诊断和监视癌症的体外方法

诊断和监视癌症的体外方法
【专利摘要】本发明涉及一种诊断和/或监测和/或预测癌症疾病进展的体外方法，其特征在于在至少一个样本中Tregs细胞与至少另一组T细胞的比率被测定，所述另一组T细胞是包含Th17细胞，Th1细胞和/或Th2的组。
【专利说明】诊断和监视癌症的体外方法 发明领域
[0001] 本发明证明了在癌症过程中尤其是卵巢癌的进展中肿瘤浸润性免疫细胞模式 (pattern)的改变，并清楚地显示了从效应T细胞的存在所代表的活化的抗肿瘤免疫应答 到疾病晚期的显著免疫抑制的动态改变（dynamic shift)，其中所述效应T细胞在上皮性 卵巢癌（EOC)的早期阶段占优势，压制了 T调节细胞（Tregs)。
[0002] 出现于肿瘤微环境中的免疫细胞类型在患者生存中发挥关键性作用。然而，对于 疾病进展过程中肿瘤浸润免疫细胞的动态（dynamics)知之甚少。已经在疾病的不同阶段 对浸润于卵巢癌患者的肿瘤组织中的免疫细胞进行研究。卵巢癌进展的早期阶段是以强 Thl7免疫应答为特征，然而在II期患者中观察到大量Thl细胞的募集。
[0003] 在扩散型肿瘤（III-IV期）中，检测到Helios+活化的调节性T细胞（Tregs)的 优势种群（dominant population)并伴随有大量的巨噬细胞和髓样树突状细胞（mDCs)。肿 瘤浸润Tregs较循环Tregs具有显著更低的CCR4表达，并且肿瘤浸润Tregs的数量与卵巢 肿瘤细胞的培养上清液中CCL22的水平显著相关，这暗示着它们的募集是通过CCR4/CCL22 相互作用进行。CCL22在原发性卵巢肿瘤中主要由肿瘤细胞、巨噬细胞和mDCs产生，并且它 的表达在应答于IFNy时明显增加。综上，Tregs的特异性募集（可能由炎性刺激触发的） 导致卵巢癌进展阶段的显著免疫抑制。
[0004] 以上总结的发现用于诊断和监视各种癌症尤其是卵巢癌症的体外方法中。该方法 是利用鉴定不同的细胞类型，优选通过使用细胞表面的标记物。受T细胞调节的免疫力包 含多种不同的T细胞。细胞毒性T细胞例如是以表面CD8抗原（MHC I类受体）为特征。T 辅助细胞可以分为多个亚群。本发明最相关的T细胞具有表面标记物CD4+(MHC II类）， 并尤其包含提高中性粒细胞应答和已知的尤其对细胞外细菌有效的CD4+Thl7细胞。假定 Thl7细胞在肿瘤中是具有杀伤肿瘤细胞的效应。另一个有趣的细胞群被称之为Treg，其为 CD4+调节T细胞。这种类型的细胞抑制T细胞应答。通常这类细胞具有避免扩大的免疫应 答（an exaggerated immune response)的作用。但是在肿瘤细胞中，假定Treg细胞的出 现下调了针对肿瘤细胞的机体自身免疫防疫并由此最终增强了肿瘤的生长。 现有技术
[0005] Cannon 等人（Expert Opin. Biol. Ther.，2011 ;441_445)记载了针对卵巢癌症的 树突状细胞疫苗。讨论了 Thl7在癌症免疫治疗中的可能角色。
[0006] Kryczek 等人（J. Immunol.，2011，4388-4395)记载了一个命名为 Foxp3+CD4+ 的调 节型T细胞亚群。假定这些细胞在如慢性溃疡性结肠炎或癌症的病理微环境中可能是炎性 Treg细胞。
[0007] Leveque 等人（J. Immunother.，2009, 101-108)报道了在 IL-2 存在下刺激体外分 离的上皮性卵巢癌相关的TMg将它们转化为TH17细胞。
[0008] Curiel等人（Nature Medicine, 2004, 942-949)记载了在受卵巢癌影响的患者 中，人类肿瘤TMg细胞抑制肿瘤特异性T细胞免疫并对体内人类肿瘤的生长作出贡献。
[0009] Zamarron 等人（Int. J. Biol. Sci.，2011，651-658)报道了 Thl7 细胞、调节性 T 淋 巴细胞和免疫调节细胞因子在促进或抑制癌症发展中发挥了双重作用。它们在癌症进展中 的最终作用可能主要取决于肿瘤微环境。
[0010] Tosolini等人（Cancer Res.，2011，1263-1271)记载了结肠直肠癌患者中浸润的 T细胞毒性和辅助细胞（Thl，Th2，TMg，Thl7)的不同分类的临床影响。
[0011] Kryczek等人（Blood, 2009, 1141-1149)记载了癌症患者中Thl7细胞的活性作用。 研究了卵巢癌患者中的Thl7细胞，相关机制以及临床意义。
[0012] Chi 等人（Clinical and Experimental Immunology, 2010, 480-489)记载了 T 辅 助类型17 (Thl7)和调节性T细胞（Ireg)在炎症的发病机理和自身免疫紊乱中的重要作用。 讨论了肿瘤和外周血中这些细胞的贡献。
[0013] 现有技术并没有提出测量Ireg细胞和另一个T细胞群，尤其是Thl7的比率，以及 将该比率用于预后和潜在的治疗策略。
[0014] 发明背景
[0015] 卵巢癌是全球女性中十大最常见恶性疾病之一，并且在妇科癌症中具有最高的死 亡率。由于缺少敏感和特异性的生物标记物以及由于该疾病趋于发展和传播迅速的特点， 几乎70%的患者是在肿瘤扩散的晚期阶段被诊断，具有很差的预后。虽然传统治疗导致在 80%以上的卵巢癌中恶性细胞数量的显著减少，但由于少量的抗化疗肿瘤细胞的存在导致 大多数患者在2-5年内经历最终致死性的复发。为了改善卵巢癌患者的预后以及肿瘤治疗 的更好适应性，因此需要更好的预兆型标记物和新的治疗策略，从而能分别鉴定高风险患 者和消除复发可能性。
[0016] 免疫监视被提议是在癌症发展和进展中发挥关键性作用。免疫缺陷小鼠中的实 验已经显示免疫系统能够识别并根除肿瘤。但是，虽然癌症细胞能引发肿瘤特异性免疫 应答，但是肿瘤与宿主免疫系统之间的相互作用不可能导致疾病的临床消退（clinical regression)，反而发展出肿瘤组织中免疫抑制性的微环境，从而促进免疫逃避。甚至，不能 确定的是由实验室小鼠获得的实验结果在癌症患者中也是有效的。
[0017] 尽管不能根除确定的肿瘤，但是在癌症患者中某些肿瘤浸润免疫细胞的出现能代 表强的预后性标记物。已经报道大量的肿瘤浸润CD3+T细胞是与晚期卵巢癌患者的有利临 床后果相关。更多最近的研究已经报道存活的改善与CD8+细胞毒性T细胞数量增多相关。 相反，肿瘤组织中大量的⑶4+⑶25+F 〇XP3+调节性T细胞（Tregs)，浆细胞样树突状细胞， 和B7-H4+巨噬细胞预示着一个很差的预后。对⑶4+辅助性T细胞的作用尚无太多文献记 载，但是有很强的证据表明Thl7细胞可能在癌症免疫中具有实质性的作用（substantial players)〇
[0018] 促炎症反应的Thl7细胞主要与自身免疫性疾病和粘膜免疫相关。已经证实Thl7 细胞在不同类型的肿瘤中出现，包括卵巢癌、头和颈部癌症、胃癌、乳癌、结肠直肠癌和前列 腺癌。虽然被广泛的研究，但是Thl7细胞在肿瘤免疫和患者生存中的真实作用仍存在争 论。一方面，IL-17生产细胞已经被报道是促进抗肿瘤免疫的，但是另一方面，IL-17已知是 作为能增强肿瘤生长的血管生成因子。
[0019] 大多数已发表的研究关注于不同类型的肿瘤浸润免疫细胞的模式和预后重要性。 但是，对疾病进展过程中肿瘤组织内的免疫应答的动态知道很少。上皮性卵巢癌（EOC)不 同阶段中CD4+和CD8+T淋巴细胞、树突状细胞（DCs)和巨噬细胞的分布、表型以及临床病理 意义已经被评估。本发明的结果证明了在癌症发展过程中肿瘤浸润免疫细胞模式的变化， 并清楚地显示了从效应Thl7细胞（在EOC早期阶段超过Tregs)的浸润到疾病晚期中显著 Treg累积的动态转变。
[0020] 本发明的优选实施例
[0021] 免疫学领域中常使用的多个术语用于本发明中。对于术语的含义我们由此尤其参 考了以下教科书：
[0022] -Janeway's Immunobiology,第 7 版,Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport(2008)
[0023] -Fundamental Immunology,第 6 版，William E. Paul (2008)，Wolters Kluwer, or
[0024] -Pezzutto, Ulrichs, Burmester ；Taschenatlas der Immunologie, Thieme,第 2 版（2007)，
[0025] 其包含了⑶标记物和其解释，细胞因子和其常用的缩写的一个很长的列表 (extensive list)〇
[0026] 本发明中形成了以下观点：
[0027] A)Thl7淋巴细胞在肿瘤组织中累积，并且它们的比例与疾病进展呈负性相关
[0028] Thl7淋巴细胞在100 %被分析的卵巢肿瘤样本中被检测到（区间=0. 06-22. 8%)。取自于局限性疾病（FIG0 I期）患者的肿瘤组织中的Thl7细胞在⑶4+T细胞亚群 中的比例显著高于取自于罹患扩散性疾病（FIG0 III-IV期）患者的（参见图1A，B)。全肿 瘤来源单细胞悬液中Thl7细胞的频率显示同样的模式，这意味着Thl7细胞的绝对数量在 晚期疾病中显著减少。根据这些发现，11-17和IL-21在早期患者肿瘤组织来源的细胞培养 上清液中的浓度是明显高于在非刺激培养物以及PM-和伊屋诺霉素（ionomycin)刺激的 培养物中的浓度（参见图1C)。尽管在疾病更晚期Thl7细胞比例显著降低，肿瘤浸润Thl7 细胞的比例当与患者外周血比较时仍是显著升高（参见图ID)。Thl7细胞在单独外周血中 的频率并不预示着肿瘤组织中Thl7细胞的数量或比例。但是它可以被用作控制的目的。
[0029] B)肿瘤浸润Tregs的比例在肿瘤组织中是升高的并随着疾病的进展增加
[0030] 与Thl7细胞相反，来自于患有扩散性疾病（FIG0 III-IV期）患者的肿瘤组织中 的⑶4+⑶25+CD127_F〇XP3+Treg S当与来自于I期疾病患者的样本比较时是显著升高的（参 见图2A，B)。肿瘤浸润Tregs(Ti-Treg s)的比例显著高于来自于处于疾病各期患者的外周 血中发现的比例（参见图2C)。为了更好地表征Ti-Tregs的状况，转录因子Helios(Treg 活化的标记物）也被分析。EOC患者中Helios+Tregs在肿瘤组织中的比例（67. 8±2· 5% ) 显著高于外周血中的比例（56. 3±4. 2% )(参见图2D)。Helios+Tregs的比例在疾病的不同 期中没有区别。疾病进展过程中稳定的Ti-Tregs的增长比例进一步通过基于实时定量PCR 的甲基化分析证实，该分析评估了稳定的Tregs (在肿瘤组织来源的单细胞悬液中在FoxP3 TSDR位点去甲基）的百分比（参见图2E)。在相同的肿瘤中Tregs和Thl7淋巴细胞的比 例是呈负相关（r =-0. 44, p〈0. 01)(参见图2F)，然而Tregs的比例与巨噬细胞的数量呈正 相关（r = 0· 47, ρ〈0· 01)(图 2G)。
[0031] C)疾病进展过程中Thl和⑶8+Τ淋巴细胞，树突状细胞（DCs)和巨噬细胞的比例 没有出现明显变化
[0032] 除了 Thl7细胞和Tregs，还在肿瘤组织中分析了其他免疫细胞亚群（包括Thl细 胞，CD8+T细胞，pDCs，髓样树突状细胞（mDCs)以及巨噬细胞）的存在。虽然在晚期肿瘤中 mDC和巨噬细胞的比例呈上升趋势（参见图3)，但是这些细胞类型中没有一种在卵巢癌进 展过程中显示出任何统计学显著的动态。
[0033] D)肿瘤来源的单细胞悬液的细胞因子和趋化因子谱支持极化的Th淋巴细胞募集 到肿瘤组织中而不是在它们的原位引发并极化
[0034] 为了更好的表征肿瘤微环境和评估是否细胞因子谱支持T淋巴细胞的原位引发 和极化，评定肿瘤来源细胞培养上清中的细胞因子和趋化因子谱。在未刺激的培养上清中， 仅检测到3种量大的细胞因子IL-6, IL-10和TNFa (参见图4A)。IL-2, IL-4, IL-12,和 IL-23的水平在多数受检患者样本中是低于MILLIPLEX?试验的检测极限，IL-17仅在I期 疾病患者的细胞悬液中检测到。重要的是，I期患者虽然有最高比例的肿瘤浸润性Thl7细 胞，但在其培养上清液中仅检测到最小浓度的IL-I β (4. 2±2. 5pg/ml)，而IL-I β对Thl7 极化至关重要（参见图4C)。除了 IL-17,在无刺激培养中没有观察到与疾病进展的其它显 著相关性。在PM和伊屋诺霉素（ionomycin)刺激中，除了 IL-12和IL-23,大多数被检测 的细胞因子都有生成（参见图4A)。处于疾病晚期的患者的培养上清液中IL-21的生产较 来自于I期患者的培养上清液明显减少（参见图1C)。在所有患者样本中观察到TGF β mRNA 的表达并且与疾病阶段无显著相关（图4D)。
[0035] 无刺激的肿瘤来源细胞生产大量的CCL20和CCL22以及炎性的CXCL9和 CXCLlO (参见图 4B)，却生产少量的 CCL2, CCL5, CCL17, CCL19 和 CCL21。CCL22 (参见图 5A)，CXCL9和CXCLlO (未显示）的水平在疾病进展过程中增加，但是这些数据并不具有统计 学显著性。CXCL9 的水平与肿瘤浸润 CD4+(r = 0· 65, ρ〈0· 01)和 CD8+(r = 0· 64, ρ〈0· 01)T 淋巴细胞的数量显著相关。与特定的Th淋巴细胞亚群无相关性（未显示）。最重要的是， CCL22水平与Ti-Tregs数量显著相关（r = 0· 66, ρ〈0· 01)(图5B)。未发现趋化因子与肿 瘤浸润免疫细胞之间的其它相关性。
[0036] Ε) Tregs有可能通过CCL22/CCR4相互作用被募集到肿瘤组织并在原位增殖
[0037] 如前面所记载的，肿瘤细胞培养上清液中Ti-Tregs的数量与CCL22水平显著相 关。根据这些发现，Ti-Tregs与来自于外周血的Tregs相比CCR4显著低表达（平均荧光 强度分别为6, 280±35和3, 487±333 ;η = 6)(参见图5C)。为了评价Ti-Tregs是否原位 增殖，对肿瘤组织来源的细胞上清液和PBMCs进行Ki67染色。与外周血中的Tregs比较， 显著更高百分比的Ti-Tregs表达Ki67(分别为2L 8±5· 1%和12. 9土L 8% ;n = 6)。与 Tregs相比，Ki67在很低比例的传统⑶4+FoxP3_T细胞上表达（肿瘤组织中7. 6 ± 2. 7 %，夕卜 周血中2. 3±0· 4% )(参见图E)。
[0038] F)在IFN Y刺激下，卵巢癌细胞系生产趋化因子，包括CCL22
[0039] 为了评估卵巢癌细胞系是否能够生产CCL22,将0V-90和SK0V3细胞在无刺激或用 重组人IFN γ刺激的条件下培养，因为IFN γ已经显示在乳癌细胞系中诱导CCL22的生产。 对比于原发性肿瘤来源的细胞上清液，自发的CCL22分泌在卵巢癌细胞系中是不能检测到 的，该结果与本研究中所检测的大多数其它趋化因子类似。SK0V3细胞系自发性地生产少量 的CXCL9 (参见图6A)，然而未经刺激的0V-90细胞生产大量的CXCL9, CXCLlO和CCL20 (参 见图6B)。添加IFN γ在两种被测细胞系中诱导了 CCL19, CCL21和CCL22的大量分泌。令 人吃惊的是，在IFN γ刺激下，CXCL9, CXCLlO和CCL20的生产在SK0V3细胞中增加但是在 0V-90细胞中减少（参见图6A，B)。
[0040] G)在IFN γ刺激下，原发性卵巢肿瘤来源的细胞的CCL22生产显著增加 [0041] 为了评价IFNy对原发性肿瘤来源的单细胞悬液的作用，分离自患者肿瘤组织（η =6)的细胞培养于正^^存在下。如图6(：所显示，正^^刺激下仅0(^21，0(^22和0乂(^10 在肿瘤细胞培养上清液中的浓度是增加的，观测到CCL22有最显著的增加。作为CCL22分 泌的来源，EpCAM+肿瘤细胞，巨噬细胞和mDCs在无刺激培养物和经过刺激的培养物中进行 鉴别（参见图6D)。
[0042] 本发明提供了一种诊断和/或监测和/或预测癌症疾病进展的体外（ex vivo)方 法，其中在至少一个样本中测定Tregs细胞与至少一组另外的T细胞（包含Thl7细胞，Thl 细胞和/或Th2细胞的组）的比值。
[0043] 本发明中所记载的体外方法的优势在于能更好地诊断特定类型的肿瘤。哪种治疗 剂应该施用给患者常常是决定性的。通过更好的表征癌症的类型，能够使治疗适于使患者 受益。
[0044] 在此公开的体外（in vitro)方法优选用于将卵巢癌患者划分为特定的风险组， 是能通过有区别地强化的辅助化疗进行治疗的组。为了治疗患有卵巢癌的患者，知晓该 患者所患癌症的类型这是有实质性优势的。虽然在一组患者中施用强化的化疗可能是有 益处的，然而在另一组患者中同样的治疗可能有相反的作用。静脉内给予卡钼和紫杉醇 (paclitaxel)通常被认为是卵巢癌的标准治疗方案。考虑到转移性卵巢癌主要连累腹膜表 面，活性的化疗剂也可以通过腹膜内途径给予。可选择地，基于钼的化疗也可以用。其它化 疗药物，如脂质体化多柔比星（liposomal doxorubicin)和拓扑替康（topotecan)或吉西 他滨（gemcitabine)也可以用。
[0045] 另一个可选用的治疗方案是异环磷酰胺（iphosphamid),顺钼（cisplatin)和紫 杉醇，其中优选异环磷酰胺与顺钼组合或异环磷酰胺与紫杉醇组合。本发明公开的体外方 法允许为通过体外（ex vivo)诊断方法测定的特定风险组选择最有效的化疗。
[0046] 根据所选治疗的效果来监测患者癌症的进展也很重要。通过本发明记载的方法可 以实施体外（ex vivo)诊断方法和观察通过特定治疗所获得的效果。在获得所述诊断方法 的结果之后可以决定治疗模式是否继续、调整或改变。进一步地更好的预测癌症疾病的进 展通常是想要的。
[0047] 在本发明的体外（in vitro)方法中，样本经过这样一种方式治疗以至于Treg细 胞与Thl7细胞或Treg细胞与Thl和/或Th2细胞的比率被测定。在本发明的一个特定优 选实施例中Treg细胞与Thl7细胞的比例被测定。该测定是通过本领域技术人员所公知的 方法实施。通常细胞是通过针对该类细胞群体特有的特异性表面标记物的抗体来鉴定。也 可以组合使用多种针对特异性表面标记物的抗体。然而重要的是至少一种针对表面标记 物的抗体被使用，该表面标记物对特定的细胞类型是特异的。为了鉴定Treg细胞，优选使 用至少一种、优选至少2种和更优选至少3种选自由抗-⑶3,抗-⑶4,抗⑶8,抗-⑶25， 抗-CD127和抗-CR4构成的组的抗体、尤其优选抗FoxP3和/或抗-Helios。
[0048] 细胞特征通常是通过流式细胞分析进行（荧光激活细胞分选术，FACS)，其允许测 定细胞群体。在一个尤其优选的实施例中，测定细胞是否属于Treg细胞群或属于Thl7细 胞群。
[0049] 用于区别方法（differentiation method)中的样本可以来自于癌组织或癌组织 的转移部位。例如这样的样本可以是手术后从患者中去除的，当原发性肿瘤或大的转移性 肿瘤去除时这是常见的。样本也可以由活组织检查获得。
[0050] 可选择地，样本可以来自于细胞培养，培养的细胞可来源于肿瘤组织。可以剪碎肿 瘤组织并分离肿瘤细胞，将它们培养在常规条件下。但是需要注意避免因添加细胞因子到 生长培养基中导致的错误结果，细胞因子可能对细胞区别具有影响。
[0051] 为了控制的目的可以要求在来自于血液的细胞上实施本发明记载的方法，尤其是 来自于外周单核血细胞。
[0052] 肿瘤组织中不同类型的肿瘤浸润免疫细胞的存在和预后价值已经被广泛研究，然 而对于疾病进展过程中肿瘤组织内的免疫细胞模式的变化知道的很少。为了研究癌症组织 内免疫细胞分布的动态，选择足够的早期和晚期疾病患者至关重要。然而，由于仅有少于 15%的EOC患者在I期时被诊断出，因此在前瞻性研究中对早期卵巢癌病灶的微环境的研 究非常困难。尽管很难获得早期疾病患者的新鲜肿瘤组织样品，仍有6份I期患者的肿瘤 样本能与来自更晚期疾病（II-IV期）的患者的38个肿瘤样本一起分析。
[0053] 所述实验的主要部分已经在患有卵巢癌的患者中实施。但猜测所测T细胞的比率 变化的一般规律会随癌症进展而类似地变化。因此本发明公开的方法能用于所有类型的癌 症，尤其是前列腺癌、乳癌、结肠癌。然而优选的是体外（in vitro)诊断方法的使用应用于 患有卵巢癌的患者。
[0054] 已经发现⑶4+T细胞的不同亚型，而不是其它的免疫细胞类型，在疾病进展过程 中存在并展示出明显不同的模式。实际上，EOC的早期阶段是以强的Thl7免疫应答为特点 (参见图1A)，然而在疾病的晚期阶段检测到调节性T细胞的优势种群（参见图2A)。令人 吃惊的是，⑶8+T淋巴细胞与pDCs并没有显示出任何实质性改变，然而mDCs和巨噬细胞的 比例在疾病进展过程中出现增加。Thl细胞的比例在II期肿瘤中轻微增加然后在疾病晚期 再降低。然而，mDCs和巨噬细胞的变化以及Thl细胞中的变化均没有统计学显著性。一种 类似的CD4+效应性T细胞动力学已经在EAE和感染的小鼠模型中记载，即Thl7的早期爆 发被大量的IFNy生产细胞取代。
[0055] 与这些发现一致的，Lohr 等人（Microbiol. Infect. 2009, 11，589-593)将抗原特 异性T细胞转入至表达被所述T细胞识别的抗原的转基因小鼠中，发现依次是Thl7发展再 是Thl效应性T细胞发展然后是疾病晚期Treg发展。该动态还没有在人类肿瘤的微环境 中描述，不确定由小鼠模型中获得的检测结果是否能转至人类。
[0056] 值得注意的是，肿瘤浸润性Thl7细胞的来源以及它们在肿瘤免疫中的真正作用 仍有争议。Kryczek等人[Blood (2009)，114, 1141-1149]已报道分离自EOC组织的巨噬细 胞能够体外诱导Thl7细胞。但是，由于IL-I β，IL-6和IL-23被认为对人Thl7细胞的分 化是必不可少的，那些在本申请中观察到的肿瘤微环境的细胞因子谱（cytokine profile), 尤其是IL-I β在I期患者中的非常低水平和IL-23的完全缺乏（参见图4C)，不支持Thl7 原位极化的假设。已经显示Thl7运输可通过CCR6/CCL20轴调节。令人吃惊的是，在本研 究中未观察到肿瘤组织中Thl7细胞的数量和CCL20水平之间的相关性。
[0057] 对比于Thl7细胞，更加多的研究关注于肿瘤中Tregs的运输特性和预后重要性。 Curiel等人[Nat. Med. (2004) 10, 942-949]已显示浸润卵巢癌组织的Tregs在体内和体外 有效地抑制TAA特异性免疫并对肿瘤生长做出贡献。这些作者还提出Treg肿瘤运输可由 CL22调节。通过CCL22/CCR4将Treg募集到肿瘤组织最近已经在乳癌患者中得到证实。
[0058] 本研究中已显示Ti-Tregs主要为Hel ios+激活的Tregs。大量的这些Ti-Tregs在 FoxP3 TSDR中去甲基。自然发生的，而不是体外TGFP诱导的，Foxp3+Tregs已显示出稳定 的Foxp3表达，其与TSDR的选择性去甲基化反应相关。类似地，Ikaros家族成员，Helios, 已经被报道为一种标记物用于区分天然发生的胸腺来源的Tregs (nTregs)和从天然⑶4+T 经外周诱导的Tregs (iTregs)，但是这些发现最近被质疑。因此，与其用于区分nTregs和 iTregs，Helios表现出可用于指示活化Tregs而不考虑它们的来源。综上所述，本发明公 开的EOC组织内Ti-Tregs中发现的Helios高表达和TSDR去甲基化，标示了这些细胞的稳 定性和高度活化状态。
[0059] 与关于Treg肿瘤运输的研究一致地，已经证实了在卵巢肿瘤细胞培养上清液中 Ti-Tregs的数量与CCL22的浓度高度相关。一致性地，Ti-Tregs与循环的Tregs比较，CCR4 表达明显更低。低水平的CCR4反应了其因CCL22的主动参与（active engagement)所致 的内在化。还发现了大量比例的Ti-Tregs(21.8±5. 1% )表达增殖标记物Ki67,这意味着 它们的大量局部扩增。
[0060] Faget 等人[Cancer Research (2011)，71，6143-6152]已经证实了 IFN Y 触发乳 腺肿瘤细胞生产CCL22。实际上，肿瘤细胞和免疫细胞浸润物（尤其是巨噬细胞和NK细 胞）之间的协作已经显示出对诱导大量CCL22是必不可少的。同样地，观察到卵巢癌细胞 系在IFNy刺激下生产趋化因子，包括大量的CCL22。最重要的是，在原发性卵巢癌组织来 源的细胞中，重组IFN γ选择性扩大CCL22生产但对其他所检测的趋化因子仅有很小的作 用（参见图6C)。在我们的研究中，肿瘤细胞、巨噬细胞和mDCs被确定为癌症组织样本中 CCL22的关键来源。
[0061] 总之，这些实验数据提示，在卵巢癌患者中抗肿瘤免疫应答的发展是高度动态的。 在疾病的早期阶段观察到Thl7细胞的强大的募集，紧随其后为Thl细胞、巨噬细胞和mDCs 的募集。在EOC的稍晚期，IFNy水平的升高（可能由迁移细胞生产的），以及巨噬细胞和 mDCs的比例的升高可能促成了 CCL22的生产和通过CCL22/CCR4的Tregs募集，由此促进了 抑制性微环境的发展。由于公开的研究结果清楚地展现了在晚期EOC中由活性的抗肿瘤免 疫应答到显著的免疫抑制的动态改变，因此新的癌症免疫治疗方案的研发应该不仅包括免 疫增强策略还应该靶向晚期疾病中的免疫抑制性肿瘤微环境。
[0062] 实验结果总结于图中：
[0063] 图 1
[0064] 按照疾病的分期的原发性卵巢肿瘤组织和外周血中Thl7细胞的比例表示为％ Thl7淋巴细胞相关于所有⑶4+T细胞。
[0065] ㈧数据以⑶4+T细胞中的Thl7淋巴细胞的比例表示，代表了每一期的平均值。
[0066] ⑶散点图门控于⑶3+CD4+细胞，显示了在两个代表性患者中的IL-17和IFN Y。
[0067] (C)柱代表了由PMA+伊屋诺霉素（ionomycin)刺激的肿瘤组织来源的细胞生产的 IL-17和IL-21的均值+标准误（S. E. M)。
[0068] (D)柱代表了肿瘤组织和外周血单核细胞（PBMC)中Thl7细胞的平均比例+标准 误。*ρ〈0· 05, **ρ〈0· Ol (A, ANOVA 后面跟着 Scheff6 检验；D,成对 t 检验）。
[0069] g| 2
[0070] 按照疾病分期的原发性卵巢肿瘤组织和外周血中Tregs的比例。
[0071] (A)数据以CD4+T细胞中的CD4+CD25+CD127-FoxP3+Tregs的比例表示，代表了每一 期的平均值。
[0072] (B)散点图门控于⑶3+⑶4+细胞，显示了在两个代表性患者中的 CD25+FoxP3+Tregs。
[0073] (C)柱代表了肿瘤组织和PBMC中Tregs的平均比例+标准误。
[0074] (D)散点图门控于⑶3+⑶4+CD25+⑶127_细胞，显示了一个代表性患者肿瘤组织中 的 FoxP3+Helios+Tregs。箱线图代表 CD^z+CDzs+CDlZTT7OxPS+Tregs 中 Helios+Tregs 的比例。 箱边缘代表了第25和第75个百分点，箱内线代表中值。须代表第10和第90个百分点。
[0075] (E)柱代表分离自疾病不同期的原发性卵巢肿瘤组织的细胞中FoxP3TSDR去甲基 的Tregs的比例。误差棒代表标准误。
[0076] (F)线显示了 ％肿瘤浸润Tregs和％ Thl7细胞之间的负性相关。
[0077] (G)线显示％肿瘤浸润Tregs和肿瘤浸润巨噬细胞数量之间的负性相关。 *p〈0. 05, #p〈0. 01 (A, ANOVA 后面跟着 Scheff6 检验；C, D,成对 t 检验）。
[0078] g| 3
[0079] 依据疾病分期的原发性卵巢肿瘤组织中Thl淋巴细胞、髓样树突状细胞（mDCs)和 巨噬细胞的比例。（A)数据表示为⑶4+T细胞中⑶3+⑶4+IFN γ +Thl细胞的平均比例+标 准误。（B)柱代表在IM分离的肿瘤来源细胞中⑶45+系TlLA-DR+⑶14XDllc+mDCs的平均数 量+标准误。（C)柱代表在IM分离的肿瘤来源细胞中⑶45+系_HLA-DR +⑶14+巨噬细胞的 平均数量+标准误。
[0080] g| 4
[0081] 肿瘤来源单细胞悬液中细胞因子和趋化因子谱。（A)白柱代表平均的自发的细胞 因子生产；黑柱代表在PM和伊屋诺霉素（ionomycin)刺激下细胞因子的生产。（B)柱代 表平均的自发性的趋化因子生产。所有的误差棒代表标准误。（C)点代表疾病进展过程中 Thl7极化细胞因子和IL-17的平均自发性生产的动态。（D)以β -肌动蛋白mRNA表达的 平均比例表示的点指示着在疾病进展过程中TGFi3 mRNA表达的动态。
[0082] 图 5
[0083] 募集Tregs到卵巢肿瘤组织中可能是由CCL22介导的。（A)柱代表肿瘤组织来 源的细胞培养上清液中CCL22(巨噬细胞来源的趋化因子）的生产+标准误。（B)散点图 代表CCL22生产和Ti-Tregs数量之间的正相关。（C)柱状图显示了一个代表性患者的肿 瘤组织（黑线）和外周血（灰线，带色彩的）中CD4+CD25 +CD127-FoxP3+Tregs上CCR4的表 达。柱代表肿瘤组织和外周血中⑶4+CD25+⑶127ToxP3+Tregs上CCR4的平均荧光强度+标 准误（η = 6)。（D)柱代表肿瘤组织和外周血中增殖性Ki67+CD4+CD25+CD127ToxP3+Tregs 和CD4+FoxP3_传统T细胞（Tconv)的平均比例+标准误（η = 6)。（E)散点图门控于 CD3+CD4+细胞，显示了在一个代表性III期患者中Ki67+FoxP3+Tregs和FoxPSTconv的比 例。*ρ〈0·05(成对t检验）
[0084] 里^
[0085] 在卵巢癌细胞系和患者中IFNy诱导趋化因子的生产。（A，B)柱代表了在有 (黑柱）或无 IFNy (白柱）刺激下卵巢癌细胞系中平均的趋化因子生产+标准误。（C) 数据以IFNy刺激的原发性肿瘤来源的细胞培养对比于无刺激培养的趋化因子水平的 平均倍数变化+标准误表示。（D)柱状图表示原发性肿瘤来源的细胞中CCL22的自发 性表达。细胞门控于⑶45-EpCAM +肿瘤细胞、⑶45+系-HLA-DR+⑶14+巨噬细胞和⑶45+ 系 IA-DR+CD14TD11 c+mDCs。
[0086] 图 7
[0087] 显示了卵巢癌的不同分期时Tregs和Thl7细胞之间比例的差异。图7清楚的显 示了 FIGO I期的平均值为0. 7左右，FIGO II期为6. 7左右，FIGO III/IV期为约47。
[0088] 实施例1
[0089] a)患者和组织样本
[0090] 外周血和原发性卵巢上皮癌标本获自于2009年3月至2011年10月期间在布拉 格Motol大学医院经历初次细胞减灭术的44位患者。研究中登记的患者在手术之前没有 接受过新的辅助化疗。所有的组织标本在患者同意后收集，该研究是经过Motol大学医院 机构审批委员为批准。
[0091] 表 1
[0092]
【权利要求】
1. 诊断和/或监测和/或预测癌症疾病的进展的体外方法，其特征为测定至少一个样 本中Tregs细胞与包含Thl7细胞、Thl细胞和/或Th2细胞的组的至少另一组T细胞的比 率。
2. 权利要求1所述的体外方法，其特征在于为了确定Tregs细胞与所述另一组T细胞 组的比率，将Thl7细胞、Thl细胞和Th2细胞视为一个组。
3. 权利要求1或2的体外方法，其中所述诊断是用于将患者划分为特定的风险组。
4. 权利要求1所述的方法，其特征在于测定Tregs细胞与Thl7细胞的比率。
5. 权利要求1-4所述的方法，其特征在于样本来自于肿瘤或肿瘤来源的细胞培养。
6. 权利要求1-5任一项所述的体外方法，其特征在于样本是肿瘤的活组织检查标本。
7. 权利要求1-6任一项所述的体外方法，其特征在于样本是卵巢癌样本。
8. 权利要求1-7任一项所述的体外方法，其特征在于Tregs细胞的比率通过流式细胞 术分析来测定。
9. 权利要求8所述的体外方法，其特征在于对Tregs细胞的流式细胞术分析是用至少 一种选自由抗 CD3,抗-CD4,抗-CD8,抗-CD25,抗-CD127,抗-CR4,抗-FoxP3 和抗-Helios 构成的组中的抗体进行表面染色。
10. 权利要求1-7任一项所述的体外方法，其特征在于Tregs细胞对比于其它T细胞的 比率是通过ELISA测定。
11. 权利要求1-7任一项所述的体外方法，其特征在于Tregs细胞的百分比是通过实时 PCR测定。
12. 根据权利要求1所述的在测试个体内诊断和/或监测和/或预测癌症疾病的进展 的体外方法，所述方法包含步骤： a. 测量来自于所述测试个体的样本中Tregs细胞和选自于由Thl7细胞、Thl细胞和/ 或Th2细胞构成的组中的至少另一组T细胞的数量； b. 确定步骤a)中所测量的所述Tregs细胞数量与所述至少另一组T细胞数量之间的 比率；和 c. 将步骤（b)中所确定的比率与预定的基线阈值比较，其中测出差异则指示癌症。
13. 权利要求12所述的体外方法，进一步包含步骤（d)，是基于步骤（b)确定的比率和 步骤（c)中所述的预定的基线阈值之间的关系，将所述测试个体划分为特定的癌症阶段或 风险组。
14. 权利要求12所述的体外方法，其中所述的至少另一组T细胞包含Thl7细胞。
【文档编号】G01N33/50GK104364656SQ201380030845
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年6月27日 优先权日:2012年7月2日
【发明者】J.巴滕科瓦, R.斯皮塞克 申请人:索蒂奥公司