'离子抑制' 不能观察到较低丰度离子的"传统观点"有关，这个思想是来自较高丰度蛋白的粒子抑制了 来自较低丰度蛋白的离子信号，由此使得较低丰度蛋白不可检测。该观点似乎单单基于对 较低丰度的离子缺乏观察。事实上，我们观察到峰量的增加（参见例如图1C)给这种解释 蒙上了一些疑问。相反，似乎不得不认真考虑MALDI MS的（半）定量的本质。如果同意蛋 白丰度跨越了多个数量级上的宽的范围，那么可以期望相应的质谱能够通过展示峰高（或 者峰下面积（area))的巨大差异来模拟这种行为。不会预期在MALDI谱中观察到低丰度蛋 白，不是因为它们没有电离，而是因为相应于低丰度蛋白的峰的量级非常低。由于在质谱中 的常规做法是聚焦于大峰，并且因为更低丰度峰的数量级会更小，这些峰在以前没有观察 到并不奇怪。这并不是说，像离子抑制的现象不会发生，或电离概率没有发挥作用，而是说， 这些现象并没有完全抑制由低丰度蛋白产生的峰，并且如果在谱的低强度区域寻找低丰度 蛋白峰，它们确实变得能够观察到。因此，覆盖显著百分比的血清蛋白组的寻找可以被看作 是扩展质谱的动态范围的寻找。如同任何其它基于计数的技术，该问题的简单解决方案是 通过增加检测的离子数量来增加统计信息（每个飞行时间箱（per time-of-flight bin))。
[0117] 为了从这个简单的解释（其有悖于传统观点）中获得更多的信心，人们可能希望 建立质谱的动态范围并将它与蛋白的丰度联系起来。这应当这样来完成：从分析化学的角 度，建立灵敏度曲线（作为m/z的函数），以及通过相应于一些峰的蛋白的鉴定和通过像 ELISA的正交技术对这些蛋白的对比丰度（comparative abundance)的测定。
[0118] 通过掺入（spiking)实验分析灵敏度
[0119] 该观点是向血清样品中掺入（spike)改变浓度的表征了的蛋白，观察是否能够看 到相应的峰，并降低浓度直到该掺入峰消失。应当选择跨越质量范围5kDa到30kDa、最好 间隔IkDa间隔的蛋白标准品。可能有必要妥协，但我们应当着眼于感兴趣的质量范围的某 些紧密覆盖。我们可以在较高的质量不那么严格。可以进行对照试验，其中蛋白标准品在 水中复原，以评估血清的存在有什么影响。可以将峰强度对丰度作为射击数量的函数进行 作图。这应当给予我们一种方法的动态范围的观点。还可以产生作为m/z函数的灵敏度曲 线，描绘最低浓度，在该浓度掺入峰对于不同数量的射击是能够观察到的（通过S/N截断值 进行参数设置）。
[0120] 采用预分级的样品
[0121] 本发明的方法可以与用于分级样品的沉淀法结合，例如NOG沉淀、脱脂 (de-lipidifying)等。该方法还可以与其他矩阵像CLCCA-起使用。很可能这些方法也可 以极大地从深度MLDI方法中受益。我们之前采用样品分级的数据显示确实真正地观察到 不同的峰，但峰量还远没有最佳。这是可以预期的，因为一个目的是去除高丰度蛋白。
[0122] 过去我们试图采用耗尽和/或质量过滤以降低不需要的蛋白像白蛋白和血红蛋 白的含量，但是这些方法中没有一个实现完全去除，并且这些峰的残留仍然可见。对耗尽了 或质量过滤了的样品采用这里所说的深度MALDI方法产生更好的结果，因为降低大峰也会 降低观察较低丰度蛋白所需的动态范围。
[0123] 6.进一步的考虑
[0124] a.获得谱获取设置的合理的选择
[0125] 在autoExecuteTM(Bruker)方法中，为了仅收集通过了某种标准的瞬态谱，可以 定义过滤设置；在我们的情况下，我们想要仅加入总离子流大于外部定义的阈值的的瞬态 谱（由〈XX〉数量的射击产生）。虽然似乎不能以简单的方式，但在处理方法标签页中有可 用于类似目的的过滤标准。或者，在峰评估方法中有我们可以为此目的调节的参数。虽然 这不会降低射击的数量，它可以克服相对较早的射击的射击偏差的问题，即不获取仅由噪 音组成的瞬态谱。在加和瞬态谱采用自动过滤操作产生位置谱避免了偏差的问题。
[0126] b.采用标准方法来评估谱，例如预处理、背景减除、比对等。参见美国专利 7, 736, 905,其通过引用并入本文。
[0127] c.谱过滤之外的谱获取参数的优化：
[0128] ?每个位置激光射击的最佳数量。
[0129] ?最佳激光功率（和通过标准对此的定义）。
[0130] ?-个点上能被可靠探测的位置的最佳数量。
[0131] ?质量范围应当首先（the above)被优化。
[0132] 所有这些参数都可以被优化。
[0133] d.确定组合来自多个点的谱的限制（参见上述讨论）
[0134] e.分辨率的提高。
[0135] 当有更多的峰从噪音海中显露出来（将图IC与图IA进行比较），峰会如此多的重 叠使得难于以可靠的方式解析单个种类。虽然我们不可能在给定的道尔顿中观察到多个 峰，我们应当着眼于在感兴趣的m/z范围上具有大约I-OTa的分辨率。这可能需要改变电 压和延迟的提取设置，以及优化数据获取电子部件（electronics)。当然如果我们使得飞行 时间箱的宽度太小，这会造成每个飞行时间箱较少的检测事件，由此造成每个箱中较高的 噪音水平。需要在分辨率和箱计数（bin counts)的增加之间找到合理的折中（通过多次 射击）。
[0136] f.评估峰量作为射击数量的函数
[0137] 1.信噪比（S/N比）（幅度）的可实现的范围
[0138] 深度MALDI方法的主要思想是基于以下简单观察结果：仅包括噪音的飞行时间箱 的绝对强度与射击数量的平方根成比例，而含有信号的TOF箱的绝对强度与射击数量成线 性比例（有一些附加说明（caveat))。因此，增加射击数量应当导致每个TOF箱更多的事 件，并最终导致小峰变得与噪音可以区分开来。所检测的离子的数量与峰下面积成正比例； 假定对于给定的m/z范围峰具有相似的宽度，并假定峰大致为高斯分布，则峰下面积与峰 的高度乘以与半数最大时的峰宽（半数最大时的全宽，FWHM)有关的形状因子成比例。为 了能够实现给定的灵敏度，即与射击数量相关联以显示在给定强度水平的已知峰，有一个 将峰幅度与丰度关联的标准曲线（作为m/z的函数）将会是有帮助的。
[0139] 2.峰数量作为S/N截断值的函数；峰的较好定义
[0140] 测量峰量的最简单的思想是测量所检测的峰的数量作为S/N截断值的函数；利用 该方法的初步实验并未给出所期望的行为，主要是对于小S/N截断值。这可能是由我们的 峰检测器在低S/N截断值处的过度灵敏造成的（或噪音估算的问题）。针对该行为的某些 进一步的证据由以下观察给出：对于一些较少数量的射击所检测的峰对于较大数量的射击 消失了。可能对于噪音估算器来说在相关TOF箱中的事件的数量太小而不能对较少数量的 射击更好地工作。观察谱（参见图1)，很显然与更少的射击（图1A，2, 000次射击）相比， 更多的射击（100, 〇〇〇或500, 000次射击，图IB和1C)使得峰看上去更容易界定得多；可能 需要加入额外的用于峰定义的标准来使得该评估更加定量。
[0141] g.该方法的测量可再现性
[0142] 可以测量深度MALDI方法的技术可再现性，S卩比较作为射击数量的函数来自技术 重复的深度MALDI谱（同一样品的多个点）。这应该通过叠加变异系数（CV)对幅度曲线， 最好针对同样的峰，来测量。在首次通过中，100个技术重复对于初步确定技术再现性应当 足以。还可以测量用于确定单个峰的m/z的CVs以获得可实现的质量准确度的量度。这应 当结合并不结合谱比对来完成。
[0143] 有来自100个技术重复的深度MALDI谱能够进行进一步分析：我们可以组合十个 重复的组，并再次测量峰量和可再现性。组合所有的技术重复应当原则上产生与由每个点 的射击的单独数量的100倍所获得的谱相似的谱。
[0144] h.跨越样品的共同峰的发现
[0145] 已经建立了技术可再现性，可以研究由不同的血清（或其它）样品产生的峰量中 的变异。可以评估样品至样品（STS)的可再现性以发现遍及样品的共同峰。采用含有'健 康'个体的无偏差样品组进行来发现共同峰可能是有利的。两个选项是明显的：早期诊断 组，例如在标准稀释上样设置中显示不多的前列腺组的一个，以及各种癌症病例与'健康' 对照的混合物。分析需要定义大小?1〇〇个样品的最合适的组。
[0146] i.比对、标准化和峰定义
[0147] 本发明方法的一个用途是采用深度MALDI谱发现并列出共同峰。峰量将会采用 CV对幅度曲线、最好是作为射击数量的函数，来评估（或者任何其它合适的测量，例如每个 TOF箱事件的数量等等）。该工作还可以带来一组比对峰。以同样的方式，可以希望评估各 种标准化工序。因为我们现在有分布在整个可观测的m/z范围上的许多峰，不可能有足够 大的无信息区域便于基于区域的标准化。相反，可以开发基于峰的部分离子流（PIC)标准 化。这需要鉴定在血清中存在的稳定的（在位置和幅度都）峰。由于算法中缺乏停止标准 导致的为此的方法有点随意，预定义此类峰的列表（类似于在谱比对中所用的预定义的峰 的列表）是有利的。
[0148] 本发明方法的额外用途是在生物标记物发现中，但是用比我们目前使用的更大得 多的性质设定（feature sets)。因为性质设定大得多，这会导致算法的某些部分的性能更 好，例如虚假发现率的估算。可从深度MALDI谱获得的较好的峰定义可以导致信息和噪音 性质之间更好的区别。但是，具有更多的性质使得性质选择问题更繁重，并强调了对性质预 过滤的需求。
[0149] j.增加MALDI点的大小
[0150] 考虑到由激光照明的大小以及由预光栅扫描步骤的最小网格大小所带来的局限 性，可能在标准点上没有带有足够离子收率的足够的射击位置。解决这个问题的简单方 法是增加点的大小。FlexImagingTM(Bruker)软件可非常容易地支持这个方法。还具有 在MS成像应用中采用的矩形点样区域的选项，其可能会适合用于这个目的。采用更大的 点的额外的好处是，不用担心是否能够定位相似数量的相称的射击位置并产生从点至点具 有相似质量的谱。样品体积似乎并不存在问题。如果更大的点是可能的，可以降低物流 (logistics)来处理针对相同获取的多个点,这对于高数量的射击可能是必须的。
[0151] 附录
[0152] 本附录描述了产生非连续x，y坐标的25个光栅文件的方法。这些步骤参考了与 Bruker质谱仪一起提供的工具，但是这些方法足够常规，使得它们可以应用于其它制造商 的仪器。
[0153] 以下步骤用于创建25孔网格--基于六边形的图：
[0154] 1)在记事本中打开Bruker的光栅文件"hexagon, raster"。该图案具有在MALDI 目标样品点上分布的889个坐标点。
[0155] 2)从hexagon, raster去除边缘周围的点并将坐标点数量从889减少至750并保 存为 "hexagon750.raster"。参见图 2。
[0156] 3)将750x，y点分成25批次的30x，y点，其保存为25个单独的光栅文件："5x5_l. raster"、"5x5_2. raster" ...... "5x5_25. raster"。以这种方式命名这些文件，从而这些 名称将会与采用由序列发生器将会产生用于25孔网格的那些名称相同（参见下面的第6 项）。该结果与上面的图4相似。
[0157] 4)复制 25 个光棚文件（"5x5_l. raster，'、"5x5_2. raster，'......"5x5_25. raster，'） 至 Methods\AutoXRasterFile。
[0158] 5)在 AutoXecute 方法编辑器中创建 AutoXecute 方法 " 120411_375shots. axe"。 新方法（"120411_375shots.axe"）与 "120315_100kshot.axes" 相似，除了总谱累计和每 位置的射击（表1)。
[0159] 表 1
[0160]
【权利要求】
1. 采用MALDI-TOF质谱仪分析施加到MALDI-TOF样品板上的样品点的复杂生物样品的 方法，包括以下步骤： 引导超过20, 000次激光射击至样品点的样品；以及 从仪器收集质谱数据。
2. 权利要求1所述的方法，其中至少100, 000次激光射击被引导至所述样品点。
3. 权利要求1所述的方法，其中至少500, 000次激光射击被引导至所述样品点。
4. 权利要求1、2或3任一项所述的方法，其中所述生物样品包括基于血的样品。
5. 权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤： 采用所述样品板的图像分析以鉴定所述点内相对高或相对低的样品量的区域，以及 自动控制至所述样品的超过20, 000次激光射击引导至所述点的具有相对高样品量的 区域。
6. 权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤： 将所述点分成多个子点； 产生针对每个子点的光栅文件，所述光栅文件在所述子点内指定多个离散的X/Y位置 用于采用多次射击从所述样品获取质谱； 在所述网格的每个位置收集多个谱并将所述谱加和以产生针对每个子点的加和谱；以 及 将每个子点的加和谱加和以产生所述样品的总质谱。
7. 权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：将所述样品施加到MALDI-TOF板上 的多个点，从施加到所述多个点的每一个的至少20, 000此射击获得质谱，以及将来自所述 多个点的每一个的质谱进行加和。
8. 权利要求7所述的方法，其中所述获得步骤包括从施加到所述多个点的每一个的至 少100, 000次射击获得质谱。
9. 权利要求7所述的方法，其中从所述多个点的每一个加和得到的质谱由通过施加范 围为1百万至1千万次的射击至所述样品获得的质谱组成。
10. 前述任一项权利要求所述的方法，其中所述复杂生物样品包括基于血的样品。
11. 权利要求10所述的方法，进一步包括在参考质谱和所记录的施加至在一个或多 个点上的所述基于血的样品的射击数量的帮助下，测量所述基于血的样品中完整蛋白的丰 度。
12. 获取质谱的方法，包括以下步骤： 自动光栅扫描含有复杂生物样品的MALDI-TOF样品板上的点，以及 从所述点获取超过20, 000次射击。
13. 权利要求12所述的方法，进一步包括以下步骤 将所述点分成多个子点， 自动光栅扫描所述子点并获得每个子点至少20, 000个瞬态谱，以及 将来自所述子点的每一个的所述瞬态谱加和以产生所述点的总谱。
14. 权利要求12所述的方法，其中所述方法在离散的X/Y位置光栅扫描所述点至少10 次，并获得来自所述点的每次光栅扫描至少10, 〇〇〇次射击的谱。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述方法在离散的X/Y位置光栅扫描所述点至少10 次，并获得该点的来自1〇〇, 〇〇〇至1百万次射击的谱。
16. 权利要求14或权利要求15所述的方法，其中在所述光栅扫描的每一个中的所述 X/Y位置不重叠。
17. 权利要求12所述的方法，其中所述方法采用图像分析以鉴定所述点内的相对高浓 度的样品的区域并在此区域中自动扫描所述点。
18. 权利要求1-18任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：在所述样品点内以均匀 并且空间均一分布的方式将所述样品沉积到MALDITOF样品板上。
19. 权利要求18所述的方法，其中所述MALDI-TOF样品板包括接地钢板。
20. 前述任一项权利要求所述的方法，其中所述复杂生物样品选自由以下样品组成的 组：基于血的样品、淋巴、导管流体、脑脊液以及所表达的前列腺分泌物。
21. 权利要求20所述的方法，其中所述复杂生物样品从人获得。
22. 权利要求21所述的方法，其中所述复杂生物样品从患病的人获得。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述病是癌症。 24. MALDI-TOF质谱仪系统，包括： 激光，用于射击MALDI-TOF样品板的一个或多个样品点； 自动光栅扫描系统，用于在用激光射击所述样品时光栅扫描所述样品板， 其中所述质谱仪被配置为从施加至所述样品的超过20, 000次射击获得质谱。
25. 权利要求24所述的系统，其中所述质谱仪被配置为用激光自动射击所述点至少 100, 000次并将所得到的瞬态谱加和为质谱。
26. 权利要求24所述的系统，其中所述质谱仪被配置为用激光自动射击所述 MALDI-TOF样品板的多个点，对于每个点至少20, 000次射击，并将所得到的瞬态谱加和为 质谱。
27. 权利要求24所述的系统，其中所述质谱仪被配置为用激光自动射击所述 MALDI-TOF样品板的多个点，对于每个点至少100, 000次射击，并将所得到的瞬态谱加和为 质谱。
28. 通过MALDI-TOF质谱仪产生用于分析样品中存在的感兴趣的分子的丰度的参考谱 的方法，包括以下步骤： a) 掺杂样品至所述感兴趣的分子的靶丰度水平（摩尔浓度，或ppm); b) 将在靶丰度水平掺杂的样品施加至MALDI-TOF样品板的一个或多个点； c) 通过对所述MALDI-TOF板上的一个或多个点上进行数量超过20, 000次的射击并且 产生参考谱来进行质谱分析，其中所述感兴趣的分子可靠地存在于所述参考谱中，以及 d) 记录射击的数量。
29. 权利要求28所述的方法，进一步包括以下步骤：通过将所述样品以所记录的射击 数量经受MALDI-TOF质谱分析并产生所得质谱，对所述感兴趣的分子的未知浓度的样品进 行质谱分析，以及 将所得质谱或其性质与所述参考谱或其性质进行比较。
30. 权利要求28所述的方法，进一步包括以下步骤：对两个或更多个感兴趣的分子进 行步骤a)、b)和c)。
31. 权利要求29所述的方法，其中未知浓度的所述样品从人获得。
32.权利要求29所述的方法，其中未知浓度的所述样品是食品或环境样品。
32. 权利要求28所述的方法，其中所述参考谱由至少100, 000次射击获得。
33. 权利要求28所述的方法，其中所述参考谱由至少500, 000次射击获得。
34. 权利要求28所述的方法，其中所述参考谱由所述MALDI-TOF样品板上的两个或更 多个点获得，所述点的每一个均经受超过20, 000次射击。
35. 权利要求28所述的方法，其中所述感兴趣的分子包括分子量为大约1K道尔顿至 50K道尔顿的蛋白。
36. 权利要求28所述的方法，其中所述感兴趣的分子包括代谢物。
37. 权利要求28所述的方法，其中所述感兴趣的分子选自由以下分子组成的列表：癌 症抗原125、前列腺特异性抗原（PSA)和C反应蛋白。
【文档编号】G01N33/487GK104380430SQ201380028806
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】海因里希·罗德, S·阿斯梅拉希, J·艾伦, 马克西姆·齐平 申请人:佰欧迪塞克斯公司