用于hsv-2的疫苗的制作方法

用于hsv-2的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了重组HSV-2蛋白和诸如佐剂等先天免疫系统激动剂的组合物作为疫苗。蛋白质包括包膜糖蛋白和不同于包膜糖蛋白的结构蛋白，例如衣壳蛋白或被膜蛋白。所述疫苗是用于HSV-2血清阳性或血清阴性受试者。
【专利说明】用于HSV-2的疫苗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求美国临时专利申请号61/647,764(2012年5 月16日提交）、61/679, 387 (2012年8月3日提交）以及61/714,158 (2012年10月15日 提交）的权益，所有这些临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 参考序列表
[0004] 本专利申请的序列表单独以文件名"47733_SeqListing. txt"提供。此文件（其 形成于2013年5月16日，并且由45,969字节组成）的内容以其全文并入。

【技术领域】
[0005] 用于单纯疱疹病毒_2感染的疫苗以及相关方法和组合物。

【背景技术】
[0006] HSV-2 (单纯疱疹病毒-2)是疱疹病毒科的一个成员，疱疹病毒科是一组DNA病 毒，其往往引起皮肤损害（例如水痘和热病性疱疹）并且特征在于潜伏性和复发性感染。 HSV-2是生殖器溃疡的主要原因，生殖器溃疡可表现为充满流体的小水泡的群集，所述充满 流体的小水泡破裂并且形成含人痛苦的疮，需要数周来治愈。其它症状可包括发热、全身不 适感、肌肉疼痛、排尿痛苦、阴道分泌物以及腹股沟区域淋巴结肿大、疼痛。产生复发是有可 能的。病毒可在受感染受试者的一生中存在于神经细胞中，并且不定期重新激活，从而形成 皮肤溃疡。甚至在不存在实际溃疡的情况下，病毒也可产生并且在个体之间传播。其目前 是不可治愈的。
[0007] 生殖器疱疹是最普遍的性传播疾病。在美国，超过16%的人口或六个人中约一人 感染HSV-2,其中对女性（女性约20%而男性12% )和非洲裔美国人（总体约40%而非 洲裔美国人女性将近50%)造成不成比例的负担。（MorbidityandMortalityWeekly R印ort,59:456-459, 2010年4月23日）。在美国总共约5000万人受感染，其中约80 %未 意识到其感染，但仍可能是感染的。在世界上其它地方，HSV-2也达到流行病比例。WHO小 组估计2003年世界范围内53600万人受感染，并且以每年约2300万出现新的感染（Looker 等，BullWorldHealthOrgan. 86:805_812,2008)。尽管发病率因区域不同而不同，但大 体上发病率随年龄增加而增加，并且与在男性中相比在女性中更高。此外，发展中国家的 HSV-2发病率高于发达国家，例外为北美，其具有高HSV-2发病率；以及南亚，其具有相对低 的HSV-2发病率。最高发病率发现在撒哈拉以南非洲，其中几乎80%的女性和45%的男性 感染HSV-2。其它区域（值得注意的是东亚和东南亚）接近此水平。除性传播之外，HSV-2 可典型地在分娩时从女性传播至婴儿。伴随在成人美国人口的HSV-2流行性，新生儿感染 的发生率也已显著增加。在美国每年出现约1，800例新生儿HSV感染，这是比新生儿HIV 感染更高的病例数。
[0008] HSV-2感染的健康暗示是摇摆不定的。尽管绝大多数感染个体是无症状的，但病 毒仍可传播。那些具有症状者忍受其生殖器和肛门区域的令人痛苦的疮并且往往具有流感 样症状，诸如发热和腺体肿胀。不幸的是，那些首次发作HSV-2者在单单第一年内就很可能 再发作若干次（典型地四次或五次）。不管症状的严重性如何，得知感染往往造成压力并 且可负面影响生活质量（Rosenthal等，SexTransmInfect. 82:154, 2006;Crosby等Sex Health，5:279-283, 2008)。在感染HSV-2的婴儿中，因HSV感染造成的新生儿脑炎的死亡 率甚至在治疗的情况下还>15%，并且在HSV-2感染婴儿中在幸存案例中神经病学发病率 又是30-50%。伴随着HSV-2的高发病率，存在一种很明显的认识：HSV-2感染基本上增加 了HIV-1感染和传播的危险。来自非洲的资料显示HSV-2感染可使HIV传播的危险增至高 达七倍并且新感染的HIV病例中高达一半是直接归因于HSV-2感染。总的说来，在HSV-2 感染个体中HIV感染的相对危险性增至超过两倍。HSV-2对HIV感染的协同作用比任何其 它性传播感染更大，这加强了对能够使当前HSV-2流行性的影响减到最低程度的有效公众 健康策略的需要。
[0009] 尽管广泛使用药理学干涉，在成人和儿科群体中HSV-2发病率仍逐渐增加。在感 染早期以高剂量给予诸如阿昔洛韦（acyclovir)等抗病毒药物可减少HSV传播，但这并不 阻止神经元神经节的潜伏性感染。抗病毒治疗具有许多缺点，包括作为副作用的恶心、呕 吐、皮疹以及肾功能减退，并且应谨慎使用，因为它们可能产生畸形并且对发育中的胚胎具 毒性。此外，不管早期干涉如何，连续抑制性施用伐昔洛韦（valcyclovir)使HSV传播减 至小于50%。即使此水平的影响是可接受的，但考虑高成本和80%受感染者未意识到其状 态，所述方法是不切实际的。诸如局部杀微生物剂等抗病毒药物替代物在临床上未经证实， 并且物理屏障（例如避孕套）具有边际"现实世界"功效。由于这些原因，接种对与HSV-2 感染斗争并且减小其健康影响来说必不可少。
[0010] 首株HSV疫苗在二十世纪二十年代产生，并且从那时起，已试验过多种疫苗途径， 全部无效。包括全病毒、灭活病毒、减毒活病毒、修饰型活病毒以及细胞培养物衍生的亚单 位的常规历史悠久的疫苗类型大部分是不成功的或功效低（Stanberry，Herpes11 (增刊 3)161A-169A，2004)。随着重组DNA技术的出现，已产生重组亚单位疫苗。这些疫苗包含 一种或两种与佐剂组合的包膜糖蛋白。糖蛋白是有吸引力的候选物，主要因为它们是中和 抗体的目标并且它们在HSV-2株中高度保守。在最近十年间，对两种候选疫苗的广泛临床 试验（一个由Chiron发起并且另一个由GlaxoSmithKline发起）皆因功效不够而停止。 Chiron的疫苗包含与佐剂MF59组合的两种HSV-2糖蛋白的截短形式gD2和gB2。所述疫 苗最多提供针对HSV-2的暂时保护，不过产生抗体对HSV-2的高效价（Stanberry，同前）。 GlaxoSmithKline(GSK)研发并且测试了一种类似疫苗；然而其仅含有单一糖蛋白gD2以及 明矾和MPL作为佐剂。在八年的研究和临床试验之后，GSK于2010年10月宣布其失败。疫 苗在预防血清阴性女性（已似乎有益的早期临床试验中仅有的组）感染方面不成功。


【发明内容】

[0011] 在本公开的一个实施方案中，提供一种选自以下的HSV-2多肽的免疫原性片 段：（a)UL19多肽的免疫原性片段，其缺乏SEQIDN0:4的第1-450位氨基酸的至少75%并 且缺乏SEQIDN0:4的第1055-1374位氨基酸的至少75% ;(b)SEQIDN0:12中所示的序 列；(c) (a)或（b)的免疫原性变体，其在至少15个连续氨基酸上保持至少85%氨基酸同一 性；(d) (a)或（b)的免疫原性片段；以及（e) (a)、(b)、（c)或⑷的嵌合融合体。在另一个 实施方案中，提供一种编码以上所提到的多肽的分离的多核苷酸。
[0012] 本公开还提供药物组合物。在一个实施方案中，提供一种包含以下的免疫原性药 物组合物：⑴选自以下的HSV-2多肽的免疫原性片段：（a)UL19多肽的免疫原性片段，其 缺乏SEQIDN0:4的第1-450位氨基酸的至少75 %并且缺乏SEQIDN0:4的第1055-1374 位氨基酸的至少75%; (b)SEQIDNO: 12中所示的序列；（c) (a)或（b)的免疫原性变体，其 在至少15个连续氨基酸上保持至少85%氨基酸同一性；（d) (a)或（b)的免疫原性片段；以 及（e) (a)、（b)、（c)或⑷的嵌合融合体；（ii)任选地，激活先天免疫的试剂；以及（iii) 药学上可接受的载体。
[0013] 在另一个实施方案中，提供以上所提到的组合物，其进一步包含UL25或其免疫原 性片段。在另一个实施方案中，组合物进一步包含gD2或其免疫原性片段。
[0014] 在本公开的另一个实施方案中，提供以上所提到的组合物，其中所述试剂是佐剂。 在一个实施方案中，所述佐剂是GLA。在另一个实施方案中，GLA呈水包油乳液或水溶液形 式。在某些实施方案中，水包油乳液包含角鲨烯。
[0015] 在本公开的另一个实施方案中，提供一种用于治疗受试者的HSV-2感染的方法， 其包括向受试者施用以上所提到的组合物。在另一个实施方案中，提供一种在受试者中产 生免疫反应的方法，其包括向受试者施用以上所提到的组合物。在另一个实施方案中，提 供一种用于针对HSV-2对受试者进行免疫的方法，其包括向受试者施用以上所提到的组合 物。根据公开的各种实施方案，提供一种以上所提到的方法，其中施用途径是真皮内、经粘 膜、肌肉内、皮下、舌下、直肠或阴道施用。在另一个实施方案中，提供一种以上所提到的方 法，其进一步包括向受试者施用如权利要求3-8中任一项所述的第二、第三或第四组合物。
[0016] 所要求的发明是针对适用于预防或治疗受试者（优选地人类，在一个实施方案中 人类是女性，而在另一个实施方案中人类是男性）的HSV-2(单纯疱疹病毒2)感染的组合 物和方法。组合物包含（i)HSV-2的包膜糖蛋白或HSV-2包膜糖蛋白的免疫原性片段，（ii) HSV-2结构蛋白或HSV-2结构蛋白的免疫原性片段，其中结构蛋白不是包膜糖蛋白中的一 种，（iii)激活受试者的先天免疫的试剂以及（iv)药学上可接受的载体。在某些实施方案 中，包膜糖蛋白是gD2并且组合物具有gD2，或者在一个替代实施方案中，具有衍生自gD2的 免疫原性片段。在一些实施方案中，结构蛋白是UL47、ICPO、ICP4、ICP47、UL5、UL8、UL15、 UL19、UL25、UL30、UL32、UL46、UL39 (ICP10)、UL7、UL40、UL54 以及UL26 中的一种或多种， 并且如果存在免疫原性片段，那么其衍生自UL47、ICP0、ICP4、ICP47、UL5、UL8、UL15、UL19、 UL25、UL30、UL32、UL46、UL39 (ICP10)、UL7、UL40、UL54 和 / 或UL26。应了解，从一种疱疹 病毒到另一种疱疹病毒蛋白质的精确序列可不同，并且因此对HSV-2蛋白的所有提及均涵 盖可获自任何天然存在的HSV-2的任何所述蛋白质。在其它实施方案中，存在UL19与UL25 两者或UL19(例如SEQIDN0. 12,一种类型的上域片段）和UL25的片段或全蛋白与片段的 混合物，例如全长UL25与例如SEQIDN0. 12的UL19的片段、任选地与UL47或其片段的混 合物。有时，激活先天免疫的试剂是佐剂。具体地说，佐剂可以是GLA或另一种MALA佐剂。 在一个实施方案中，免疫原性药物组合物包含gD2、GLA或另一种MALA佐剂以及两种或三 种选自以下的抗原：全长UL25、UL19以及UL47或其片段；以及药学上可接受的载体。在相 关实施方案中，免疫原性药物组合物包含MALA佐剂（优选地具有图1结构式的GLA)、gD2、 UL25、UL19上域片段以及药学上可接受的载体；任选地所述组合物进一步包含一种或多种 其它HSV-2结构蛋白或其片段。
[0017] 在一些实施方案中，组合物包含HSV-2的包膜糖蛋白的抗原部分以及药学上可接 受的载体。术语"免疫原性片段"和"免疫片段"以及"抗原部分"在本文中可互换使用，用 于命名引发抗体反应或细胞毒性反应并且保持全长蛋白的特异性（与其交叉反应性）的蛋 白质片段或部分。在某些实施方案中，抗原部分结合于中和抗体。在某些实施方案中，抗原 部分来自gD2或gB2,而在其它实施方案中，抗原部分无论来自gD2、gB2或另一种包膜糖蛋 白，均包含至少一部分并且任选地所有前导序列。在任一实施方案中，抗原部分包含来自包 膜糖蛋白的两个或更多个线性表位或包含两个或更多个不连续表位。在任一实施方案中， 组合物进一步包含激活先天免疫的试剂。所述试剂可以是佐剂，诸如如在例如美国公布号 2009/0181078 中所公开的GLA。
[0018] 所述方法可用于治疗HSV-2感染或用于产生免疫反应，其可预防或改善HSV-2感 染。适合用于所述方法的受试者包括是HSV-2血清阳性的受试者以及是HSV-2血清阴性的 受试者。在所述方法中，向受试者施用本文所描述的组合物中的一种。
[0019] 本发明的一些示例性陈述阐述如下，使用标识（xy)，其中X和y各表示字母，标 识表示实施方案，或者当在一个实施方案内标示超过一个（xy)时表示实施方案的群组。 (AA) -种免疫原性药物组合物，其包含（i)HSV-2的包膜糖蛋白或其免疫片段；（ii)不同 于HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的结构蛋白或其免疫片段；（iii)激活先天免疫的试剂；以 及（iv)药学上可接受的载体。（AB)组合物（AA)，其中HSV-2的包膜糖蛋白是gD2,并且组 合物包含gD2。（AC)组合物（AA)，其中组合物包含gD2的免疫片段。（AD)(AA)、（AB)以及 (AC)中的任何一种或多种的组合物，其中HSV-2的结构蛋白是一种或多种选自以下的蛋白 质：见47、10?0、皿25、见46、皿39、见7以及皿26。（4￡)组合物仏4)，其中批￥-2的结构蛋白 是UL19。（AF)组合物（AB)，其中HSV-2的结构蛋白是UL19。（AG)组合物（AA)，其中HSV-2 的结构蛋白是UL19的免疫片段，例如SEQIDN0. 12。（AH)组合物（AB)，其中HSV-2的结构 蛋白是UL47的免疫片段。（AI)组合物（AA)，其中HSV-2的结构蛋白是UL25。（AJ)组合物 (AB) ，其中HSV-2的结构蛋白是UL25。（AK)组合物（AA)，其中HSV-2结构蛋白是UL25的免 疫片段。（AL)组合物（AB)，其中HSV-2的结构蛋白是ICPO。（AM)组合物（AA)，其中HSV-2 的结构蛋白是UL47。（AN)组合物（AB)，其中HSV-2的结构蛋白是UL47的片段。（A0)组合 物（AA)，其中不同于HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的结构蛋白是UL47,并且是其免疫片段。 (AP)组合物（AB)，其中不同于HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的结构蛋白是UL47,并且是其 免疫片段。（AQ) (AA)、（AB)、（AC)、（AD)、（AE)、（AF)、（AG)、（AH)、（AI)、（AJ)、（AK)、（AL)、 (AM)、（AN)、（AO)、（AP)中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含不同于HSV-2的包膜 糖蛋白的第二HSV-2的结构蛋白或其免疫片段。（AR)组合物（AQ)，其中不同于HSV-2的包 膜糖蛋白的第二HSV-2的结构蛋白选自UL19、UL25以及UL47,其中第二结构蛋白与所述结 构蛋白不同。（AS)组合物（AR)，其包含第二结构蛋白。（AT)组合物（AR)，其包含第二结构 蛋白的免疫片段。（AU) (AE)、（AF)、（AG)和/或（AH)中的任何一种或多种的组合物，其进 一步包含UL25。（AV) (AE)、（AF)、（AG)和/或（AH)中的任何一种或多种的组合物，其进一 步包含UL25的免疫片段。（AW) (AE)、（AF)、（AG)和/或（AH)中的任何一种或多种的组合 物，其进一步包含UL47。（AX) (AE)、(AF)、(AG)和/或（AH)中的任何一种或多种的组合物， 其进一步包含UL47的免疫片段。（AY) (AI)、（AJ)、（AK)和/或（AL)中的任何一种或多种 的组合物，其进一步包含UL19。（AZ) (AI)、（AJ)、（AK)和/或（AL)中的任何一种或多种的 组合物，其进一步包含UL19的免疫片段，例如SEQIDNO12。（BA) (AI)、（AJ)、（AK)和/或 (AL)中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含UL47。（BB) (AI)、(AJ)、(AK)和/或（AL) 中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含UL47的免疫片段。（BC) (AM)、(AN)、(A0)和/ 或（AP)中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含UL19。（BD) (AM)、（AN)、（A0)和/或 (AP)中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含UL19的免疫片段。（BE) (AM)、(AN)、(A0) 和/或（AP)中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含UL25。（BF) (AM)、（AN)、（AO)和 /或（AP)中的任何一种或多种的组合物，其进一步包含UL25的免疫片段。（BG) (AA)、（AB)、 (AC), (AD), (AE), (AF), (AG), (AH), (AI), (AJ), (AK), (AL), (AM), (AN), (AO), (AP), (AQ), (AR)、（AS)、（AT)、（AU)、（AV)、（AW)、（AX)、（AY)、（AZ)、（BA)、（BB)、（BC)、（BD)、（BE)以及 (BF)中的任何一种或多种的组合物，其中所述试剂是佐剂。（BH)选自（BG)的组合物，其中 佐剂是GLA或另一种MALA佐剂，并且（BG)中的选项各自或每一种独立地被挑选作为本发 明的不同实施方案。（BI)组合物（AA)，其包含gD2 ;UL25 ;UL19 ;GLA或另一种MALA佐剂；以 及药学上可接受的载体。（BJ)组合物（AA)，其包含gD2、UL25以及UL19的免疫片段。（BK) 组合物（AA)，其包含gD2、UL19以及UL25的免疫片段。（BL) (BI)、（BJ)以及（BK)中的任何 一种或多种的组合物，其进一步包含UL47。（BM)(BI)、（BJ)以及（BK)中的任何一种或多种 的组合物，其进一步包含UL47的免疫片段。（BN) -种用于治疗受试者的HSV-2感染的方 法，其包括向受试者施用（AA)、（AB)、（AC)、（AD)、（AE)、（AF)、（AG)、（AH)、（AI)、（AJ)、（AK)、 (AL) 、（AM)、（AN)、（AO)、（AP)、（AQ)、（AR)、（AS)、（AT)、（AU)、（AV)、（AW)、（AX)、（AY)、（AZ)、 (BA) 、（BB)、（BC)、（BD)、（BE)、（BF)、（BG)、（BH)、（BI)、（BJ)、（BK)、（BL)以及（BM)中的任 何一种或多种的组合物。（BO) -种用于在受试者中产生对HSV-2的免疫反应的方法，其包 括向受试者施用（AA)、（AB)、（AC)、（AD)、（AE)、（AF)、（AG)、（AH)、（AI)、（AJ)、（AK)、（AL)、 (AM) 、（AN)、（AO)、（AP)、（AQ)、（AR)、（AS)、（AT)、（AU)、（AV)、（AW)、（AX)、（AY)、（AZ)、（BA)、 (BB) 、（BC)、（BD)、（BE)、（BF)、（BG)、（BH)、（BI)、（BJ)、（BK)、（BL)、（BM)以及（BN)中的任 何一种或多种的组合物。（BQ)方法（BO)，其中受试者是HSV-2血清阳性并且HSV-1血清阳 性的。（BR)方法（B0)，其中受试者是HSV-2血清阳性并且HSV-1血清阴性的。
[0020] 在一个实施方案中，提供一种组合物，其包含HSV-2的包膜糖蛋白或其免疫片段； 两种同于HSV-2的包膜糖蛋白的HSV-2的结构蛋白或其免疫片段；激活先天免疫的试剂； 以及药学上可接受的载体。示例性组合物是包含以下成分的组合物：gD2、UL25以及SEQ IDN0. 12 (UL19的片段）以及单磷酰脂质A(MALA)佐剂，例如GLA。除gD2特异性抗体反应 之外，用此组合物接种可引起与用活病毒进行后续感染相对应的加强的HSV-2抗原特异性 ⑶4和⑶8效应因子和记忆T细胞。值得注意的是，用此组合物进行预防性免疫可大大地 或完全地针对C57BL/6小鼠中致死性阴道内HSV-2感染进行保护，其中生殖器粘膜与背根 神经节两者中为消除性免疫。此组合物可使通过事先用减毒HSV-2株感染所诱导的CD4与 CD8T细胞两者增加。与此一致，当用作用于豚鼠的复发性HSV-2损害的治疗时，此组合物可 降低复发性损害的频率。
[0021] 还提供试剂盒。在一些试剂盒中，存在包含药物组合物的小瓶，所述药物组合物包 含HSV-2包膜糖蛋白的抗原部分以及药学上可接受的载体。
[0022]在参考以下详细描述和随附图式之后，本发明的这些和其它方面以及实施方案将 变得很明显。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1A-B呈现GLA的图式（用于实施例中的佐剂）以及具有表面活性剂磷脂酰胆 碱和普卢兰尼克F68(PluronicF68)的示例性油滴的示意图。
[0024] 图2示出了gD2特异性CD4T细胞反应。数据是在用包含如所指示的不同水平的 重组蛋白和GLA的二价疫苗以28天时间间隔将Balb/c小鼠（4只/组）壁内免疫两次之 后获得。这些图表是关于IL-2、TNF_a以及IFN-Y的细胞内产生的流式细胞术分析的结 果。
[0025] 图3示出了在引发后D25天（加强后D4)分析的针对0VA257肽的脾⑶8T细胞反 应；重组0VA= 5yg;SE= 2% ;慢病毒s.c.递送；重组OVAi.m.递送。
[0026] 图4是显示加强之后4天测量的细胞因子阳性⑶8T细胞百分比的图表。在第0天 进行引发并且在第21天进行加强。柱拟1、(10冊55，(121，？85;拟2，(10，1^-0￥4，(121，？85;拟3， dOLV-OVA,d21LV-0VA；HA4,dOLV-〇VA,d2120ugGLA-SE；HA5,dOLV-〇VA,d210VA+SE；HA6, dOLV-OVA,d210VA+20ugGLA-SE；HA7,dOLV-〇VA,d21,4ug0VA+GLA-SE；HA8,dOLV-〇VA, d210VA+0. 8ugGLA-SE〇
[0027] 图5A-B示出了在用与5iigGLA-SE组合的5iig重组gD、UL19或UL25蛋白经由 引发/加强免疫方案（d0引发/d21加强）对C57BL/6小鼠组（5只/组）进行免疫之后获 得的数据。在加强后第4天，通过在用事先确定为含有关于相应重组蛋白免疫原的⑶4表位 的15-mer肽进行离体再刺激之后进行关于IFN-y、TNF-a以及IL-2的细胞内染色来测量 脾CD4T细胞反应。A)指示了在用相应重组蛋白免疫原免疫的小鼠中各15-mer肽的CD4T 细胞反应的代表性ICS点状图。B)描绘了各组的细胞因子阳性CD4T细胞百分比。
[0028] 图6A-B示出了在用在等摩尔基础（分别0.8、3.3以及1.4iig蛋白质）上与 5. 5ygGLA-SE组合调配并且以组合形式递送的重组gD、UL19以及UL25蛋白经由引发/加 强方案（d0引发/d21加强）对一组五只C57BL/6小鼠进行免疫之后获得的数据。在加强 后第4天，通过在用事先确定为含有关于各重组蛋白免疫原的⑶4T细胞表位的15-mer肽 离体再刺激之后进行关于IFN-y、TNF-a以及IL-12的细胞内染色来测量脾⑶4T细胞反 应。将来自各肽库的缺少CD4T细胞表位的个别肽包括在内作为阴性对照。A)描绘了各组 的细胞因子阳性⑶4T细胞百分比。B)在三价疫苗内各重组蛋白免疫原的IgGl亚类抗原特 异性抗体的血清终点效价（定义为>2倍背景值的最高血清稀释度的倒数）。
[0029] 图7A-B示出了当用与gGLA-SE组合递送的g重组UL19蛋白经由引发（d0) 或引发加强（d0引发/d21加强）免疫方案对各组C57BL/6小鼠（5只/组）进行免疫时 获得的数据。在最后一次免疫后第4天或第10天，通过在用事先确定为含有关于UL19的 ⑶4T细胞表位的15-mer肽离体再刺激之后进行关于IFN-y、TNF-a以及IL-12的ICS来 测量脾CD4T细胞反应。A)指示了在用相应重组蛋白免疫原免疫的小鼠中UL19 15-mer肽 297的⑶4T细胞反应的代表性ICS点状图。描绘了各组的细胞因子阳性DC4T细胞百分比。 B)描绘了各组对UL19 15-mer250或297作出反应的细胞因子阳性⑶4T细胞百分比。
[0030] 图8A-B示出了当用单独或与5iigSE或GLA-SE组合递送的5iig重组UL19蛋 白经由引发（do)或引发加强（do引发/d21加强）免疫方案对各组C57BL/6小鼠（5只/ 组）进行免疫时获得的数据。在最后一次免疫后第5天或第10天，通过在用事先确定为含 有关于UL19的⑶4T细胞表位的15-mer肽离体再刺激之后进行关于IFN-y、TNF-a以及 IL-12的ICS来测量脾CD4T细胞反应。A)指示了在用相应重组蛋白免疫原免疫的小鼠中 UL19 15-mer肽297的⑶4T细胞反应的代表性ICS点状图。描绘了各组的细胞因子阳性 ⑶4T细胞百分比。B)描绘了各组对UL19 15-mer250或297作出反应的细胞因子阳性⑶4T 细胞百分比。
[0031] 图9A-C示出了当用在等摩尔或等质量基础上调配的重组蛋白经由引发加强（d0 引发/d21加强）免疫方案对各组C57BL/6小鼠（5只/组）进行免疫时获得的数据。递送 的总蛋白是5yg或15yg。在最后一次免疫后第5天，通过在用事先确定为含有⑶4T细胞 表位的15-mer肽离体再刺激之后进行关于IFN-y、TNF-a以及IL-12的细胞内染色来测 量脾CD4T细胞反应。A)描绘了对gD肽作出反应的细胞因子阳性CD4T细胞百分比。B)描 绘了对UL19肽作出反应的细胞因子阳性CD4T细胞百分比。C)描绘了对UL25肽作出反应 的细胞因子阳性CD4T细胞百分比。
[0032] 图10示出了当用以100iil(50iil/腿）肌肉内递送的与gGLA-SE、单独SE或 PBS媒介物组合的g重组gD蛋白经由引发/加强免疫方案（d0引发/d21加强）对各组 BALB/c小鼠（5只/组）进行免疫时获得的数据。通过ELISA测量IgG、IgGl以及IgG2a同 型抗原的HSV-2gD2特异性抗体。
[0033] 图11示出了当用三价疫苗或对照疫苗物品对各组的五个C57BL/6小鼠进行单次 肌肉内免疫时获得的数据，所述三价疫苗由与5iigGLA-SE组合的重组gD2、UL19ud以及 UL25各5yg组成。在免疫后第6天，通过在用gD2、UL19或UL25肽进行脾细胞培养5小 时的离体再刺激之后进行关于IFN-y、TNF-a以及IL-2的细胞内细胞因子染色（ICS)来 测量抗原特异性脾CD4和CD8T细胞反应。A)对gD2、UL19ud或UL25肽作出反应的CD4T 细胞的频率和细胞因子表型。B)对UL19肽作出反应的CD8T细胞的频率和细胞因子表型。 C)在早期用具有GLA-SE的三价疫苗免疫4周并且用减毒HSV-2胸苷激酶缺乏型（TK-)病 毒进行皮下激发的小鼠中对UL19肽作出反应的CD8T细胞的频率。
[0034] 图12显示当用二价疫苗对各组的十只C57BL/6小鼠相隔28天进行两次肌肉内免 疫时获得的数据，所述二价疫苗由与5118 61^-5￡或5%右旋糖媒介物组合的重组§02和 UL19ud各5yg组成。用单独5ygGLA-SE免疫的小鼠充当阴性对照。第二次免疫后22天， 将小鼠用药性持久的乙酸甲羟孕酮处理并且接着在六天后用50xLD5Q剂量的野生型HSV-2 阴道内激发。每天监测小鼠的生殖器损害形成和存活率。感染后第1天、第3天以及第5 天，收集阴道拭子用于通过PCR定量HSV-2DNA。感染后约2个月，从幸存小鼠收获背根神经 节并且通过PCR定量潜伏性HSV-2DNA。如图12中图片A所描绘，与用单独gD2和UL19ud 或单独GLA-SE免疫的小鼠相比，用gD2和UL19ud加上GLA-SE免疫的小鼠的损害形成显著 降低并且存活率增加。同样地，如图12中图片B所描绘，用gD2和UL19ud加上GLA-SE免 疫的10只小鼠中9只到第5天不具有可检测的HSV-2DNA，然而在任一对照组中的小鼠在5 天中均在阴道中显示持续水平的HSV-2。如图12中图片C所描绘，尽管在仅GLA-SE组中 存在三只幸存鼠，但是这3只小鼠中2只在背根神经节中显示显著水平的潜伏性HSV-2,用 gD2和UL19ud加上GLA-SE免疫的小鼠在神经节中显示极少到不显示可检测的HSV-2。
[0035] 图13显示当将C57BL/6小鼠（5只/组）用次致死剂量的减毒HSV-2胸苷激酶缺 乏型（TK-)病毒皮下感染接着用三价疫苗免疫28天后时获得的数据，所述三价疫苗由与 5iigGLA-SE或5%右旋糖媒介物组合的重组gD2、UL19ud以及UL25各5iig组成。对照组 包括用单独GLA-SE或单独媒介物处理的感染小鼠以及用单独媒介物处理的未感染小鼠。 免疫后六天，在用UL19肽刺激之后通过ICS测量UL19特异性CD8 (上部图片）和CD4 (下 部图片）T细胞反应。
[0036] 图14显示当用次致死剂量的HSV-2株333病毒阴道内感染豚鼠（7只/组）并 且接着在感染后第13天和第27天用三价疫苗处理时获得的数据，所述三价疫苗由与5yg GLA-SE组合的gD2、UL19ud以及UL25各5yg组成。用单独GLA-SE处理的感染豚鼠充当 阴性对照。每天监测动物的阴道损害并且对各损害日分配以得分0-4。将各组的日损害得 分取平均值并且描绘随时间变化的曲线。
[0037] 图15显示当用三价疫苗对各组的十只C57BL/6小鼠相隔28天进行两次肌肉内 免疫时获得的数据，所述三价疫苗由与5ygGLA-SE或5%右旋糖媒介物组合的重组gD2、 UL19ud(参见SEQIDN0:12)以及UL25各5iig组成。用单独5iigGLA-SE免疫的小鼠充 当阴性对照。其它对照组由在激发之后24小时开始用5ygGLA-SE和1毫克/ml的阿昔 洛韦（aciclovir;ACV)/饮用水免疫的小鼠组成。第二次免疫后二十二天，将小鼠用药性持 久的乙酸甲羟孕酮处理并且接着在六天后用50xLD5Q剂量的野生型HSV-2阴道内激发。每 天监测小鼠的生殖器损害形成（图片A)和存活率（图片B)。
[0038] 图16:示出了用三价gD2、UL19ud(SEQIDN0:12)以及UL25疫苗免疫的小鼠的阴 道HSV-2DNA水平（关于各组小鼠的描述参见图15)。在感染后第1天、第3天以及第5天 收集阴道拭子，用于通过PCR定量HSV-2DNA。

【具体实施方式】
[0039] 本公开提供用于治疗或用于预防包括HSV-1和HSV-2感染的单纯疱疹病毒感染的 免疫原性药物组合物和方法。所述组合物包含免疫原性HSV-2病毒蛋白或病毒蛋白的免疫 原性部分，诸如片段或肽；以及至少一种激活先天免疫系统的试剂，优选地TLR4激动剂，例 如如本文所描述的MALA佐剂。病毒蛋白（以及片段和肽）包含至少一种包膜糖蛋白以及 至少一种、两种、三种或四种不同于包膜糖蛋白的结构蛋白。或者，病毒蛋白（以及片段和 肽）包含至少一种抗原表位并且可包含包膜蛋白的前导肽的一部分或全部。可使用免疫原 性片段。适用于组合物中的一些特定试剂包括佐剂，其为增强对抗原的免疫反应的物质。蛋 白质和片段典型地是通过重组技术产生，其中蛋白质或片段在所培养的细胞中表达。肽还 可以是化学合成的。
[0040]A?作为疫苗组分的HSV-2蛋白
[0041]HSV-2 (2型单纯疱疹病毒）是一种包膜病毒。其基因组在75种不同蛋白质上表 达。所述蛋白质中许多是结构蛋白并且用于形成衣壳和被膜，而另外一些是包膜的一部 分。主要衣壳蛋白包括由开放阅读框（如果常用名称不同于0RF名称，那么括号中为蛋白 质名称）UL6、UL18(VP23)、UL19(VP5)、UL35(VP26)以及UL38表达的蛋白质；主要被膜蛋 白包括UL7、UL11、UL13、UL14、UL16、UL17、UL21、UL25、UL36、UL37、UL41、UL46 (VP11/12)、 UL47 (VP13/14)、UL48 (VP16)、UL49、UL51 以及US11 ;主要包膜蛋白包括UL1 (糖蛋白 L(gL))、UL10 (gM)、UL20、UL22 (gH)、UL27 (gB)、UL43、UL44 (gC)、UL49A(gN)、UL53 (gK)、 US4(gG)、US5，（gJ)、US6(gD)、US7(gI)以及US8(gE)。（其它蛋白质名称可已用于文献中。） 示例性HSV-2基因组序列可见于基因库登录号NC001798. 1 (更新日期2010年4月23日 下午2:16,2011年1月10日录入；以全文并入）。应了解，通常使用的蛋白质名称可不同于 基因名称，例如UL19编码VP5,但在本文中提到基因名称等同于提到所编码的蛋白质。还应 了解，从一种疱疹病毒到另一种疱疹病毒蛋白质的确切序列可不同，并且因此对HSV-2蛋 白的所有提及（结构或包膜或非包膜）涵盖可获自任何天然存在的HSV-2的任何所述蛋白 质。许多序列是已知的并且存放于数据库中。编码具有替代序列的HSV-2蛋白的核酸可容 易地分离或用适当的寡核苷酸探针或引物（例如具体地说在严格条件下与参考序列杂交 者）扩增自一种或多种HSV-2 (例如存放的HSV-2或临床分离物）。在所述群组的编码例如 UL蛋白的HSV-2蛋白的核酸内，所述群组的一种核酸将在严格条件下与所述群组内的另一 种核酸的补体杂交。
[0042]术语"严格条件"是指使得探针将优先与其目标子序列并且在更低程度上与或根 本不与其它序列杂交的条件。在诸如南方和北方杂交等核酸杂交实验的情形中，"严格杂 交"和"严格杂交洗涤条件"具序列依赖性，并且在不同环境参数下不同。核酸杂交的详尽指 导可见于Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology- HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第 2 章,"Overviewofprinciples ofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays"，Elsevier(New York, 1993)中。在某些实施方案中，高度严格杂交和洗涤条件是比特定序列在规定离子强 度和pH值下的热力学熔点（TJ低约5°C。Tm是使得50%的目标序列与完全匹配的探针杂 交的温度（在规定离子强度和pH值下）。在某些实施方案中，非常严格条件等于特定探针 的V
[0043] 用于在南方或北方墨点法的过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂 交的严格杂交条件的实例是50%福尔马林加上lmg肝素，在42°C下，并且进行杂交过夜。高 度严格洗涤条件的实例是〇. 15MNaCl，在72°C下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是 在65°C下0. 2xSSC洗涤15分钟（关于SSC缓冲液的描述参见Sambrook等）。高严格洗 涤的前面可以是用于去除背景探针信号的低严格洗涤。具有例如超过100个核苷酸的双链 分子子的中等严格洗涤的实例是lxSSC，45°C，15分钟。具有例如超过100个核苷酸的双 链分子的低严格洗涤的实例是4-6xSSC，40°C，15分钟。一般来说，与在特定杂交分析中关 于无关探针所观测相比2倍（或更高）的信噪比指示检测到特异性杂交。
[0044] 因为在病毒进入宿主细胞中时涉及一种或多种包膜蛋白，所以包膜蛋白的抗体可 中和病毒，即预防由病毒感染或再感染。在不希望坚持机械理论的情况下，对那些为细胞进 入所必需的包膜蛋白中的一种或多种引发抗体是用于获得中和抗体的一种方法。包含全病 毒、典型地灭活病毒的疫苗天然地呈现包膜蛋白以免疫细胞。对于包含个别病毒蛋白的疫 苗，用于获得中和抗体反应的一种策略是在疫苗中包括一种或多种包膜蛋白或免疫原性蛋 白质片段或免疫原性肽或这些的某种组合。
[0045]HSV-2编码14或更多种包膜相关蛋白质，其中至少一些涉及细胞进入，包括但不 限于gB、gD、gH以及gL。gD似乎特异性结合于细胞上的HSV-2受体，而gB以及杂二聚物 gH/gL似乎介导膜融合。因此，这四种包膜糖蛋白是作为免疫原包括于疫苗中的优良选择， 因为对这些包膜糖蛋白所引发的抗体可包括中和抗体。或者或此外，参与病毒流出的包膜 糖蛋白也是作为免疫原以包括于疫苗中的候选者。
[0046] 大部分不同于包膜蛋白的HSV-2的结构蛋白可见于衣壳和被膜中。被膜占据衣壳 与包膜之间的空隙。发现在被膜中存在约20种病毒蛋白。被膜蛋白对于多种病毒功能来 说是重要的，包括免疫调节、病毒组装以及最终释放。衣壳蛋白形成包围病毒体的核酸基因 组的结构。VP5(UL19的产物）是主要衣壳蛋白。往往对结构蛋白和多种HSV蛋白引发细胞 反应（Hosken等，JVirol80:5509-55515, 2006)。一般来说，细胞反应涉及CD4 与CD8T细 胞两者，它们是在对抗HSV感染中起作用的细胞类型。
[0047]本文所公开的免疫原性药物组合物（例如疫苗）包含两种或更多种结构蛋白作为 免疫原，所述两种或更多种结构蛋白中的一种是包膜糖蛋白而其中另一种不同于包膜糖蛋 白。尽管可使用任一种结构蛋白，但可通过生产容易性、调配成药物组合物的能力、有关蛋 白质结构的信息以及高表达水平来指导选择。因为T细胞反应典型地是MHC限制性的，所 以疫苗一般含有对最多数目的MHC类型起反应的蛋白质或肽，并且它还可以含有多种蛋白 质或肽以增加将作出反应的个体的数目。
[0048] 免疫原性药物组合物优选地是无菌的、不含或基本上不含其它病毒污染物并且不 含或基本上不含诸如LPS等致热物质。所述组合物用作疫苗。
[0049]用于在疫苗中作为免疫原的包膜和非包膜结构蛋白典型地是全长的，但还可以是 前体蛋白、片段或融合蛋白的一部分。全长蛋白是指一种成熟蛋白；例如在包膜蛋白的情况 下，成熟蛋白是可见于包膜中的形式（例如缺少前导肽）。前体蛋白（前蛋白）是进行任何 加工之前的初期转化蛋白或部分加工蛋白。作为融合蛋白的一部分，HSV-2蛋白可呈现前 体或全长蛋白或蛋白质片段形式。蛋白质的片段应具免疫原性，含有一个或多个引发免疫 反应的表位。
[0050]在一些实施方案中，本文所公开的免疫原性药物组合物（例如疫苗）包含（i)HSV-2的a组基因产物或其免疫片段；和/或（ii)HSV-2的0 1组基因产物或其免疫片段； 和/或（iii)HSV-2的0 2组基因产物或其免疫片段；和/或（iv)HSV-2的y1组基因产物 或其免疫片段；和/或（v)HSV_2的Y2组基因产物或其免疫片段作为免疫原。a1、运2、 Yl以及Y2基因是本领域中熟知的。参见例如HerpesvirusesandTheirReplication, FUNDAMENTALVIROLOGY，第 29 章，1986。
[0051] 因此，本文中术语"免疫原"的任何使用均指全部群组的多肽，即：（a)全长抗原， (2)抗原的免疫原性片段，（3)全长抗原的免疫原性变体或免疫原性片段的变体，（4)其包 含不同多肽的部分的嵌合融合体，以及（5)其缀合物。在各种实施方案中，用于疫苗中的包 膜和非包膜结构蛋白包括包含能够诱导对蛋白质具特异性的免疫反应的其免疫原性片段 或其变体中的任一种的多肽。
[0052]举例来说，免疫原性变体在抗原的至少10个连续氨基酸上保持至少90%氨基酸 同一性，或在抗原的至少15个连续氨基酸上保持至少85%氨基酸同一性（例如包膜蛋白 或非包膜结构蛋白）。其它实例包括在抗原的至少50个连续氨基酸上或在抗原的至少 100 个连续氨基酸上至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %同一性。在一个实施方案中，免疫原性变体在特定抗原的全长上具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性。 在一些实施方案中，变体是天然存在的变体。
[0053] 作为另一个实例，免疫原性片段和其变体包含抗原的至少5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、48或50个连续氨基酸。免疫原性片段可包含许多 以上所提到数目之间的连续氨基酸，使得例如免疫原性片段在免疫原性多肽的约6-10、 10-15、15-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多个连续氨基 酸之间。
[0054] 选择往往称为肽的短片段以与MHC分子复合以便结合于T细胞受体并且通常长达 约30个氨基酸长，或长达约25个氨基酸长，或长达约20个氨基酸长，或长达约15个氨基酸 长，长达约12个氨基酸长，长达约9个氨基酸长，长达约8个氨基酸长。一般来说，较短的 肽与MHCI类分子结合或缔合而较长的肽与MHCII类分子结合或缔合。适合的肽可使用 许多生物信息学程序中的任一种来预测并且使用熟知方法来测试。在本文中也称为"肽"的 短片段典型地是15-100个氨基酸长；较长片段典型地是100个氨基酸到全长，不过肽（短 片段）和较长片段的长度范围不是固定的。
[0055] 如本文所公开，适合的蛋白质包括前体蛋白、成熟蛋白、片段、融合蛋白以及肽。在 组合物中，蛋白质可以相同形式或以这些形式的混合物形式存在。举例来说，包膜糖蛋白可 以呈现成熟蛋白形式并且结构蛋白呈片段形式，或者包膜糖蛋白可呈现片段形式并且结构 蛋白呈片段形式。对于糖蛋白的细胞产生，信号肽可以是前体蛋白的一部分。信号肽包括 糖蛋白D天然序列或本领域中已知的其它序列。还可能需要使用没有跨膜或胞内区或两者 的蛋白质。
[0056] 如本文所论述，选择包膜糖蛋白中含有一个或多个结合于中和抗体的表位的一个 或多个部分（也称为片段）。含有表位的部分可通过分析诸如中和抗体对细胞病毒感染的 抑制来鉴别。简言之，将HSV-2包膜糖蛋白的重叠部分与中和抗体（例如来自受感染动物 或人类的血清）混合，将混合物添加至HSV-2和受纳细胞系中。如果一个部分具有结合于 抗体的表位，那么细胞系将感染HSV-2。如果所述部分不具有表位，那么细胞系将不感染。
[0057] 包含免疫原性HSV-2多肽的至少一个免疫原性片段的组合物可用作免疫原。在一 些实施方案中，通过本文所描述的重组表达载体编码免疫原性片段。免疫原性片段可由免 疫原性多肽的至少6、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续氨基酸组成。免 疫原性片段可包含许多以上所提到数目之间的连续氨基酸，使得例如免疫原性片段在免疫 原性多肽的约 6-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多个连续氨基酸之间。免疫原性片段可包含充足数目的连续氨基酸从而形成线性表 位，和/或可包含充足数目的连续氨基酸从而允许片段以与衍生片段的全长多肽相同（或 充分类似）的三维构象折叠，以呈现非线性表位（本领域中也称为构象表位）。用于评估免 疫原性片段是否折叠成类似于全长多肽的构象的分析包括例如蛋白质与对天然或未折叠 表位具特异性的单克隆或多克隆抗体反应的能力、其它配体结合功能的保持以及多肽片段 经蛋白酶消化的敏感性或耐性（参见例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratory Manual，第 3 版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY(2001))。因此，举例来说，当 片段结合特异性结合于全长多肽的抗体的能力以及结合水平与全长多肽基本上相同（即 与示例性或野生型全长抗原的免疫原性相比结合水平已保持到统计学、临床和/或生物学 充足程度）时，多肽片段的三维构象充分类似于全长多肽。
[0058] 在诸如上文所描述的分析等分析中所筛检的片段通常是短的。一般来说，候选片 段的长度长达约40个氨基酸长，或长达约25个氨基酸长，或长达约20个氨基酸长，或长达 约15个氨基酸长，或长达约12个氨基酸长，或长达约9个氨基酸长，或长达约8个氨基酸 长。用于筛检的片段典型地是重叠的。举例来说，一组片段可包含20个氨基酸长片段，其 重叠16个氨基酸（即每4个氨基酸错开）。典型地，重叠组在未加工糖蛋白的N端开始，即 含有前导序列，并且在胞外域的C端氨基酸处结束。
[0059] 选择结合于中和抗体的片段并且可将其用于如本文所公开的药物组合物中。片段 可"按原样使用"或进一步工程改造或与其它片段组合。对于足够大并且复杂性足以具免疫 原性的片段，其可用于药物组合物。小于约1000MW的片段不大可能具免疫原性，不过复杂 性也可以在片段是否具免疫原性免疫原性中发挥作用。举例来说，由单一氨基酸重复单元 组成的均聚物不管其大小如何均是不良免疫原，然而2个或3个氨基酸的共聚物可以是良 好免疫原。谷氨酸和赖氨酸的共聚物需要是至少约30-40,000MW以具免疫原性。具有芳香 族侧链的氨基酸增加免疫原性，使得仅具有约4000MW的包含酪氨酸和苯基丙氨酸的片段 可以具免疫原性。过短或复杂性不足以具免疫原性的片段可缀合至载体蛋白，诸如KLH(钥 孔戚血蓝素）、卵白蛋白、牛血清白蛋白或其它对接受药物组合物的受试者来说外来的蛋白 质，或者所述片段可联接在一起以形成免疫原性蛋白。片段是否具免疫原性可在动物中测 定。举例来说，可以引发-加强方案向动物施用片段，并且在例如ELISA中使用在加强之后 7-10天抽取的血清来分析片段的抗体。可检测信号指示片段具免疫原性。更高信号是合乎 需要的。用于免疫原性的其它分析是普通技术人员熟知的。
[0060] 在一些实施方案中，用于组合物中的片段是合成长肽。"合成长肽"（SLP)是指离 体制造并且长度短至约25个氨基酸并且长至约100个氨基酸的蛋白质序列。SLP应足够长 以由树突状细胞吸收并加工以便与MHCI类或II类分子一起呈现于其细胞表面。SLP是衍 生自蛋白质的肽，需要针对所述蛋白质的免疫反应。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞 反应。蛋白质可以是已知抗原或在一些蛋白质的情况下其可以是候选抗原。
[0061]SLP包含至少一个⑶4表位或至少一个⑶8表位或至少一个⑶4和至少一个⑶8 表位。CD4表位是指结合于II类MHC的氨基酸序列，而CD8表位是指结合于I类MHC的氨 基酸序列。表位序列衍生自免疫原的氨基酸序列；在体内，简言之，免疫原由抗原加工细胞 (例如树突状细胞）吸收或合成并且降解成肽，其与MHC分子缔合并且以MHC-肽复合物形 式呈现于细胞表面上。与MHCI类分子复合的肽与T细胞抗原受体和⑶8+T细胞上的⑶8 相互作用，这些肽称为⑶8表位；与MHCII类分子复合的肽与T细胞抗原受体和⑶4+T细 胞上的⑶4相互作用，这些肽称为⑶4表位。激活的⑶8+T细胞变成细胞毒性T细胞，其识 别并且杀死展示MHCI类-CD8表位的靶细胞。往往，靶细胞是感染或肿瘤细胞。激活的 CD4+T细胞变成辅助性T细胞，并且取决于其亚型，帮助B细胞产生抗体或激活天然杀伤细 胞、吞噬细胞以及CD8+T细胞。CD4+T细胞与CD8+T细胞两者的激活有助于综合的细胞免疫 反应。
[0062] 如上文所公开，SLP应足够长以由树突状细胞吸收并加工并且与MHC分子一起呈 现于其细胞表面上。与MHCI类分子复合的肽的长度通常是8-11个氨基酸，而与MHCII 类分子复合的肽的长度通常是13-17个氨基酸，不过更长或更短的长度不罕见。因此，SLP 将典型地是至少25个氨基酸长并且长至100个氨基酸长（例如至少30aa、至少35aa、至 少40aa、至少45aa、至少50aa、至少55aa、至少60aa、至少65aa、至少70aa、至少75aa、至少 80aa、至少85aa、至少90aa、至少95aa)。SLP的长度通常将是长约45aa或约50aa。
[0063] 表位可具有已知序列或未知序列。过多的蛋白质已确定了CD4和CD8表位的位 置。对于包含这些表位中的一个或多个的SLP，长度将典型地是约45aa。此外，表位可在N 端并且在C端侧以约15aa形成侧翼。侧翼序列典型地是使表位序列在天然蛋白质中形成 侧翼的序列。如上文所论述，SLP可包含多于一个表位，多个表位可以全部是⑶4或⑶8表 位或是⑶4与⑶8表位的混合物。此外，表位可依次重叠（关于包含重叠表位的一些示例 性SLP参见实施例1)。所用SLP的总数目可使得所有已知CD4和CD8表位均得以表示。
[0064]SLP可通过多种方法中的任一种来合成（关于合成法的一般论述参见Corradin 等，SciTranslationalMed2:1,2010)。自动化肽合成器可商购获得，并且许多公司提 供合成服务（例如Abbiotec、AmericanPeptideCompany、AnaSpec、Bachem、Covance ResearchProducts、Invitrogen)。合成之后，典型地通过HPLC将肽纯化，不过诸如离子交 换色谱和凝胶过滤色谱等替代纯化方法可以使用。可接受的纯度是如通过分析型HPLC所 评估至少90 %或至少95 %或至少98 %。
[0065]当蛋白质尚未确定⑶4表位或⑶8表位或两者的位置时，可合成一组包含整个蛋 白质序列的SLP。各SLP将典型地是约50aa，并且连续SLP可以约25aa依次重叠。或者或 此外，可使用算法和计算机程序来预测将结合于MHCI类和II类分子的序列。所述程序是 可轻易获得的，例如RANKPEP(Reche等，HumanImmunol63:701，2002)、Epipredict(Jung 等，Biologicals29:179,2001)以及MHCPred(Guan等NuclAcidsRes31:3621,2003 以 及Guan等，ApplBioinformatics5:55, 2006)、EpiMatrix(EpiVax,Inc.)〇 [0066] 可按最佳生产的需要对SLP的序列进行调节。举例来说，位于衍生自天然序列的 肽的末端的一个或多个氨基酸可省略，以改善溶解度或稳定性，或增加或降低总体费用。作 为一个特定实例，具有高含量的疏水性氨基酸的肽序列可能难以溶解。作为指导，疏水性含 量理想地小于50%。含有半胱氨酸、甲硫氨酸或色氨酸残基；尤其多个Cys、Met或Trp残 基的肽可能难以合成。另一种氨基酸（标准或不标准氨基酸，诸如羟基脯氨酸、氨基丁 酸、正亮氨酸）的取代可改善合成效率或纯度。设计SLP时的其它考虑因素包括片形 成的程度、N端氨基酸（例如N端Gin可环化）、使邻近Ser和Pro残基减到最少。
[0067] 尤其适用于包括于药物组合物中的一些结构蛋白包括UL19(SEQIDN0.4)、UL19 上域片段（SEQIDNo.12)，UL25(SEQIDN0.5)以及UL47(SEQIDN0.6)。病毒蛋白的结 构可见于NCBI的MMDB(分子模型化数据库）中。分子结构信息是可获得的：UL25(MMDB ID: 37706,Bowman等J.Virol. 80:2309,2006,以全文并入）、VP5(UL19 的产物）（MMDB ID:26005,Bowman等，EMB0J. 22:757-765,2003,以全文并入）、VP13/14(UL47 的产物） (MMDBID:6022)以及包膜蛋白gD2(MMDBID:36244，Krummenacher等EMB0J24:4144-4153， 2005,以全文并入）、ICP34. 5以及许多其它HSV-2蛋白。此外，病毒蛋白的一些T细胞 表位是已知的（Koelle等，JVirol74:10930-10938,2000;Muller等，JGenVirol 90:1153-1163,2009;Koelle等，JImmunoll66:4049-4058,2001;BenMohamed等，JVirol 77:9463-9473,2003 ;美国专利号 6,855,317 ;P.C.T.公布号W0 2004/009021，所有的参考 文献以全文并入）。
[0068] 这些物质中的任一种的免疫原性片段、变体以及融合蛋白均是蛋白质，具体地说 涵盖尤其UL19、UL19上域片段、UL25以及UL47以用于本文的免疫原性组合物中。因此，本 公开包括SEQIDN0:4、5、6或12中的任一种的片段或变体，其在其至少10个连续氨基酸上 保留至少90%氨基酸同一性，或在其至少15个连续氨基酸上保留至少85%氨基酸同一性。 作为另一个实例，本公开包括包含所述序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、48或50个连续氨基酸或在所述序列的约6-10、10-15、15-20、20-30、 30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或更多个连续氨基酸之间的免疫原性片 段。本公开还包括在序列的至少50个连续氨基酸上或在序列的至少100个连续氨基酸上具 有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的变体。在一些实施方案中，变体是天然存在的变体，优选地是在严格条件下与编码 SEQIDNO:4、5、6或12中的任一种的多核苷酸杂交的变体。
[0069] 如本文所公开，非包膜结构蛋白（例如如SEQIDNo. 9和10中所阐述的UL19肽 以及如SEQIDN0. 11中所阐述的UL25肽）和包膜蛋白（例如gD2(SEQIDNo. 7和8)的 免疫原性片段（包括肽）可使用或可以是衍生自蛋白质的较长序列（即片段）的一部分。 如本文所用的肽是指氨基酸的短序列，通常至少15个残基并且通常至多约100个残基，或 约20个残基至约80个残基，或约30个残基至约70个残基。如本文所用的片段是指小于 全长蛋白的任何长度的多肽并且通常是至少100个氨基酸长，不过片段的尺寸范围可与肽 的尺寸范围重叠（例如约50个残基长的片段）。具体地说，UL19上域片段丢失了UL19的 第1-450位残基和第1055-1374位残基的至少75%、80%、85%、90%、95%或全部。因此， 上域片段可例如在第337-451位残基中的任一者处开始，并且在第1055-1294位残基中的 任一者处结束（并且至少缺乏SEQIDN0:4的第1-336位和第1295-1374位氨基酸）。举 例来说，UL19片段可以是约第451位残基至约1054(SEQIDN0:12)。UL19上域片段可包 含SEQID勵：12的约50、100、150、200、250、300、350、400、450 或 500 个氨基酸或更多。
[0070] 此外，本文中的肽和片段可融合至异源肽。异源肽的实例包括来自其它蛋白质的 序列（例如在UL19的情况下，UL19上域片段可融合至来自不是UL19的另一种蛋白质的序 列）或标签序列，诸如六组氨酸，其通常会位于N端或C端。因此，本文所描述的免疫原性 片段或变体可融合至增强免疫原性的另一种肽、充当标签或标记的另一种肽或来自另一种 HSV-2结构蛋白的另一种肽。因此，免疫原性多肽可包含由HSV-2结构蛋白的指定片段组成 的片段。在一个实例中，免疫原性多肽包含由SEQIDN0:12或SEQIDN0:12的片段组成 的UL19的片段，其任选地融合至非UL19肽。在另一个实例中，免疫原性多肽包含由在SEQ IDNO: 12的50个连续氨基酸上至少80%或90%同一的氨基酸序列组成的肽，其任选地融 合至非UL19肽。
[0071] 出人意料地，本文中的实例显示UL19上域片段具有引发保护性抗体HSV-2感染的 能力，从而使得UL19蛋白的其余部分不必作为免疫原。这个出人意料的发现是偶然的，因 为表达全长UL19的尝试已证明具挑战性。举例来说，全长UL19在大肠杆菌（E.coli)中和 其它表达系统表达以及可溶性全长UL19的后续纯化已证明是困难的。
[0072] 典型地，药物组合物中的蛋白质将不同于前体蛋白，因为在真核细胞中的表达将 典型地产生成熟蛋白，其缺少前导序列（也称为信号肽）。gD的前导序列涵盖约第1-25位 的残基。gB的前导序列涵盖约第1-22位的残基。糖蛋白D(SEQIDNo. 2)是393氨基酸蛋 白并且具有跨越约第26-340位残基的胞外区、跨越约第341-361位残基的跨膜区以及跨越 约第362-393位残基的胞质区，以及许多位于第119、146、287位残基处的N-键联糖基化位 点（UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q69467,条目中的型式49和序列中的型式1)。示例性 gD片段（本文中替代地称为gD2)包含显示于SEQIDNO. 3中的序列。
[0073] 在一些实施方案中，来自包膜糖蛋白的抗原片段和免疫原性片段可包含部分或全 部的前导序列，其有时称为信号肽。前导序列通常是约15-20个氨基酸，并且在正常细胞 代谢过程中，其可能由细胞设备裂解掉，然而，在完整病毒体中糖蛋白中的一些可具有前导 序列。前导序列通常在N端具有一些极性氨基酸并且内部氨基酸通常是疏水性的。如上文 所论述，已确定HSV-2包膜糖蛋白中的一些的前导序列。对于其它HSV-2包膜糖蛋白，可使 用计算机程序来预测信号肽。这些程序中的一些包括SIG_Pred(bmbpcu36.leeds.ac.uk/ prot_analysis/Signal.html) >PrediSi(www.predisi.de) >OCTOPUS(octopus,cbr.su.se) 以及sigcleave(emboss,sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/sigcleave.html) 〇
[0074] 多种技术可用于抑制在用于本文所描述的组合物中的含有前导序列的抗原片段 或免疫原性片段的细胞产生期间信号肽的裂解。举例来说，在裂解位点形成侧翼的一个或 多个氨基酸可改变成不同氨基酸，从而使得序列不被细胞设备识别或裂解。对于此方法，根 据本领域中已知的裂解位点设计变化：甘氨酸不优先用于所述位置中的任一种，酪氨酸很 少可见于在裂解位点之后的最前几个位置中，然而脯氨酸往往可见于除+1位置外的许多 裂解位点中，并且谷氨酰胺通常可见于+1残基处（Zhang和Henzel，ProteinSci. 13:219， 2004)。所提出的序列可用预测程序评估以确定是否有可能抑制裂解。如果裂解有可能，那 么作出其它改变并且对新提出的序列进行再评估。用于抑制信号肽裂解的其它技术包括在 识别序列和裂解序列处添加一个或多个氨基酸、N端添加信号肽以及识别序列以使得所添 加的信号肽优先裂解以及在缺少用于裂解信号肽的机制的宿主细胞中产生。
[0075] 在某些实施方案中，片段包含HSV-2糖蛋白，其包括前导序列。在其它实施方案 中，片段包含HSV-2糖蛋白的一部分，其包括前导序列到跨膜域的起点。在其它实施方案 中，片段包含HSV-2糖蛋白的一部分，其包括前导序列并且在胞外域内结束。在其它实施方 案中，片段包含HSV-2糖蛋白的非连续部分，其中所述部分中的一者包含位于前导序列中 的抗原表位。在其它实施方案中，片段包含HSV-2糖蛋白的非连续部分，其中所述部分包含 表位或者其包含来自不同HSV-2糖蛋白的部分，其中所述部分包含表位。
[0076] 糖蛋白B(SEQIDNO. 1)具有跨越约第23-771位残基的胞外区、跨越约第772-792 位残基的跨膜区以及跨越约第793-904位残基的胞质区，以及许多位于第82、136、393、 425、486、671位残基处的N-键联糖基化位点（UniProtKB/Swiss-Prot登录号P08666,条目 中的型式60和序列中的型式2)。糖蛋白K是一种在其N端具有30氨基酸前导序列的338 氨基酸蛋白（RamaswarmyandHolland，Virology186:579-587,1992)。糖蛋白C具有经 预测的第27位氨基酸前导序列，糖蛋白E具有经预测的第23位氨基酸前导序列，并且糖蛋 白L具有经预测的第16位氨基酸前导序列（SignalPeptideResource，proline.bic.nus. edu.sg，2011 年 10 月 06 日录入）。
[0077] 蛋白质或蛋白质片段优选地是免疫原性的。"免疫原"能够诱导免疫反应。在至少 一些血清阳性受试者中，免疫原性肽序列通常由T细胞（例如⑶4或⑶8T细胞）识别。肽 序列可通过通常使用一系列重叠肽来筛检衍生自完整序列的肽来识别。多种分析可用于确 定T细胞是否识别并且对应于一种肽。举例来说，铬释放细胞毒性分析（Kim等，JImmunol181:6604-6615,2008,其分析方案并入本文中）、ELISP0T分析（一种细胞内细胞因子染 色分析）以及MHC多聚体染色（Novak等JClinInvest104:R63_R67,1999;Altman等， Science274:94-96,1996)是适合的分析之中的。在一些情况下，片段包含免疫优势肽序 列。已针对HSV-2糖蛋白和结构蛋白识别了一些免疫优势表位（例如Kim等JImmunol 181:6604-6615,2008;Chentoufi等，JVirol. 82:11792-11802,2008;Koelle等，ProcNatl AcadSciUSA100:12899-12904,2003;所有参考文献均以全文形式并入本文中）。免 疫原性肽还可以通过生物信息学软件来预测（Flower,MethodsinMolecularBiology 第409卷，2007)。一些不例性程序和数据库包括FRED(Feldhahn等Bioinformatics 15:2758-9,2009)、SVMHC(D6nnes和Kohlbacher，NucleicAcidsRes34:W1940197， 2006)、AntigenDB(Ansari等，NucleicAcidsRes38:D847-853,2010)、TEPITOPE(Bianand HammerMethods34:468-475,2004)。
[0078]可并入HSV-2蛋白中的任一种（包括前体蛋白、成熟蛋白以及片段，包括肽）作为 融合蛋白的一部分。融合伴侣可以是HSV-2蛋白或非HSV-2蛋白序列中的任一种。一些常 见的使用融合蛋白的原因是为改善所得蛋白质的表达或帮助其纯化。举例来说，可将适合 于表达系统的宿主细胞的信号肽序列连接至HSV-2蛋白或可连接用于蛋白质纯化的标签 序列，并且随后如果还并入了裂解序列，那么进行裂解。可融合来自蛋白质中的一种或多种 的多个肽表位，或者可融合来自蛋白质中的一种或多种的片段。举例来说，可连接结构蛋白 或结构蛋白的片段，诸如融合蛋白VP13/14(UL47)和主要衣壳蛋白（UL19)或UL25和UL47 或UL25以及UL19。融合蛋白的片段可以呈任何顺序（这是对于UL19和UL47的融合体来 说），任一种蛋白质均可位于N端。类似地，多个肽表位可以呈任何顺序。
[0079]HSV-2蛋白（包括前体蛋白、片段以及融合蛋白）的制造通常是通过在培养细胞中 表达或通过化学合成来实现。（"HSV-2蛋白"在本文中用于包括所有这些形式。）短片段通 常是使用机械加工（许多是可商购获得的）或人工地化学合成的。如果通过细胞来产生，那 么多种适合的表达系统（原核与真核系统两者）是熟知的并且可以使用。常常使用并且适 合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物。表达载体和宿主细 胞是可商购获得的（例如InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA，USA)或可构建的。示例性载体 包含启动子和编码所关注的蛋白质的序列的克隆位点，使得启动子和序列可操作地连接。 可存在其它元件，诸如分泌信号序列（有时称为前导序列）、标签序列（例如hexa-His)、转 录终止信号、复制起点（尤其如果载体是染色体外复制）以及编码可选产物的序列。用于 转染宿主细胞的方法和程序也是熟知的。
[0080] 收集所表达的蛋白质并且"按原样"使用或更典型地进行分析以及进一步纯化。用 于测定纯度或量的典型程序包括凝胶电泳、西方墨点法、质谱法以及ELISA。蛋白质的活性 通常是在诸如实施例中所描述的生物分析中进行评估。必要或需要时，可将蛋白质进一步 纯化。许多纯化方法是熟知的并且包括尺寸色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、亲和色谱 法、沉淀以及免疫沉淀。蛋白质的预期用途典型地将决定纯化程度，其中用于人类中可能需 要最高水平的纯度。
[0081] B.激活先天免疫的试剂
[0082]先天免疫系统包含以非特异性方式针对由其它有机体引起的感染提供防御的细 胞。先天免疫是即刻防御，但其针对将来的激发不持久或具保护性。在先天免疫中通常发 挥作用的免疫系统细胞是吞噬细胞，诸如巨噬细胞和树突状细胞。先天免疫系统以多种方 式与适应性（也称为后天）免疫系统相互作用。先天免疫系统的细胞可参与抗原呈现于适 应性免疫系统的细胞，包括表达激活其它细胞的淋巴因子、放出吸引可对侵入物具特异性 的细胞的趋化性分子以及分泌补充和激活适应性免疫系统的细胞的细胞因子。本文所公开 的免疫原性药物组合物包括激活先天免疫的试剂，以提高组合物的有效性。
[0083] 许多类型的试剂均可激活先天免疫。像细菌和病毒等有机体可激活先天免疫，正 如有机体的组分、诸如2'-5'寡腺苷酸（2' -5'oligoA)等化学品、细菌内毒素、RNA双链、 单链RNA以及其它分子。许多试剂通过Toll样受体（TLR)分子家族起作用。使TLR参与 还会引起细胞因子和趋化因子的产生并且使得与后天免疫的发展有关的组分树突状细胞 激活和成熟。TLR家族可对多种试剂作出反应，所述多种试剂包括脂蛋白、肽葡聚糖、鞭毛 蛋白、咪唑喹啉、CpGDNA、脂多糖以及双链RNA(Akira等BiochemicalSocTransactions 31:637-642,2003)。这些类型的试剂有时称为病原体（或微生物）相关分子模式。
[0084] 在一个方面中，一种或多种佐剂包括于组合物中，以提供激活先天免疫的试剂。佐 剂是并入抗原或与抗原同时施用并且增加免疫反应的物质。已提出多种机制来解释不同佐 剂如何工作（例如抗原药性持久剂；树突状细胞、巨噬细胞激活剂）。在不希望受理论限制 的情况下，一种机制涉及激活先天免疫系统，从而引起趋化因子和细胞因子的产生，这进而 又激活适应性（后天）免疫反应。具体地说，一些佐剂通过TLR激活树突状细胞。因此，佐 剂是一种类型的激活先天免疫系统的试剂，其可用于针对HSV-2的疫苗中。佐剂也可以其 它方式发挥作用以增强后天免疫反应。优选地，佐剂是TLR4激动剂。
[0085] 一种可用于本文所描述的组合物中的佐剂是一元酸脂质A(MALA)型分子。示例性 MALA是如例如UlrichJ.T?和Myers，K.R.，"MonophosphorylLipidAasanAdjuvant，' 第 21 章，VaccineDesign,theSubunitandAdjuvantApproach,Powell,M.F?和Newman, M.J.编著PlenumPress，NY1995中所描述的MPL?佐剂。另一种示例性MALA由化学式 ⑴描述：

【权利要求】
1. 一种HSV-2多肽的免疫原性片段，其选自： (a) UL19多肽的免疫原性片段，其缺乏SEQ ID NO: 4的第1-450位氨基酸中的至少75% 并且缺乏SEQ ID NO:4的第1055-1374位氨基酸中的至少75% ; (b) SEQ ID N0:12中所示的序列； (c) (a)或（b)的免疫原性变体，其在至少15个连续氨基酸上保持至少85%氨基酸同 一I"生； (d) (a)或（b)的免疫原性片段；以及 (e) (a)、（b)、（c)或⑷的嵌合融合体。
2. -种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1所述的多肽。
3. -种免疫原性药物组合物，其包含： (i) HSV-2多肽的免疫原性片段，其选自： (a) UL19多肽的免疫原性片段，其缺乏SEQ ID NO: 4的第1-450位氨基酸中的至少75% 并且缺乏SEQ ID NO:4的第1055-1374位氨基酸中的至少75% ; (b) SEQ ID N0:12中所示的序列； (c) (a)或（b)的免疫原性变体，其在至少15个连续氨基酸上保持至少85%氨基酸同 一I"生； (d) (a)或（b)的免疫原性片段；以及 (e) (a)、（b)或（c)的嵌合融合体； (ii) 任选地，激活先天免疫的试剂；以及 (iii) 药学上可接受的载体。
4. 如权利要求3所述的组合物，其进一步包含UL25或其免疫原性片段。
5. 如权利要求3和4中任一项所述的组合物，其进一步包含gD2或其免疫原性片段。
6. 如权利要求3-5中任一项所述的组合物，其中所述试剂是佐剂。
7. 如权利要求6所述的组合物，其中所述佐剂是GLA。
8. 如权利要求7所述的组合物，其中所述GLA呈水包油乳液形式或呈水溶液形式。
9. 如权利要求8所述的组合物，其中所述水包油乳液包含角鲨烯。
10. -种用于治疗受试者的HSV-2感染的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求 3-9中任一项所述的组合物。
11. 一种在受试者中产生免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求3-9 中任一项所述的组合物。
12. -种使受试者针对HSV-2免疫的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求3-9中 任一项所述的组合物。
13. 如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中施用途径是真皮内、经粘膜、肌肉内、 皮下、舌下、直肠或阴道。
14. 如权利要求9-13中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用如权利要 求3-9中任一项所述的第二、第三或第四组合物。
【文档编号】G01N33/569GK104412108SQ201380036258
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2012年5月16日
【发明者】小托马士·W.·杜宾斯基, 南西·A.·胡思肯, 史考特·H.·罗宾斯, 玛格莉特·D.·莫瑞 申请人:免疫设计公司