癌的检测方法
【专利摘要】本发明提供:癌的检测方法,包括在生物体样品中测定具有与下述抗体通过抗原抗体反应而结合的反应性的多肽的表达,所述抗体是针对具有序列表的序列号2~30的偶数的序列号所示的任一氨基酸序列的CAPRIN-1的抗体;为了确定以CAPRIN-1为靶的治疗药对癌患者的施与,而确定癌患者样品中的CAPRIN-1的存在及其量;以及包含抗CAPRIN-1抗体的癌诊断药、试剂盒。
【专利说明】癌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及以CAPRIN-I作为肿瘤标志物的癌的检测方法。
【背景技术】
[0002] 癌是占所有死亡原因的第一位的疾病,现行的治疗是以手术疗法为主、组合使用 放疗法和化疗法的治疗。由于迄今为止医疗技术的进步,根据癌种类,有些已经成为如果能 早期发现,则治愈的可能性高的疾患。因此,要求对癌患者没有体力的、经济的负担、能够简 便地检查的癌的检测方法。
[0003] 最近,测定肿瘤标志物等肿瘤产物的方法普及开来。肿瘤产物,是指与肿瘤相关 的抗原、酶、特定蛋白质、代谢产物、肿瘤基因、肿瘤基因产物和肿瘤抑制基因等,癌胚抗原 CEA、糖蛋白质CA19-9、前列腺特异性抗原PSA、作为甲状腺产生的肽激素的降钙素等在一 部分癌中作为肿瘤标志物而被灵活应用于癌诊断。但是,对于大多数癌种不存在对癌诊断 有用的肿瘤标志物。另外,现在已知的肿瘤标志物大部分在体液中仅以极微量(pg/mL数量 级程度)存在,为了检测它们,需要高灵敏度的测定法和/或特殊的技术。在这样的现状下, 如果可以提供能够以简便的操作高灵敏度地检测各种癌的新的癌检查手段,则可以期待开 发针对各种癌的诊断用途。
[0004] 另一方面,近年虽然开发了新的手术法、发现了新的抗癌剂,但除了一部分癌之 夕卜,对于大多癌并未确立有效的癌诊断技术。所以现状是不能早期发现癌,癌的治疗成绩并 没怎么提尚。
[0005] 近年来,由于分子生物学、癌免疫学的进步,对于与癌特异性地反应的抗体、针对 与癌化和/或癌的恶化相关的癌抗原的分子靶向药等以癌抗原类为靶的特异性癌治疗法 的期待提高。其中,多种以癌细胞上的抗原蛋白质为靶的、用于治疗癌的抗体药物上市,被 用于癌治疗。抗体药物作为癌特异性治疗药得到了一定的药效,因而受到人们的瞩目,但成 为靶的抗原蛋白质大部分在正常细胞中也表达,抗体施与的结果,不仅是癌细胞,表达抗原 的正常细胞也被毒害,其结果所产生的副作用成为问题。另外,由于根据癌患者不同而病因 不同,因而癌治疗的效果个体差异极大。例如,在手术、化疗法或者放疗法中,根据癌的进行 阶段而其治疗和预后受到较大影响。已知由于个体的多样性,每个人对相同癌治疗药有不 同的感受性,对某一患者有效的药未必对其他患者也有效。
[0006] 因此,预先测定患者的疾患相关基因和/或蛋白质的表达,评价某一特定药物对 表达特定的基因或蛋白质的癌患者是否有效,然后确定对该癌患者的治疗药的施与。具体 地,使用测定针对某种癌的疾患相关基因和/或蛋白质的检测法,在临床现场检查源自癌 患者的样品、例如血清和/或组织中是否存在癌抗原,然后确定癌抗原特异性治疗药的施 与。例如,通过免疫组织化学染色EGFR检测法"EGFRpharm(DAKO社)"来评价大肠癌患者 的癌组织,预测大肠癌中ERBITAX的有效性,然后确定ERBITAX的施与。另外,通过免疫组 织化学染色Her2检测法"Here印Test"来评价乳癌患者的癌组织,预测乳癌中赫赛汀的有 效性,确定赫赛汀的应用。
[0007] 此外,伴侣动物多作为家庭的一员而被饲育,与饲主具有同样的生活习惯。因此, 据说根据伴侣动物罹患癌,可以预测饲主将来癌发病的危险性高。
[0008] 已知作为代表性的伴侣动物的狗衰老比人早7倍。现在,据说狗的饲育数在日本 约为670万只,另外在美国约为1764万只。除了狂犬病预防接种之外,5种、7种、8种等的混 合疫苗一般普及,犬细小病毒感染症、犬瘟热病毒感染症、犬副流感(传染性支气管炎)、犬 2型腺病毒感染症(传染性支气管炎)、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染症、钩体病这样的致 死率高的感染症减少。因此,狗的平均寿命延长,7岁以上的高龄犬占总饲育数的35. 5%。 死亡原因也与人同样地,因癌、高血压、心脏病等的死亡增加。在美国,1年约400万只狗被 诊断为癌,据说在日本也潜在地约160万只患有某些肿瘤。但是,伴侣动物并没有像人那 样普及健康诊断,因而大多发现晚,肿瘤变大饲主才注意到,才来医院。在该变大的肿瘤为 恶性的情况下,即使进行手术等外科疗法和/或给药抗癌剂等,基本上也已经晚了。因此, 在兽医判断为恶性的情况下,一般不手术而进行抗癌剂治疗。即使在进行手术的情况下,也 必须严格实施确保切缘的大小以及手术中的血液、细胞飞散对策这样的手术中的对策。期 望手术后立即开始抗癌剂治疗,经过观察也以短的间隔进行。因此,对于患癌的伴侣动物, 给药癌治疗药也是必须的,如果存在测定针对某种癌的疾患相关基因和/或蛋白质的检测 法,则可以进行比迄今为止更有效的治疗,无论对于饲主来说还是对于兽医来说好处都大。
[0009] 细胞质增殖相关蛋白 I (Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1,CAPRIN-1)是已知在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达,并在细胞内 与RNA形成细胞内应激颗粒而参与mRNA的运输、翻译的控制等的细胞内蛋白质。另一方 面,本
【发明者】们弄清楚了 CAPRIN-I在乳癌细胞的膜表面高表达,针对CAPRIN-I的抗体对 乳癌细胞发挥强的抗肿瘤效果(专利文献1)。另外,报告了通过使用与在细胞表面表达的 CAPRIN-I结合的抗体,测定源自患者的样品中的CAPRIN-I的表达,可以进行癌的检测以及 评价癌的恶性度(专利文献2)。即,记载了作为细胞膜蛋白质之一的CAPRIN-I可以成为癌 治疗等的靶。另一方面,如上所述,为了根据癌患者的多样性而确定以CAPRIN-I为靶的治 疗药、例如抗体的施与,需要预先验证源自癌患者的样品中的CAPRIN-I的表达。但是,并没 有关于用于这样应用特异性治疗药的CAPRIN-I的检测方法的报告,另外不存在使用癌患 者样品的检测癌的试剂。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献 I :TO2010/016526
[0013] 专利文献 2 :W02010/016527
【发明内容】
[0014] 发明要解决的课题
[0015] 本发明的目的是提供对癌的诊断有用的癌的检测手段。另外,还提供为了确定以 针对癌患者的CAPRIN-I为靶的治疗药的施与,而检测患者样品中的CAPRIN-I,确定其表达 量的癌的检测方法、癌诊断药和试剂盒。
[0016] 用于解决课题的方法
[0017] 本
【发明者】们进行了深入研宄,结果通过使用了源自狗精巢的cDNA文库和荷癌犬 的血清的SEREX法,获得了编码在源自荷癌生物体的血清中存在的抗体所结合的蛋白质 的cDNA。以该cDNA为基础,制作了具有序列号6、8、10、12和14所示的氨基酸序列的狗 CAPRIN-1。另外,以获得的基因的人同源性基因为基础,制作了具有序列号2和4所示的氨 基酸序列的人CAPRIN-1。然后发现,编码CAPRIN-I的基因分别在狗和人的精巢以及恶性 癌细胞中特异性地表达(参照后述的实施例1),以基于CAPRIN-I的氨基酸序列制作的重 组多肽作为抗原而制作的单克隆抗体与各种癌组织中的CAPRIN-I结合,以及能够毒害其 表面具有CAPRIN-I的癌细胞,其结果获得了 CAPRIN-I成为癌治疗靶这样的见解。进而发 现,利用上述的单克隆抗体,可以从源自癌患者的样品中特异性地检测CAPRIN-1。即,本发 明提供对生物体样品进行的癌的检测方法,包括测定CAPRIN-I的表达。另外,确立了通过 使用上述单克隆抗体的免疫分析法、即利用源自癌患者的血清的ELISA法和利用癌组织的 免疫组织化学染色法,来检测源自癌患者的样品中的CAPRIN-1,评价其表达量的方法。另外 发现,对应用该方法来评价源自癌的样品、其结果表达CAPRIN-1、且其量高的患者,能够应 用以CAPRIN-I为靶的治疗药,从而完成了本申请发明。
[0018] 本发明提供癌的检测方法,是对生物体样品进行的方法,检测该样品中的 CAPRIN-1,测定其表达量。另外,提供诊断方法,通过在对癌患者施与针对CAPRIN-I的治疗 药之前,测定组织中的CAPRIN-I的表达量来预测以CAPRIN-I为靶的治疗药、例如抗体等能 否应用于该癌患者,预测其有效性,从而弄清楚针对CAPRIN-I的治疗药的应用性。进而,本 发明提供包含与CAPRIN-I进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段的癌诊断药或试剂 盒。
[0019] 具体地,本发明具有以下特征。
[0020] (1)癌的检测方法,包括:使用与具有序列号63所示的氨基酸序列的多肽具有免 疫反应性的抗体,通过抗原抗体反应,来测定生物体样品中的CAPRIN-I的表达量。
[0021] (2)根据上述(1)所述的癌的检测方法,要测定的所述CAPRIN-I是
[0022] (a)具有序列表的序列号2?30中偶数的序列号所示的任一氨基酸序列的多肽, 或者
[0023] (b)与该CAPRIN-I具有85%以上的序列同一性的多肽。
[0024] (3)根据上述⑴或⑵所述的癌的检测方法,所述生物体样品源自人、狗或猫。
[0025] (4)根据上述⑴?⑶的任一项所述的癌的检测方法,所述生物体样品源自狗, 要测定的所述CAPRIN-I具有序列号6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
[0026] (5)根据上述⑴?⑶的任一项所述的癌的检测方法,所述生物体样品源自人, 要测定的所述CAPRIN-I具有序列号2或4所示的氨基酸序列。
[0027] (6)根据上述⑴?(5)的任一项所述的癌的检测方法,在测定出的CAPRIN-I表 达量与健常个体相比有意义地高的情况下,显示成为作为癌治疗药的所述抗体的靶的癌存 在。
[0028] (7)根据上述⑴?(6)的任一项所述的癌的检测方法,所述CAPRIN-I的表达量 的测定利用免疫分析法。
[0029] (8)根据上述(7)所述的癌的检测方法,所述免疫分析法是ELISA和/或免疫组织 化学染色法。
[0030] (9)根据上述⑴?⑶的任一项所述的癌的检测方法,所述生物体样品是体液、 组织或细胞。
[0031] (10)根据上述⑴?(9)的任一项所述的癌的检测方法,所述癌是选自乳癌、脑 瘤、食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、脾癌、胰癌、大肠癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫癌、 前列腺癌、膀胱癌、精巢癌、骨肉瘤和纤维肉瘤中的至少1种癌。
[0032] (11)根据上述⑴?(10)的任一项所述的癌的检测方法,所述抗体或其抗原结合 片段是具有包含序列号70所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列号71所示的氨基酸 序列的轻链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段。
[0033] (12)癌诊断药或试剂盒,其特征在于,包含与具有序列号63所示的氨基酸序列的 多肽具有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段。
[0034] (13)根据上述(12)所述的癌诊断药或试剂盒,所述抗体或其抗原结合片段是具 有包含序列号70所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列号71所示的氨基酸序列的轻 链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段。
[0035] (14)区别个体的癌治疗药的选择方法,使用与具有序列号63所示的氨基酸序列 的多肽具有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段来测定生物体样品中的CAPRIN-I的表达 量,在该表达量与健常个体相比在统计学上有意义地高的情况下,确定选择CAPRIN-I靶向 药作为适合对该生物体样品所源自的个体进行施与的癌治疗药。
[0036] (15)根据上述(14)所述的区别个体的癌治疗药的选择方法,其特征在于,所述 CAPRIN-I靶向药是与CAPRIN-I具有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段。
[0037] 本说明书包含作为本申请的优先权主张的基础的日本专利申请2012-160751号 的说明书和/或附图所记载的内容。
[0038] 发明的效果
[0039] 通过本发明,提供能够测定从癌患者分离的样品中的CAPRIN-I的表达量的新 的癌的检测方法。如后述的实施例中具体显示的那样,以基于CAPRIN-I(或者也称为 Caprin-I)的氨基酸序列制作的重组多肽作为抗原而制作的抗体,与癌患者的血清和/或 组织中的CAPRIN-I特异性地反应。另外,如下述实施例所记载的那样,由于在各种癌组织 中CAPRIN-I自身特异性地高表达,因而能够通过检测从癌患者分离的样品中的CAPRIN-1, 测定其表达量,来进行癌的检测。另外,通过预先判断对以CAPRIN-I为靶的治疗药、例如抗 体药物是否有感受性,可以筛选能够应用本治疗剂的患者。即,通过将本发明应用于癌患 者,预先检测CAPRIN-1,测定其表达量,能够提供使用抗CAPRIN-I抗体的更有效的治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1是显示编码CAPRIN-I的基因在正常组织和肿瘤细胞株中的表达图谱的图。参 照号1显示编码CAPRIN-I蛋白的基因的表达图谱,参照号2显示GAPDH基因的表达图谱。 最上栏的面板显示对于狗正常组织的结果,中栏左侧的面板显示对于狗乳癌组织的结果, 中栏右侧的面板显示对于人乳癌细胞株的结果,最下栏的面板显示对于各种人癌细胞株的 结果。
【具体实施方式】
[0041] 在本发明的癌的检测方法中,检测生物体样品中的CAPRIN-I,测定其表达量。作为 测定癌患者样品中的CAPRIN-I的表达量的方法,例如,可以通过使用抗CAPRIN-I抗体的免 疫分析法来分析。这样的方法大多在该【技术领域】公知,例如,能够应用免疫组织化学分析、 蛋白质印迹分析、免疫沉降、分子结合分析、ELISA、生物化学的酶活性分析等、使用抗体的 免疫分析法。此外,本说明书中的"表达量"包含细胞内的蛋白质的蓄积量和存在量。
[0042] 样品中的CAPRIN-I的表达可以通过分类成实施例中所示的得分值来区分。该得 分值越高,则显示癌患者的癌组织和/或癌血清包含越多的成为测定对象的CAPRIN-1。此 夕卜,本发明中,"测定"这样的术语包含检测、定性、定量和半定量的任一者。
[0043] 序列号6、8、10、12或14所示的氨基酸序列是狗的CAPRIN-I的氨基酸序列。具有 该氨基酸序列的狗CAPRIN-1,是通过使用源自狗精巢的cDNA文库和源自荷癌犬的血清的 SEREX法,作为与在源自荷癌犬的血清中特异性地存在的抗体结合的多肽而鉴定出的(参 照实施例1)。通过上述的方法测定作为狗的组织中的抗原的序列号6、8、10、12或14的 CAPRIN-I自身,能够诊断患者对以CAPRIN-I为靶的治疗药有无感受性的有无(参照实施 例)。此外,本说明书中使用的"具有氨基酸序列",是氨基酸残基以这样的顺序排成序列这 样的含义。因此,例如,"具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽",是指序列号2所示的Met Pro Ser Ala…(中略)一Gln Gln Val Asn的氨基酸序列以该顺序连接而成的、709个氨基 酸残基的大小的多肽。在本说明书中,有时将"具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽"简 记为"序列号2的多肽"。对于"具有碱基序列"这样的表达也是同样的。此时,"具有"这 样的术语可以用"包含"这样的表达替换。
[0044] 另外,本说明书中使用的"多肽"是指多个氨基酸通过肽键而形成的分子,不仅包 含构成的氨基酸数多的多肽分子,还包含氨基酸数少的低分子量的分子(寡肽)、全长蛋白 质。本发明中,具有序列号2?30中偶数的序列号所示的氨基酸序列的CAPRIN-I的全长 蛋白质也包含在多肽中。
[0045] 在本发明的方法中,除了序列号6、8、10、12或14所示的狗CAPRIN-I以外的其 他哺乳动物的CAPRIN-I也成为测定对象。在本说明书中,以下,有时将其他哺乳动物的 CAPRIN-I称为狗CAPRIN-I的"同源因子"(或"同源物")。另外,单提到"CAPRIN-1"的情况 下,不仅包含源自狗的CAPRIN-I,还包含源自其他哺乳动物的CAPRIN-I。作为在本发明的 方法中成为测定对象的其他哺乳动物的CAPRIN-1,可列举例如,人CAPRIN-1、猫CAPRIN-I 等,但不限于这些。如下述实施例所具体记载的那样,编码人CAPRIN-I的mRNA与序列号6、 8、10、12或14所示的狗CAPRIN-I同样地,在人的精巢和癌细胞中有意义地高表达,但在健 常人体内检测不到该抗人CAPRIN-I抗体。另外,抗猫CAPRIN-I抗体在健常猫体内检测不 到,仅在荷癌猫中检测到。因此,在测定除狗以外的哺乳动物中的CAPRIN-I的表达量的情 况下,也能够判定以CAPRIN-I为靶的治疗药是否适合该哺乳动物。
[0046] 此外,编码人CAPRIN-I的碱基序列及其氨基酸序列分别如序列表的序列号1和3、 以及2和4所示。人CAPRIN-I相对于狗CAPRIN-I的序列同一性为碱基序列94%、氨基酸 序列98%。因为即使像狗与人这样遗传上为远缘的哺乳动物之间,各自的CAPRIN-I的氨基 酸序列的序列同一性也达到非常高的98%,所以认为在除人以外的哺乳动物的CAPRIN-I 与狗CAPRIN-I之间也具有85 %左右以上的高序列同一性。即,对在本发明的方法中成为测 定对象的CAPRIN-I不特别限定,可以与序列号6、8、10、12或14所示的狗CAPRIN-I的氨基 酸序列具有优选85%以上、更优选95%以上的序列同一性。
[0047] 通常,蛋白质等这样的具有复杂结构的分子量大的抗原物质,分子上存在结构不 同的多个表位。因此,在生物体内,针对这样的抗原物质,产生分别识别结合多个表位的多 个种类的抗体。即,在生物体内针对蛋白质等的抗原物质而产生的抗体,是作为多个种类的 抗体的混合物的多克隆抗体。由本申请
【发明者】们发现的、在源自罹患癌的生物体的血清中 特异性地存在、且与重组CAPRIN-I通过抗原抗体反应而特异性地结合的抗体也还是多克 隆抗体。此外,本发明中提到"多克隆抗体"时,是指在源自体内包含抗原物质的生物体的 血清中存在、并且在该生物体内针对该抗原物质而诱导的抗体。
[0048] 作为用作抗原的肽的优选具体例,可列举序列号2?30中偶数的序列号的多肽或 其片段。
[0049] 此外,编码包含序列号2?30中偶数的序列号(S卩,序列号2,4,6......28,30)的 氨基酸序列的多肽的多核苷酸的碱基序列分别在序列号1?29中奇数的序列号(S卩,序列 号 1,3,5......27,29)中显示。
[0050] -般地,在蛋白质抗原中,即使在构成该蛋白质的氨基酸序列中替换、缺失、添加 或插入了少数的氨基酸残基的情况下,有时也具有与原蛋白质基本相同的抗原性,这是本 领域技术人员广泛知晓的。因此,具有在CAPRIN-I的氨基酸序列中替换、缺失和/或插入 了少数的(优选1个或数个)氨基酸残基的序列,与原序列具有80%以上、85%以上、优选 90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上的序列同一性,且与针对CAPRIN-I的多 克隆抗体通过抗原抗体反应而特异性地结合的多肽(以下,有时也方便地称为"特异反应 性修饰多肽"),也与包含上述序列号2?30中偶数的序列号的氨基酸序列的多肽同样地可 以在癌的检测中使用。优选的特异反应性修饰多肽具有在CAPRIN-I的氨基酸序列中替换、 缺失、添加和/或插入了 1个或数个的氨基酸残基的氨基酸序列。本说明书中的"数个"表 示2?10的整数、优选2?6的整数、进一步优选2?4的整数。
[0051] 本说明书中使用的氨基酸序列的"序列同一性",是以应比较的2个氨基酸序列的 氨基酸残基尽量多地一致的方式,将两个氨基酸序列对齐,将用一致的氨基酸残基数除以 总氨基酸残基数的结果用百分率表示而得的值。上述对齐时,根据需要在所比较的2个序 列的一方或双方插入适当间隙。这样的序列的对齐可以使用例如BLAST、FASTA、CLUSTAL W 等公知的程序来进行(Karlin 和 Altschul,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.,87 :2264_2268, 1993 ;Altschul 等,Nucleic Acids Res.,25 :3389_3402,1997)。
[0052] 此外,构成天然蛋白质的20种氨基酸,可以分组成如具有低极性侧链的中性氨基 酸(Gly,lie,Val,Leu,Ala,Met,Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn,Gln,Thr,Ser, 丁71',〇78)、酸性氨基酸(48口,6111)、碱基性氨基酸(4找,1^8,!^8)、芳香族氨基酸(?116,丁71·, Trp,His)那样具有类似的性质的组,已知如果是它们之间的替换、即保守性替换,则多肽的 性质大多不变化。因此,在替换CAPRIN-I的氨基酸残基时,通过在这些各组之间替换,能够 维持与对应抗体的结合性的可能性变高。但是,在本发明中,上述改变体只要具有与未改变 体同等或基本同等的免疫诱导活性,则也可以具有非保守性替换。
[0053] 本发明中使用的上述多肽可以按照例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc 法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成法进行合成(日本生化学会编、生化学实验讲座1、 夕>,夕質ω化学(蛋白质的化学)ιν、化学修饰卜''合成(化学修饰和肽合成)、 东京化学同人(日本)、1981年)。另外,也可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法进 行合成。或者,可以使用公知的基因工程学方法(Sambrook等,Molecular Cloning,第2 版,Current Protocols in Molecular Biology(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel 等,Short Protocols in Molecular Biology,第 3 版,A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons^) 容易地制备。例如,可以由从表达编码序列号2的人CAPRIN-I或其同源因子的基因的组织 提取出的RNA,通过RT-PCR来制备该基因的cDNA,将该cDNA的全长或所期望的一部分插 入表达载体中,再导入宿主细胞中,从而获得目的多肽。编码序列号6、8、10、12和14的狗 CAPRIN-I的cDNA的碱基序列分别示于序列号5、7、9、11和13,并且,编码作为其人同源因 子的序列号2和4的人CAPRIN-I的cDNA的碱基序列分别示于序列号1和3,因而RT-PCR 中使用的引物可以参照这些碱基序列容易地设计。另外,如后述那样,编码除人以外的哺乳 动物的CAPRIN-I的基因可以通过参照序列号5?29中奇数的序列号的碱基序列而设计的 引物来扩增,因此例如编码猫CAPRIN-I的cDNA也可以通过与上述同样的手法而容易地制 备。RNA的提取、RT-PCR、cDNA向载体的插入、载体向宿主细胞的导入例如可以如以下所记 载的那样,通过公知的方法来进行。另外,使用载体、宿主细胞也是公知的,有各种产品市 售。
[0054] 作为上述宿主细胞,只要是可表达上述多肽的细胞,就可以是任意的细胞,作为原 核细胞的例子可以列举大肠杆菌等,作为真核细胞的例子可以列举猴肾脏细胞C0S1、中国 仓鼠卵巢细胞CH0、人胎儿肾脏细胞株HEK293、小鼠胚胎皮肤细胞株NIH3T3等哺乳动物培 养细胞、芽殖酵母、裂殖酵母、蚕细胞、爪蟾卵细胞等。
[0055] 当使用原核细胞作为宿主细胞时,作为表达载体,使用具有能在原核细胞中复制 的起点、启动子、核糖体结合部位、多克隆位点、终止子、抗药性基因、营养缺陷型互补基因 等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体,可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表达系统、 PGEX表达系统等。如果将编码上述多肽的DNA插入到这样的表达载体中,用该载体转化原 核宿主细胞后,培养所得的转化体,则可以在原核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。 此时,也可以使该多肽作为与其他蛋白质的融合蛋白质来表达。此外,编码上述多肽的DNA 例如可以如上述那样通过RT-PCR来制备cDNA而获得,另外还可以如后述那样使用市售的 核酸合成仪通过常规方法来合成。此外,编码序列号2和4的CAPRIN-I的基因的cDNA的 碱基序列分别示于序列表的序列号1和3。
[0056] 当使用真核细胞作为宿主细胞时,作为表达载体,使用具有启动子、剪接区、多聚 (A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这样的表达载体,可以例示pKAl、pCDM8、 pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 载体、pRS、pcDNA3、pYES2 等。与上述同样地,如 果将编码本发明中使用的多肽的DNA插入到这样的表达载体中,用该载体转化真核宿主细 胞后,培养所得的转化体,则可以在真核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。当使用 pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl 等作为表达载体时,可以作为附加了 His 标签(例如(His) 6?(His) 1Q)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白 质而表达上述多肽。
[0057] 表达载体向宿主细胞的导入,可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚 糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等公知的方法。
[0058] 为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽,可以将公知的分离操作组合来进行。可列 举例如,利用了脲等的变性剂和/或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析和/或溶 剂分别沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析、疏 水层析、亲和层析、反相层析等。
[0059] 通过以上的方法获得的多肽中还包含处于与其他任意蛋白质的融合蛋白质的形 态的多肽。可例示例如,与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、His标签的融合蛋白质等。进而,在 转化细胞中表达的多肽有时在翻译后在细胞内受到各种修饰。这样的经翻译后修饰的多肽 只要具有与针对CAPRIN-I的多克隆抗体的结合性就可以使用。作为这样的翻译修饰,可以 例示N末端甲硫氨酸的脱离、N末端乙酰化、糖链添加、细胞内蛋白酶造成的限制性分解、肉 豆蔻酰化、异戊二烯化、磷酸化等。
[0060] 在本发明的方法中,测定生物体样品中可能含有的CAPRIN-I。如上所述,判断癌细 胞中作为抗原的CAPRIN-I的表达量有意义地高。显示通过测定癌细胞和/或癌组织中的 CAPRIN-I自身,对CAPRIN-I的表达量高的患者,能够应用以CAPRIN-I为靶的治疗药,这如 下述实施例中具体记载的那样。
[0061] 样品中的多肽的测定可以使用公知的免疫分析法容易地进行。具体地,例如,制作 与CAPRIN-I进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段,使用该抗体或其抗原结合片段 进行免疫测定,从而能够测定样品中可能存在的CAPRIN-1。另外,由于抗体有交叉反应性, 因而例如,使用与序列号6的狗CAPRIN-I进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段,不 仅能够测定序列号6的狗CAPRIN-1,还能够测定其他哺乳动物中的其同源因子、例如序列 号2或4的人CAPRIN-I或猫CAPRIN-I等。
[0062] 免疫测定方法自身如上所述是公知的常规方法。识别CAPRIN-的抗体,可以通过 利用本领域技术人员公知的方法的免疫组织化学,由外科手术期间从患者得到的组织、由 接种了自然或转染后表达CAPRIN-I的细胞系的异种移植组织的担持动物得到的组织等组 织,制作低聚甲醛或丙酮固定后的冷冻切片或低聚甲醛固定石蜡包埋的组织切片,使用上 述切片,关于与CAPRIN-I的反应性进行试验。
[0063] 进行免疫组织化学染色后,样品中的CAPRIN-I的表达量的定量化,可以通过估算 反映染色状态的得分值而进行数值化。得分值的设定优选为2阶段以上,在最优选的方式 下是4阶段的分类。例如,将在癌细胞的细胞表面表达的CAPRIN-I通过通常的免疫组织化 学染色法进行染色,将反映其染色状态的得分值分类成4阶段的情况,各得分如以下那样 设定。
[0064] ?得分0 (无 CAPRIN-I过表达):细胞膜无阳性染色,或者有细胞膜的阳性染色的 癌细胞小于10%。
[0065] ?得分1 (无 CAPRIN-I过表达):有基本不能识别的微弱的细胞膜的染色的癌细胞 为10%以上,癌细胞仅细胞膜被部分染色。
[0066] ?得分2 (有CAPRIN-I过表达):有弱?中程度的完全的细胞膜的阳性染色的癌细 胞为10%以上,或者有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为10%以上30%以下。
[0067] ?得分3 (有CAPRIN-I过表达):有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为30% 以上。
[0068] 这样的得分值的设定是在美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology)规定的,在日本国内由日本病理学会认定。另外,也在定量作为癌抗原之一的 Her2在患者样品中的存在量的"Here印Test"中应用,关于Her2的定量,在ASCO/CAP Her2 检查指南中规定。在日本国内也由卜7^7''病理部会制定了包含本得分的设定的Her2 检查指南。
[0069] 对于各得分值中记载的、免疫组织化学染色后的癌细胞被染色的比例,可以将光 学显微镜的灵敏度提高到4倍、10倍或20倍,将进入视野的细胞数出最低500,计测各得分 值所记载的细胞膜上显示染色像的细胞,利用以下式估算。
[0070] 阳性细胞数/总细胞数(约500左右)X 100
[0071] 为了免疫组织化学染色,可以使对CAPRIN-I有反应性的抗体通过各种方法染色。 例如,可以通过与辣根过氧化物酶复合山羊抗小鼠抗体、山羊抗鸡抗体反应而可视化。
[0072] 在对CAPRIN-I自身进行免疫测定时使用的、与CAPRIN-I进行抗原抗体反应的抗 体或其抗原结合片段,也可以作为癌诊断药或试剂盒提供。此时的癌诊断药或试剂盒也可 以仅由上述抗体或抗原结合片段组成,还可以包含对该抗体或抗原结合片段的稳定化等有 用的各种添加剂等。另外,该抗体或抗原结合片段也可以结合锰、铁等金属。如果将这样的 金属结合抗体或抗原结合片段施与体内,则因为该抗体或抗原结合片段在存在抗原蛋白质 的部位更多地富集,所以如果通过MRI等测定金属,则能够检测产生抗原蛋白质的癌细胞 的存在。
[0073] 此外,判明了 CAPRIN-I是在癌细胞的表面表达的细胞膜蛋白。由于癌患者的体 内包含大量的蛋白质分解酶,因而CAPRIN-I序列中的癌细胞的细胞外区域受到分解而从 癌细胞分离,所以比CAPRIN-I序列中的癌细胞的细胞内区域更多地在血液中存在。因此, 如果作为本测定中使用的抗CAPRIN-I抗体或其抗原结合片段,使用与CAPRIN-I的细胞外 区域更强地结合的抗CAPRIN-I抗体或其抗原结合片段,则不仅能够检测固定于载玻片的 癌组织,还能够检测癌患者的血清中存在的CAPRIN-I。另外,本方法是使用与CAPRIN-I的 细胞外区域结合的抗体的检测,因而能够正确地特定能够通过施与以CAPRIN-I为靶的治 疗药、特别是抗CAPRIN-I抗体药物而期待治疗效果的癌患者,从而能够提供更有效的癌治 疗。因此、在本发明中,优选使用与CAPRIN-I中的、癌细胞的细胞外区域结合的抗体。作为 包含这样的抗体所识别的表位的CAPRIN-I蛋白质的部分肽,可列举序列表的序列号2?30 中除了序列号6和序列号18之外的偶数号所示的氨基酸序列中相当于细胞外区域的肽。具 体地,可列举包含序列号2中50位?98位或233位?344位的区域内的连续7个以上的 氨基酸序列的肽,或包含序列号4?30中除了序列号6和序列号18之外的偶数号所示的 氨基酸序列中与上述氨基酸位置同源的区域内的连续7个以上的氨基酸序列的肽。更具体 地,可列举例如,序列号43或序列号61所示的氨基酸序列、优选序列号61所示的氨基酸序 列中的序列号62所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80%以上、优选85%以上、更 优选90%以上、进一步优选95%以上的序列同一性的氨基酸序列。本发明中使用的抗体包 含与这些肽结合的全部抗体。具体地,可列举与序列号63结合的抗体或其抗原结合片段、 具有序列号70和71的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的单克隆 抗体或其抗原结合片段。
[0074] 本说明书中中使用的"抗原结合片段"是指抗体分子中所含的Fab片段、F(ab')2 片段这样的具有与抗原的结合能力的抗体片段。抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆 抗体,为了进行免疫测定等,优选再现性高的单克隆抗体。以肽作为免疫原的多克隆抗体 和单克隆抗体的制备方法是公知的,可以通过常规方法容易地进行。例如,可以通过以使 CAPRIN-I与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、酪蛋白、血清白蛋白等载体蛋白质结合而得的融合蛋 白质作为免疫原,与佐剂一起免疫动物,从而诱导针对CAPRIN-I的抗体。可以使从免疫后 的动物采取的脾细胞、淋巴细胞这样的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤, 然后选择产生与CAPRIN-I结合的抗体的杂交瘤,使其增殖,从培养上清获得以CAPRIN-I作 为对应抗原的单克隆抗体。此外,上述方法是公知的常规方法。
[0075] 作为成为本发明的对象的癌,是过表达CAPRIN-I的癌,可列举乳癌、脑瘤、食道 癌、胃癌、肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、脾癌、胰癌、大肠癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫癌(子宫颈 癌和子宫体癌)、前列腺癌、膀胱癌、精巢癌、骨肉瘤。此外,还可列举头、颈的扁平上皮癌、 黑素瘤、各种腺癌、肝细胞癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌样牙龈肿、口腔内肿瘤、肛周腺癌、肛 囊肿瘤、肛囊顶泌腺癌、支持细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺 癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、支气管腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、 乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管周皮瘤、软骨肉瘤、软部组织肉瘤、组织球肉瘤、粘液肉 瘤、未分化肉瘤、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、淋巴瘤、慢性型淋 巴细胞性白血病、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小?中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿 瘤、颗粒膜细胞瘤、褐色细胞瘤等等,但不限于这些。
[0076] 另外,成为本发明的方法的对象的生物体样品源自哺乳动物,优选源自人、狗、猫。
[0077] 作为供于本发明的方法的样品,可列举体液、组织或细胞。本说明书中"体液"是指 液体状的生物体样品。可列举例如,血液(包含血清、血浆和间质液)、淋巴液、腹水、胸水、 脑脊液、痰、泪液、鼻涕、唾液、尿、阴道液、精液等。还可以包含使用生理盐水的腹腔洗涤液 等。优选血清、血浆、腹水、或胸水。
[0078] 在本发明的方法中,在测定的生物体样品中的CAPRIN-I表达量与健常个体相比 较高(优选统计学上有意义地高)的情况下,显示该生物体样品所源自的生物体(个体) 中存在在该测定中使用的抗CAPRIN-I抗体能够特异性地结合的癌(即,作为癌治疗药的 该抗体的靶)。利用这一点,可以对于源自癌患者的生物体样品,通过本发明的方法来测定 CAPRIN-I的表达量,通过将该表达量与健常个体比较,可以判定患者的癌是否是能够应用 针对CAPRIN-I的治疗药的(例如,成为作为癌治疗药的该抗体的靶的)癌。
[0079] 因此基于本发明,能够特定通过以以CAPRIN-I为靶的抗体为代表的治疗药的施 与而能够期待治疗效果的癌患者,能够提供更有效的癌治疗。
[0080] 在一实施方式中,本发明涉及区别个体的癌治疗药的选择方法,包括:使用对具有 序列号63所示的氨基酸序列的多肽有免疫反应性的抗体,测定生物体样品中的CAPRIN-I 的表达量,在该表达量与健常个体相比较高的情况(优选统计学上有意义地高的情况)下, 选择CAPRIN-I靶向药优选作为适合将对CAPRIN-I有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段 施与该生物体样品所源自的个体的CAPRIN-I靶向癌治疗药。通过区别个体的癌治疗药的 选择,可以实现应用对患者个人最适合的癌治疗法的所谓定制医疗。
[0081] 本说明书中所谓"统计学上有意义",是指将二者之间的量的差异进行统计学处理 时有显著性差异。具体地,可列举例如,危险率(显著性水平)小于5%、1%或0.1%的情 况。检验方法只要是能判断显著性的有无的公知的方法,就不特别限定。例如,可以使用学 生t检验法、多重比较检验法。
[0082] 实施例
[0083] 以下基于实施例更具体地说明本发明,但本发明的范围不受这些实施例例限制。
[0084] <实施例1各组织中的CAPRIN-I表达分析>
[0085] 按照W02010/016526的实施例1 (4)通过RT-PCR法来检查CAPRIN-I基因在狗和人 的正常组织、以及各种癌组织或癌细胞株中的表达。其结果示于图1。对于健常的狗组织,在 精巢中发现强表达,另外在狗乳癌中发现表达。进而,同时确认了在人组织中的表达,结果 与狗CAPRIN-I基因同样地,在正常组织中能确认表达的仅为精巢,但对于癌细胞,在人乳 癌细胞株 8 种(ZR75-l、MCF7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-157、BT-20、MDA-MB-231V、MRK-nu-l)、 以及脑瘤细胞株4种、源自白血病的细胞株3种、肺癌细胞株1种、食道癌细胞株2种等多 种癌细胞株中检测出表达。由该结果确认了,CAPRIN-I在除精巢以外的正常组织中看不到 表达,另一方面,在以乳癌细胞株为代表的多种癌细胞株中表达。
[0086] <实施例2 :抗CAPRIN-I抗体的制作>
[0087] (1)小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体的制作
[0088] 将W02010/016526的实施例3中制备的具有序列号2的氨基酸序列的人 CAPRIN-1100 μ g与等量的MPL+TDM佐剂(シクY社制)混合,将所得的混合物作为每1只 小鼠的抗原溶液。将所述抗原溶液施与至6周龄的Balb/cc小鼠(日本SLC社制)的腹腔 内后,每1周施与,再施与3次。将从最后的免疫起3天后摘出的脾脏夹在灭菌后的2片载 玻片中磨碎,将使用PBS (-)(日水社制)洗涤、然后以1500转/分钟离心10分钟并除去上 清的操作重复3次,从而得到脾脏细胞。将所得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 (从 ATCC购入)以10:1的比率混和,在其中加入将加温至37°C的包含10% FBS的RPMI1640培 养基200 μ L和PEG1500 ( <-卩 > 力'一社制)800 μ L混合而制备的PEG溶液,并静置5分 钟,从而进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟,除去上清,然后用加入了 2%当量的 芊7'' 3社制的HAT溶液的含15% FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)150mL悬浮细 胞,以96孔板(^ >夕社制)的每1孔各100 μ 1接种于15块板中。以7天、37°C、5% CO2 的条件培养,从而得到脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤。
[0089] 对于制作的杂交瘤,以由该杂交瘤所产生的抗体的对CAPRIN-I蛋白的结合亲和 性为指标进行筛选。将上述CAPRIN-I溶液1 μ g/mL在96孔板每1孔中添加100 μ L,在4°C 静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后,在每1孔中添加0. 5%牛血清白蛋白(BSA)溶 液(シ夕Y社制)400 μ L,在室温静置3小时。除去溶液,对每1孔用400 μ L的PBS-T洗涤 孔3次后,在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100 μ L,在室温静置2小时。用 PBS-T洗涤各孔3次后,在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG (H+L) 抗体(life technologies社制)100 μ L,在室温静置1小时。用I3BS-T洗涤孔3次后,在每 1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100 μ 1,并静置15?30分钟,从而进行显色反应。 显色后,在每1孔中添加IN硫酸100 μ 1使反应停止,使用吸光度计测定450nm和595nm的 吸光度值。其结果是,筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤作为目的杂交瘤的候 选株。
[0090] 将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0. 5个的方式添加到板中进行培养。1周后, 观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养,以由克隆化的杂 交瘤产生的抗体对CAPRIN-I蛋白的结合亲和性为指标,通过与上述同样的方法进行筛选, 获得多个产生对CAPRIN-I蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。将杂交瘤的培养上 清使用蛋白G担载体进行纯化,获得与CAPRIN-I结合的单克隆抗体150个
[0091] 接着从上述单克隆抗体筛选对表达CAPRIN-I的乳癌细胞的细胞表面显示反应 性的单克隆抗体。具体地,在1.5mL容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株 MDA-MB-231V,在其中添加上述各杂交瘤的培养上清lOOyL,在冰上静置1小时。用PBS 洗涤后,添加用含0. 1 %胎牛血清的PBS稀释至500倍的FITC标记山羊抗小鼠 IgG抗体 (Invitrogen社制),在冰上静置1小时。用PBS洗涤后,用< 夕卜4 7 ? > y >株式 会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面,对添加了培养基代替抗体的样品进行与上 述同样的操作,作为对照。其结果是,得到了 10个与对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的 细胞表面反应的单克隆抗体(#1?#10)。这些单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的各 个氨基酸序列示于序列号44?60。上述单克隆抗体#1包含序列号44的重链可变区和序 列号45的轻链可变区,#2包含序列号44的重链可变区和序列号46的轻链可变区,#3包含 序列号44的重链可变区和序列号47的轻链可变区,#4包含序列号44的重链可变区和序 列号48的轻链可变区,#5包含序列号49的重链可变区和序列号50的轻链可变区,#6包含 序列号51的重链可变区和序列号52的轻链可变区,#7包含序列号53的重链可变区和序 列号54的轻链可变区,#8包含序列号55的重链可变区和序列号56的轻链可变区,#9包含 序列号57的重链可变区和序列号58的轻链可变区,#10包含序列号59的重链可变区和序 列号60的轻链可变区。
[0092] (2)与癌细胞的细胞表面反应的小鼠抗人CAPRIN-I抗体所结合的CAPRIN-I中的 肽的鉴定
[0093] 使用上述获得的、与癌细胞的细胞表面反应的#1?#10的小鼠抗人CAPRIN-I单 克隆抗体,进行由这些抗体所识别的CAPRIN-I中的部分序列的鉴定。
[0094] 首先,在用PBS溶解至1 μ g/ μ L的浓度的重组CAPRIN-I溶液100 μ L中,添加 DTT (Fluka社制)至终浓度为10mM,在95 °C反应5分钟,进行CAPRIN-I内的二硫键的还 原,接着添加终浓度20mM的碘乙酰胺(和光纯药社制),在37°C、遮光条件下进行30分钟 硫醇基的烷基化反应。在所得的还原烷基化CAPRIN-140 μ g中添加 #1?#10的小鼠抗人 CAPRIN-I单克隆抗体各50 μ g,用20mM磷酸缓冲液(pH7. 0)定容至lmL,一边搅拌混合一边 在4°C反应一夜。
[0095] 接着,添加胰蛋白酶(7° 口 7力'社制)至终浓度0· 2 μ g,在37°C反应1小时、2小 时、4小时和12小时后,在预先用含1 % BSA (シ夕Y社制)的PBS封闭、用PBS洗涤后的蛋 白A-玻璃珠(GE社制)和ImM碳酸钙、NP-40缓冲液(20mM磷酸缓冲液(pH7. 4)、5mM EDTA、 150mM NaCl、l% NP-40)中混合,分别反应30分钟。
[0096] 将反应液用25mM碳酸铵缓冲液(pH8. 0)洗涤后,使用0. 1 %甲酸100 μ L使抗原 抗体复合体溶出,对于溶出液使用Q-TOF Premier (Waters-MicroMass社制)进行LC-MS分 析。分析按照仪器所附带的方案进行。
[0097] 其结果是,作为#1?#10的全部小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体所识别的 CAPRIN-I的部分氨基酸序列,鉴定了序列号61的多肽。进而,作为单克隆抗体#1?#4、 # 5?#7和#9所识别的上述序列号61的多肽中的部分序列,鉴定了序列号62的肽,进而判 定了单克隆抗体#10识别序列号63的肽。
[0098] (3)鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体的制作
[0099] 将W02010/016526的实施例3中制备的具有序列号2的氨基酸序列的人 CAPRIN-1300 μ g与等量的弗氏完全佐剂混合,将该混合物作为1只鸡的抗原溶液。将抗原 溶液施与7周龄的鸡的腹腔内,每4周施与,施与7次,完成免疫。从最后免疫起4天后分 别取出脾脏,然后将其在两片灭菌后的载玻片之间磨碎,将用PBS(-)(日水社制)洗涤并以 1500转/分钟离心10分钟除去上清液的操作重复3次,获得脾脏细胞。将获得的脾脏细 胞与使用鸟类网状内皮组织增殖病病毒通过转化法由鸡建立的缺少轻链的鸡骨髓瘤细胞 以5:1的比例混合,向其中添加通过使加热至37°C的含10% FBS的MDM培养基200 μ L与 PEG1500 ( <-卩 > 力'一社制)800 μ L混合而制备的PEG溶液,静置5分钟进行细胞融合。 以1700转/分钟离心5分钟,除去上清液后,将细胞用300mL添加了 2%当量的Gibco社 制的HAT溶液的含10% FBS的MDM培养基(HAT选择培养基)悬浮,并且以96孔板的每1 孔各100 μ L接种于30块板(^ >夕社制)中。在37°C、5% CO2的条件下培养7天,获得 由脾脏细胞与鸡骨髓瘤细胞的融合而成的杂交瘤。
[0100] 以由制备的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-I的结合亲和力作为指标来筛选杂交 瘤。在96孔板的每1孔中添加CAPRIN-I溶液(1 μ g/mL) 100 μ L,在4°C静置18小时。将 各孔用PBS-T洗涤3次后,在每1孔中添加0. 5 %牛血清白蛋白(BSA)溶液(シ夕Y社 制)400 μ L,在室温静置3小时。除去溶液,用每1孔400 μ L的PBS-T洗涤各孔3次后,在 每1孔中添加添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液100 μ L,在室温静置2小时。用PBS-T 洗涤各孔3次,然后在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗鸡IgY抗体(SIGMA 社制),并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后,在每1孔中添加TMB底物溶液 (Thermo社制)100 μ L,静置15?30分钟,进行显色反应。显色后,在每1孔中添加IN硫 酸100 μ L使反应停止,使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是,筛选出 了数个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤作为目的杂交瘤的候选株。
[0101] 将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0. 5个的方式添加到板中进行培养。1周后, 观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养,以由克隆化的杂 交瘤产生的抗体对CAPRIN-I的结合亲和性为指标,通过与上述同样的方法进行筛选,获得 了多个产生与CAPRIN-I蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。
[0102] 接着筛选这些单克隆抗体中对表达CAPRIN-I的乳癌细胞的细胞表面显示反应 性的单克隆抗体。具体地,在I. 5mL容量的微量离心管中离心分离5X IO5个人乳癌细胞 株MDA-MB-231V,向其中添加上述各杂交瘤的培养上清液100 μ 1,在冰上静置1小时。在 用PBS洗涤后,添加用含0. 1 % FBS的PBS稀释30倍的FITC标记山羊抗鸡IgG (H+L)抗体 (SouthernBiotech社制),在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后,使用< 夕卜> 7 ? > >株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面,使用杂交瘤培养用培养基进行与 上述同样的操作,制备对照的样品。其结果是,筛选出了 1个与对照相比荧光强度强、即与 表达CAPRIN-I的乳癌细胞的细胞表面反应的单克隆抗体(鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体 #11) 〇
[0103] (4)小鼠-鸡嵌合重组抗体的制作
[0104] 将上述⑶中得到的、序列号64所示的鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11的重链 可变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后纯化,按照常规方法插入到已经插入了 源自鸡抗体的前导序列和小鼠 IgGl的H链恒定区的pcDNA4/myc_His (life technologies 社制)载体中。另外,将序列号65所示的鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11的轻链可变区的 基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后纯化,按照常规方法插入到已经插入了源自鸡抗 体的前导序列和小鼠 IgGl的L链恒定区的pcDNA3. 1/myc-His (life technologies社制) 载体中。
[0105] 接着,将插入了鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11的重链可变区的上述重组载体、 和插入了鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11的轻链可变区的上述重组载体导入CHO-Kl细胞 (从理研七夕获得)中。具体地,将在12孔培养板的每1孔中用ImL含有10% FBS 的 Ham'sF12 培养基(Iifetechnologies 社制)培养的 2 X IO5个 CHO-Kl 细胞用 PBS (-)洗 涤后,在每1孔中重新加入含有10% FBS的Ham' s F12培养基lmL,在加入后的孔中添加 溶解在30 yL的OptiMEM (life technologies社制)中的上述各载体250ng与Polyfect transfection reagent (QIAGEN社制)30 μ L混合而成的混合物。将导入了上述重组载体 的 CH0-K1 细胞在添加了 200 μ g/mL Zeocin (life technologies 社制)以及 200 μ g/mL Geneticin (口シI社制)的含10% FBS的Ham' s F12培养基中培养后,以96孔板的每I 孔中0. 5个的方式接种导入了上述重组载体的CH0-K1细胞,从而制作稳定地产生具有鸡单 克隆抗体#11的可变区和小鼠IgGl的恒定区的小鼠-鸡嵌合抗人CAPRIN-I单克隆抗体 #12。将制作的细胞株使用150cm 2烧瓶,以5X 10 5个/mL使用不含血清的OptiCHO培养基 (Life technologies社制)30mL培养5天,得到含#12的培养上清。
[0106] (5)小鼠-鸡嵌合抗人CAPRIN-I单克隆抗体#12所识别的CAPRIN-I表位的鉴定
[0107] 使用⑷中获得的、与癌细胞的细胞表面反应的小鼠-鸡嵌合抗人CAPRIN-I单克 隆抗体#12,进行所识别的CAPRIN-I表位区域的鉴定。将CAPRIN-I重组蛋白质100 μ g溶 解在不含蛋白质抑制剂的溶解缓冲液中,使其与单克隆抗体#12反应。在该溶液中加入胰 蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化酶,在适当温度下进行消化反应。反应后加入蛋白G-Sepharose 担载体使其反应,通过离心操作使担载体沉淀。除去上清后,用溶解缓冲液和PBS洗涤并使 其溶解在0.1%的甲酸中,回收其上清。将回收的上清样品加入反相柱(HLB Extraction Cartridge(C)ASIS社)),获得除去了抗体的样品溶液。将所得的样品使用反相液相层析 (层析纳米系统(KYA社))回收仅含肽的溶液,导入串联型质谱仪quadrupole-TOF mass spectrometer (Waters-Micromass社)中进行MS/MS分析,检测样品内所含的肽。其结果 是,作为小鼠-鸡嵌合抗人CAPRIN-I单克隆抗体#12所识别的CAPRIN-I的部分序列,鉴定 出了包含序列号66的氨基酸序列的肽。另外,意味着该肽也是构成抗体#12的可变区的鸡 抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11所识别的CAPRIN-I的部分序列。
[0108] (6)人-鸡嵌合抗人CAPRIN-I抗体的制作
[0109] 将上述(3)中得到的、序列号64所示的鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11的重链可 变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后纯化,按照常规方法插入到已经插入了包 含序列号67的源自鸡抗体的前导序列和包含序列号68的人IgGl的H链恒定区的pcDNA4/ myc-His (life technologies社制)载体中。另外,将序列号65所示的鸡抗人CAPRIN-I单 克隆抗体#11的轻链可变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后纯化,按照常规方 法插入到已经插入了包含序列号68的源自鸡抗体的前导序列和包含序列号69的人IgGl 的 L 链恒定区的 pcDNA3. 1/myc-His (life technologies 社制)载体中。
[0110] 接着,将插入了上述抗体#11的重链可变区的上述重组载体、和插入了上述抗 体#11的轻链可变区的上述重组载体导入到CHO-Kl细胞(由理研七夕获得)中。 具体地,将在12孔培养板的每1孔中用ImL含有10% FBS的Ham' s F12培养基(life technologies社制)培养的2 X IO5个CHO-Kl细胞用PBS (-)洗涤后,在每1孔中重新加入 含10% FBS的Ham's F12培养基lmL,在加入后的孔中添加溶解在30 yL的OptiMEM(life technologies 社制)中的上述各载体 250ng 与 Polyfect transfection reagent (QIAGEN 社制)30 μ L混合而成的混合物。将导入了上述重组载体的CH0-K1细胞在添加了 200 μ g/ mL Zeocin (life technologies 社制)以及 200 μ g/mL 的 Geneticin (口 シ i 社制)的含 10% FBS的Ham's F12培养基中培养后,向96孔板中以每1孔0. 5个的方式接种导入了上 述重组载体的CH0-K1细胞,制作稳定地产生具有鸡抗人CAPRIN-I单克隆抗体#11的可变 区和人IgGl的恒定区的人-鸡嵌合抗人CAPRIN-I抗体#13的细胞株。将制作的细胞株使 用150cm 2烧瓶、以5X 10 5个/mL使用不含血清的OptiCHO培养基(Life technologies社 制)30mL培养5天,得到包含上述抗体#13的培养上清。
[0111] ⑵小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#14的制作
[0112] 通过与(1)同样的方法,以(2)中鉴定的序列号63的氨基酸序列与载体蛋白质 KLH(Keyhole limpet haemocyanin)的融合蛋白质作为免疫原,与等量的佐剂剂TiterMax Gold(注册商标)(CytRx社)混合,每隔7天在小鼠的皮下施与,每1次施与20 μ g。合计 进行4次施与后,从最终免疫开始3天后的小鼠获得脾脏细胞,通过与上述(1)同样的方 法与小鼠骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤。然后,以制作的杂交瘤的培养上清中所含的各抗 体与W02010/016526的实施例3中制备的CAPRIN-I溶液1 μ g/mL或作为免疫原使用的序 列号63的氨基酸序列与载体蛋白质KLH的融合蛋白质的反应性作为指标,筛选抗体。将 W02010/016526的实施例3中制备的CAPRIN-I溶液1 μ g/mL、和序列号63的氨基酸序列与 载体蛋白质的BSA的融合蛋白质30 μ g/mL分别在96孔板的每1孔种添加100 μ L,在4°C 静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤后,在每1孔中添加Block Ace(DS 7 才夕尹 4力;14土)溶液400 μ L,在室温静置3小时。除去溶液,用PBS-T洗涤孔后,在每1孔中添 加上述得到的杂交瘤的各培养上清100 μ L,在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔后,在每 1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG (H+L)抗体(life technologies社 制)100 μ L,在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔后,在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo 社制)100 μ L,静置5?30分钟进行显色反应。显色后,在每1孔中添加IN硫酸100 μ L, 使反应停止,使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果筛选出了产生吸光度 值高的抗体的杂交瘤。
[0113] 将筛选出的杂交瘤以96孔板的每1孔中0.3个的方式添加到板中进行培养。1周 后,观察到在孔中形成单一集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进一步培养,以克隆的杂交瘤所 产生的抗体对作为CAPRIN-I的部分序列的序列号63的氨基酸序列的结合亲和性为指标, 使用与上述同样的方法,获得产生针对序列号63的氨基酸的抗体的杂交瘤。
[0114] 筛选得到的杂交瘤所产生的单克隆抗体内与表达CAPRIN-I的乳癌细胞的细胞表 面显示反应性的抗体。具体地,将106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V在I. 5mL容量的微量 离心管中进行离心分离,在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100 μ L,在冰上静置1小时。 用PBS洗涤后,添加用含0. 1% FBS的PBS稀释至500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体 (life technologies社制),在冰上静置1小时。用PBS洗涤后,用< 夕卜7 ? V >株式会社的FACS Calibur测定荧光强度。另一方面,对于使用将未进行任何处理的6周 龄Balb/c小鼠的血清用杂交瘤培养用培养基稀释500倍代替抗体而得的样品、以及仅与二 抗反应而得的样品,进行与上述同样的操作,作为阴性对照。其结果获得了与阴性对照相比 荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#14。上述抗 体#14包含序列号70的重链可变区和序列号71的轻链可变区。
[0115] 调查得到的小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#14与作为免疫原的CAPRIN-I的部分 序列即序列号63的氨基酸序列的特异性反应。将用0. IM的碳酸钠水溶液调制成30 μ g/ mL的包含序列号63的氨基酸序列的溶液和不包含序列号63的氨基酸序列的CAPRIN-I的 部分序列,分别在ELISA用96孔板Immobilizer Amino ( ^ >夕社)中添加各100 μ g/mL, 在4°C使其反应一昼夜,使肽与孔结合。在结合了肽的孔中添加包含IOmM乙醇胺的0. IM碳 酸钠水溶液,在室温静置1小时。除去孔内的溶液后,用PBS-T洗涤,然后在每1孔中添加 Block Ace溶液400 μ L,在室温静置3小时。除去孔内的溶液,用PBS-T洗涤后,在每1孔 中添加包含小鼠单克隆抗体#14的培养上清50 μ L,在室温使其反应1小时。然后用PBS-T 洗涤,在每1孔中添加用Block Ace溶液稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体 (life technologies社制)50 μ L,在室温静置1小时。用PBS-T将孔充分洗涤后,在每1 孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100 μ L,静置5?30分钟进行显色反应。显色后, 在每1孔中添加IN硫酸100 μ L使反应停止,使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度 值,结果小鼠单克隆抗体#14与不含序列号63的氨基酸序列的CAPRIN-I的部分序列完全 不反应,仅与序列号63的氨基酸序列特异性地反应。因此确认,序列号63的多肽包含抗 CAPRIN-I抗体#14的表位区域。
[0116] <实施例3 :最适合CAPRIN-I检测的抗体的筛选>
[0117] (1)使用人乳癌组织的抗体的筛选
[0118] 使用石蜡包埋的人乳癌组织阵列(MBL社制)的乳癌组织31个样本进行免疫组织 化学染色。将人乳癌组织阵列在60°C处理3小时后,装入充满了二甲苯的染色瓶中,将每隔 5分钟替换二甲苯的操作进行3次。接下来,使用乙醇和PBS-T进行与所述二甲苯同样的操 作。将人乳癌组织阵列装入充满了包含〇. 05% Tween20的IOmM柠檬酸缓冲液(pH6. 0)的 染色瓶中,在125°C处理5分钟后,在室温静置40分钟以上。将切片周围的多于水分用无尘 纸擦去,用DAK0PEN(DAK0社制)包围,滴加适量的Peroxidase Block(DAKC)社制)。在室 温静置5分钟后,装入充满PBS-T的染色瓶中,将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。 作为封闭液,装载包含10% FBS的PBS-T溶液,在湿室内在室温静置1小时。接着装载将 实施例2中制作的小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#8或#14分别用含5% FBS的PBS-T溶 液调制为10 μ g/mL而得的溶液,在湿室内在4°C静置一夜。用PBS-T进行3次、每次10分 钟的洗绦后,滴加适量Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAK0社制),在湿室内 在室温静置30分钟。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤后,装载DAB显色液(DAK0社 制),在室温静置10分钟左右后,丢弃显色液,用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤。用 蒸馏水冲洗后,依次放入70%、80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分钟,最后在二 甲苯中静置一夜。取出载玻片,用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制)封入后,进行观 察。组织中的CAPRIN-I的表达量按照以下基准判定。选择显示阳性观察结果的载玻片,确 认CAPRIN-I染色像。首先,使用光学显微镜的4倍物镜,观察组织内的癌细胞的CAPRIN-I 染色像、阳性染色的强度、阳性细胞率。接着,将物镜切换为10倍或20倍,探索阳性观察结 果定位于细胞膜还是细胞质。通过以上的方法判定检测结果,分类为得分〇?3。得分的详 细如下。
[0119] ?得分0(无 CAPRIN-I过表达):细胞膜无阳性染色,或者有细胞膜的阳性染色的 癌细胞小于10%。
[0120] ?得分1 (无 CAPRIN-I过表达):有基本不能识别的微弱的细胞膜的染色的癌细胞 为10%以上,癌细胞仅细胞膜被部分染色。
[0121] ?得分2(有CAPRIN-I过表达):有弱?中程度的完全的细胞膜的阳性染色的癌细 胞为10%以上,或者有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为10%以上30%以下。
[0122] ?得分3 (有CAPRIN-I过表达):有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为30% 以上。
[0123] 检测结果为得分2和3的情况下,判定为CAPRIN-I阳性的癌组织。
[0124] 其结果是,使用任一抗体都能够在乳癌组织中确认CAPRIN-I的表达。在使用抗体 #8的免疫组织化学染色的结果中,得分2为14个样本,得分3为1个样本,CAPRIN-I阳性 的样本数为15个样本,与此相对,在使用抗体#14的免疫组织化学染色的结果中,得分2为 12个样本,得分3为8个样本,CAPRIN-I阳性的样本数为20个样本。因此,在使用人癌组 织的CAPRIN-I的检测中,选择灵敏度更高的抗体#14。
[0125] (2)通过使用抗体#14的免疫组织化学染色法进行的人各种正常组织上的 CAPRIN-I的检测
[0126] 使用人正常组织阵列(BIOMAX社制)(包含脑、甲状腺、肺、脾脏、肾脏、食道、胃、 大肠、胰脏、肌肉、皮肤、唾液腺、卵巢、子宫、乳腺、胎盘、骨髓、精巢、前列腺子宫、前列腺的 组织),进行免疫组织化学染色。将切片周围多余水分用无尘纸擦去,用DAKOPEN (DAKO社 制)包围,滴加适量的Peroxidase Block(DAKC)社制)。在室温静置5分钟后,装入充满了 PBS-T的染色瓶中,将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。作为封闭液,装载含10% FBS的PBS-T溶液,在湿室内在室温静置1小时。接着,装载将实施例2中制作的小鼠抗人 CAPRIN-I单克隆抗体#14用含5% FBS的PBS-T溶液调制成10 μ g/mL而得的溶液,在湿 室内在4°C静置一夜。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤后,滴加适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAK0社制),在湿室内室温静置30分钟。用PBS-T进行3 次、每次10分钟的洗涤后,装载DAB显色液(DAK0社制),在室温静置10分钟左右后,丢弃 显色液,用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤。用蒸馏水冲洗后,依次放入70%、80%、 90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分钟,最后在二甲苯中静置一夜。取出载玻片,用 Glycergel Mounting Medium(DAKC)社制)封入后,进行观察。
[0127] 组织中的CAPRIN-I的表达量按照以下基准判定。选择显示阳性观察结果的载 玻片,确认CAPRIN-I染色像。首先,使用光学显微镜的4倍物镜,观察组织内的癌细胞的 CAPRIN-I染色像、阳性染色的强度、阳性细胞率。接着,将物镜切换为10倍或20倍,探索阳 性观察结果定位于细胞膜还是细胞质。通过以上的方法判定检测结果,分类为得分0?3。 得分的详细如下。
[0128] ?得分0 (无 CAPRIN-I过表达):细胞膜无阳性染色,或者有细胞膜的阳性染色的 癌细胞小于10%。
[0129] ?得分1 (无 CAPRIN-I过表达):有基本不能识别的微弱的细胞膜的染色的癌细胞 为10%以上,癌细胞仅细胞膜被部分染色。
[0130] ?得分2 (有CAPRIN-I过表达):有弱?中程度的完全的细胞膜的阳性染色的癌细 胞为10%以上,或者有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为10%以上30%以下。
[0131] ?得分3 (有CAPRIN-I过表达):有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为30% 以上。
[0132] 在检测结果为得分2和3的情况下,判定为CAPRIN-I阳性的癌组织。
[0133] 子宫和前列腺得分1,除此以外的组织全部得分0。因此,人正常组织中没有发现 CAPRIN-I的表达。
[0134] (3)通过使用小鼠抗人CAPRIN-I抗体#14的免疫组织化学染色法进行的人各种癌 组织上的CAPRIN-I的检测
[0135] 使用石蜡包埋的人癌组织阵列(BIOMAX社制)的各种癌组织,进行免疫组织化学 染色。将人癌组织阵列在60°C处理3小时后,装入充满了二甲苯的染色瓶中,将每隔5分 钟替换二甲苯的操作进行3次。接下来,用乙醇和PBS-T进行与所述二甲苯同样的操作。 将人癌组织阵列装入充满了包含0. 05% Tween20的IOmM柠檬酸缓冲液(pH6. 0)的染色瓶 中,在125°C处理5分钟后,在室温静置40分钟以上。将切片周围多余水分用无尘纸擦去, 用DAKOPEN(DAKO社制)包围,滴加适量的Peroxidase Block(DAKC)社制)。在室温静置5 分钟后,装入充满了 PBS-T的染色瓶中,将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。作为 封闭液,装载含10% FBS的PBS-T溶液,在湿室内在室温静置1小时。接着,装载将实施例 2中制作的单克隆抗体#14用含5% FBS的PBS-T溶液调制成10 μ g/mL而得的溶液,在湿 室内在4°C静置一夜。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤后,滴加适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated (DAK0社制),在湿室内室温静置30分钟。用PBS-T进行 3次、每次10分钟的洗涤后,装载DAB显色液(DAK0社制),在室温静置10分钟左右后,丢 弃显色液,用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤。用蒸馏水冲洗,然后依次放入70%、 80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分钟,最后在二甲苯中静置一夜。取出载玻片, 用 Glycergel Mounting Medium(DAKC)社制)封入后,进行观察。
[0136] 组织中的CAPRIN-I的表达量按照以下基准判定。选择显示阳性观察结果的载 玻片,确认CAPRIN-I染色像。首先,使用光学显微镜的4倍物镜,观察组织内的癌细胞的 CAPRIN-I染色像、阳性染色的强度、阳性细胞率。接着,将物镜切换为10倍或20倍,探索阳 性观察结果定位于细胞膜还是细胞质。通过以上的方法判定检测结果,分类为得分0?3。 得分的详细如下。
[0137] ?得分0 (无 CAPRIN-I过表达):细胞膜无阳性染色,或者有细胞膜的阳性染色的 癌细胞小于10%。
[0138] ?得分1 (无 CAPRIN-I过表达):有基本不能识别的微弱的细胞膜的染色的癌细胞 为10%以上,癌细胞仅细胞膜被部分染色。
[0139] ?得分2 (有CAPRIN-I过表达):有弱?中程度的完全的细胞膜的阳性染色的癌细 胞为10%以上,或者有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为10%以上30%以下。
[0140] ?得分3 (有CAPRIN-I过表达):有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为30% 以上。
[0141] 在检测结果为得分2和3的情况下,判定为CAPRIN-I阳性的癌组织。
[0142] 其结果确认了,CAPRIN-I在脑瘤组织22个样本内的16个样本(64% )、肺癌组织 32个样本内的19个样本(59% )、子宫癌组织21个样本内的18个样本(86% )、食道癌组 织16个样本内的10个样本(63% )、肾癌组织30个样本内的27个样本(90% )、肝癌组织 17个样本内的14个样本(82% )、甲状腺癌组织15个样本内的11个样本(73% )、胃癌组 织14个样本内的10个样本(71% )、胰癌组织19个样本内的17个样本(89% )、前列腺癌 组织13个样本中13个样本(100% )、膀胱癌组织14个样本中12个样本(86% )、大肠癌 组织14个样本内的11个样本(79% )、皮肤癌组织30个样本内的24个样本(80% )和乳 癌组织21个样本内的16个样本(76% )中,分别为阳性。
[0143] (4)通过使用小鼠抗人CAPRIN-I抗体#14的免疫组织化学染色法进行的狗乳癌组 织上的CAPRIN-I的检测
[0144] 使用在病理诊断中诊断为恶性乳癌的狗的冷冻的乳癌组织100个样本,进行免疫 组织化学染色。将冷冻狗乳癌组织使用低温恒温器(LEICA社制)切成10?20 μm的薄 片,放置于载玻片上,隔着载玻片用吹风机风干30分钟,从而制作安放了薄切组织的载玻 片。接着装入充满了 PBS-T (含0.05 % Tween20的生理盐水)的染色瓶中,将每隔5分钟 替换PBS-T的操作进行3次。将切片周围多余水分用无尘纸擦去,用DAKOPEN(DAKO社制) 包围后,作为封闭液,装载含10%胎牛血清的PBS-T溶液,在湿室内在室温静置1小时。接 着,装载将实施例2中制作的小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#8或#14分别用封闭液调制 成10 μ g/mL而得的溶液,在湿室内在4°C下静置一夜。用PBS-T进行3次、每次10分钟的 洗涤后,装载用封闭液稀释了 250倍的MOM生物素标记抗IgG抗体(VECTASTAIN社制),在 湿室内在室温静置1小时。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤后,装载亲和素-生物 素ABC试剂(VECTASTAIN社制),在湿室内在室温静置5分钟。用PBS-T进行3次、每次10 分钟的洗涤后,装载 DAB 显色液(DAB 10mg+30 % H2O2IO μ L/0. 05M Tris-HCl (pH7. 6) 50mL), 在湿室内在室温静置30分钟。用蒸馏水冲洗,装载苏木精试剂(DAK0社制),在室温静置I 分钟后,用蒸馏水冲洗。依次放入70%、80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分钟 后,最后在二甲苯中静置一夜。取出载玻片,用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制) 封入后,进行观察。组织中的CAPRIN-I的表达量按照以下基准判定。选择显示阳性观察结 果的载玻片,确认CAPRIN-I染色像。首先,使用光学显微镜的4倍物镜,观察组织内的癌细 胞的CAPRIN-I染色像、阳性染色的强度、阳性细胞率。接着,将物镜切换为10倍或20倍, 探索阳性观察结果定位于细胞膜还是细胞质。通过以上的方法判定检测结果,分类为得分 〇?3。得分的详细如下。
[0145] ?得分0 (无CAPRIN-I过表达):细胞膜无阳性染色,或者有细胞膜的阳性染色的 癌细胞小于10%。
[0146] ?得分1 (无CAPRIN-I过表达):有基本不能识别的微弱的细胞膜的染色的癌细胞 为10%以上,癌细胞仅细胞膜被部分染色。
[0147] ?得分2 (有CAPRIN-I过表达):有弱?中程度的完全的细胞膜的阳性染色的癌细 胞为10%以上,或者有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为10%以上30%以下。
[0148] ?得分3 (有CAPRIN-I过表达):有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为30% 以上。
[0149] 在检测结果为得分2和3的情况下为阳性,判定为能通过针对CAPRIN-I的治疗药 施与而获得有效的治疗效果的荷癌犬组织。
[0150] 其结果是,使用任一抗体均能够在狗乳癌组织中确认CAPRIN-I的表达。具体地, 在使用抗体#8的免疫组织化学染色的结果中,得分2为69个样本,得分3为11个样本, CAPRIN-I阳性的样本数为80个样本(80% ),与此相对,在使用抗体#14的免疫组织化学染 色的结果中,得分2为50个样本,得分3为32个样本,CAPRIN-I阳性的样本数为82个样 本(82% )。
[0151] (5)通过使用小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#14的免疫组织化学染色法进行的猫 乳癌组织上的CAPRIN-I的检测
[0152] 使用在病理诊断中诊断为恶性乳癌的猫的冷冻乳癌组织30个样本,进行免疫组 织化学染色。将冷冻猫癌组织使用低温恒温器(LEICA社制),切成10?20 μ m的薄片,放置 于载玻片上,隔着载玻片用吹风机风干30分钟,从而制作安放了薄切组织的载玻片。接着, 放入充满了 PBS-T (含0.05% Tween20的生理盐水)的染色瓶中,将每隔5分钟替换PBS-T 的操作进行3次。将切片周围多余水分用无尘纸擦去,用DAKOPEN(DAKO社制)包围后,作 为封闭液,装载含10%胎牛血清的PBS-T溶液,在湿室内在室温静置1小时。接着,装载将 实施例2中制作的小鼠抗人CAPRIN-I单克隆抗体#8或#14分别用封闭液调制成10 μ g/ml 而得的溶液,在湿室内在4°C下静置一夜。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤后,装载 用封闭液稀释了 250倍的MOM生物素标记抗IgG抗体(VECTASTAIN社制),在湿室内在室 温静置1小时。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤后,装载亲和素-生物素ABC试剂 (VECTASTAIN社制),在湿室内在室温静置5分钟。用PBS-T进行3次、每次10分钟的洗涤 后,装载 DAB 显色液(DAB 10mg+30 % H2O210 μ 1/0. 05M Tris-HCl (pH7. 6) 50ml),在湿室内在 室温静置30分钟。用蒸馏水冲洗,装载苏木精试剂(DAKO社制),在室温静置I分钟后,用 蒸馏水冲洗。依次放入70 %、80 %、90 %、95 %、100 %的各乙醇溶液中各1分钟后,最后在二 甲苯中静置一夜。取出载玻片,用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制)封入后,进行观 察。组织中的CAPRIN-I的表达量按照以下基准判定。选择显示阳性观察结果的载玻片,确 认CAPRIN-I染色像。首先,使用光学显微镜的4倍物镜,观察组织内的癌细胞的CAPRIN-I 染色像、阳性染色的强度、阳性细胞率。接着,将物镜切换为10倍或20倍,探索阳性观察结 果定位于细胞膜还是细胞质。通过以上的方法判定检测结果,分类为得分〇?3。得分的详 细如下。
[0153] ?得分0 (无 CAPRIN-I过表达):细胞膜无阳性染色,或者有细胞膜的阳性染色的 癌细胞小于10%。
[0154] ?得分1 (无 CAPRIN-I过表达):有基本不能识别的微弱的细胞膜的染色的癌细胞 为10%以上,癌细胞仅细胞膜被部分染色。
[0155] ?得分2 (有CAPRIN-I过表达):有弱?中程度的完全的细胞膜的阳性染色的癌细 胞为10%以上,或者有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为10%以上30%以下。
[0156] ?得分3 (有CAPRIN-I过表达):有强的完全的细胞膜的阳性染色的癌细胞为30% 以上。
[0157] 在检测结果为得分2和3的情况下为阳性,判定为能通过针对CAPRIN-I的治疗药 施与而获得有效的治疗效果的荷癌猫组织。
[0158] 其结果是,使用任一抗体均能在猫乳癌组织中确认CAPRIN-I的表达。具体地, 在使用抗体#8的免疫组织化学染色的结果中,得分2为20个样本,得分3为4个样本, CAPRIN-I阳性的样本数为24个样本(80% ),与此相对,在使用抗体#14的免疫组织化学染 色的结果中,得分2为21个样本,得分3为6个样本,CAPRIN-I阳性的样本数为27个样本 (90% ) 〇
[0159] <实施例4 :使用癌的样品的CAPRIN-I的表达评价与由抗CAPRIN-I抗体产生的 抗肿瘤效果的相关性>
[0160] (1)通过免疫组织化学染色法、使用源自移植了小鼠癌细胞的荷癌小鼠的癌组织 的CAPRIN-I的检测
[0161] 在26只Balb/c小鼠(日本SLC社制)的背部皮下,将源自小鼠的癌细胞2种 (B16F10,EMT-6)分别移植5只,使其成长至肿瘤为直径7_左右的大小。从移植了癌细胞 2种的小鼠的2组中筛选出各3只,切下肿瘤块,在PBS中将肿瘤块切开,用含4%低聚甲 醛(PFA)的0. IM磷酸缓冲液(pH7. 4)进行一夜回流固定。丢弃回流液,用PBS洗涤各脏器 的组织表面,将含10%蔗糖的PBS溶液装入50mL容量的离心管中,在其中加入癌组织,在 4°C使用旋转器振荡2小时。替换成含20%蔗糖的PBS溶液,在4°C静置至癌组织沉降后, 替换成含30%蔗糖的PBS溶液,再在4°C静置至癌组织沉降。取出癌组织,用手术刀切下必 要的部分。接着,加入OCT冷冻切片包埋剂(Tissue Tek社制)适应组织表面后,在冷冻 切片包埋模具中配置组织。在干冰上放置冷冻切片包埋模具使其急速冷冻后,使用低温恒 温器(LEICA社制)切成10?20 μπι的薄片,隔着载玻片用吹风机风干30分钟,从而制作 安放了薄切组织的载玻片。第二天,用PBS(-)洗涤3次。作为封闭液,装载含5%山羊血 清的PBS(-),在湿室内在室温静置1小时。接着,装载用包含实施例2中制作的小鼠抗人 CAPRIN-I单克隆抗体#8或#14的PBS(-)溶液调制成10 μ g/mL而得的溶液,在湿室内在 4°C静置一夜。用PBS(-)进行5次、每次5分钟的洗涤后,滴加适量Peroxidase Labelled Polymer ConjugatecKDAKO社制),在湿室内室温静置30分钟。用PBS-T进行6次、每次5 分钟的洗涤后,装载DAB显色液(DAK0社制),在室温静置10分钟左右后,丢弃显色液。用 PBS(-)进行3次、每次5分钟的洗绦后,用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制)封入 后,进行观察。如实施例3所记载那样进行得分分类,使用抗体#8的免疫组织化学染色的 结果是源自黑素瘤的细胞B16F10和源自乳癌的细胞EMT-6均为得分1,未检测到CAPRIN-I 表达。另一方面,在使用抗体#14的结果中,对癌细胞B16F10与抗体#8同样地为得分1,但 对癌细胞EMT-6为得分3。
[0162] (2)由抗CAPRIN-I抗体产生的抗肿瘤效果
[0163] 使用人-鸡嵌合抗人CAPRIN-I抗体#13,研宄使用上述⑴中制作的荷癌小鼠的 抗肿瘤效果。对移植了 B16F10和EMT-6的各癌细胞的荷癌小鼠 10只中各5只,腹腔内施 与抗体#13,每1只各200 μ g(200 μ L)。然后,以2天共计3次在腹腔施与等量的抗体,以 此作为研宄组,每天计测肿瘤的大小,观察#13抗体的抗肿瘤效果。另一方面,对各荷癌小 鼠的其余5只,施与PBS(-)代替抗体,以此作为对照组。
[0164] 抗肿瘤效果的观察结果是,在施与了抗体#13的B16F10移植研宄组中,肿瘤体积 在以抗体施与开始时为100%的情况下,在第4天、第6天、第8天、第11天分别增大至约 150%、200 %、370%、630 %。另一方面,在施与了抗体#13的EMT-6移植研宄组中,肿瘤体 积在以抗体施与开始时为100%的情况下,在第4天萎缩至51%,第6天萎缩至31%左右, 第8天肿瘤萎缩至9 %,到第10?14天肿瘤基本完全萎缩。此外,在施与了 PBS (-)的对照 组中,B16F10移植研宄组和EMT-6移植研宄组的任一者均在第4天、第6天、第8天、第11 天肿瘤分别增大至约230 %、290 %、470 %、800 %。
[0165] 由以上的结果,在使用抗体#8的情况下,CAPRIN-I的检测结果与由该抗体的抗肿 瘤活性产生的癌治疗效果未发现相关,但在使用抗体#14的情况下,CAPRIN-I的检测结果 与由该抗体的抗肿瘤活性产生的癌治疗效果发现了相关性。即,由于移植了 EMT-6的癌组 织中的利用抗体#14的CAPRIN-I的检测结果为得分3,因而确认了 CAPRIN-I的过表达,并 且还确认了基于由该抗体的施与产生的抗肿瘤活性的药理效果。
[0166] 另一方面,移植了 B16F10的癌组织中的利用抗体#14的CAPRIN-I的表达的检测 结果为得分1,未检测到CAPRIN-I的表达,另外即使将具有抗肿瘤活性的抗体#13施与移植 了 B16F10的荷癌小鼠,也得不到药理效果。
[0167] 由以上的结果能够预测,如果使用作为本发明的与CAPRIN-I特异性地结合的抗 体的#14来检测癌组织中的CAPRIN-1,对判定为其表达量高的癌或个体施与具有抗肿瘤效 果的抗CAPRIN-I抗体,则获得高的治疗效果。
[0168] 产业可利用性
[0169] 本发明用于癌的诊断而在产业上有用。
[0170] 将本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。
[0171] 序列表自由文本
[0172] 序列号31?36、38?42 :引物
【权利要求】
1. 癌的检测方法,包括:使用与具有序列号63所示的氨基酸序列的多肤具有免疫反应 性的抗体或其抗原结合片段,通过抗原抗体反应,来测定生物体样品中的CAPRIN-1的表达 量。
2. 根据权利要求1所述的癌的检测方法,要测定的所述CAPRIN-1是 (a)具有序列表的序列号2?30中偶数的序列号所示的任一氨基酸序列的多肤,或者 化)与所述多肤具有85% W上的序列同一性的多肤。
3. 根据权利要求1或2所述的癌的检测方法,所述生物体样品源自人、狗或猫。
4. 根据权利要求1?3的任一项所述的癌的检测方法,所述生物体样品源自狗,要测定 的所述CAPRIN-1具有序列号6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1?3的任一项所述的癌的检测方法,所述生物体样品源自人,要测定 的所述CAPRIN-1具有序列号2或4所示的氨基酸序列。
6. 根据权利要求1?5的任一项所述的癌的检测方法,在测定出的CAPRIN-1表达量与 健常个体相比有意义地高的情况下,显示成为作为癌治疗药的所述抗体的祀的癌存在。
7. 根据权利要求1?6的任一项所述的癌的检测方法,所述CAPRIN-1的表达量的测定 使用免疫分析法来进行。
8. 根据权利要求7所述的癌的检测方法,所述免疫分析法是化ISA和/或免疫组织化 学染色法。
9. 根据权利要求1?8的任一项所述的癌的检测方法,所述生物体样品是体液、组织或 细胞。
10. 根据权利要求1?9的任一项所述的癌的检测方法,所述癌是选自乳癌、脑瘤、食道 癌、胃癌、肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、脾癌、膜癌、大肠癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺 癌、膀脱癌、精巢癌、骨肉瘤和纤维肉瘤中的至少1种癌。
11. 根据权利要求1?10的任一项所述的癌的检测方法,所述抗体或其抗原结合片段 是具有包含序列号70所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列号71所示的氨基酸序列 的轻链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段。
12. 癌诊断药或试剂盒,其特征在于,包含与具有序列号63所示的氨基酸序列的多肤 具有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段。
13. 根据权利要求12所述的癌诊断药或试剂盒,所述抗体或其抗原结合片段是具有包 含序列号70所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列号71所示的氨基酸序列的轻链可 变区的单克隆抗体或其抗原结合片段。
14. 区别个体的癌治疗药的选择方法,使用与具有序列号63所示的氨基酸序列的多肤 具有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段来测定生物体样品中的CAPRIN-1的表达量,在 该表达量与健常个体相比在统计学上有意义地高的情况下,确定选择CAPRIN-1祀向药作 为适合对该生物体样品所源自的个体进行施与的癌治疗药。
15. 根据权利要求14所述的区别个体的癌治疗药的选择方法,其特征在于,所述 CAPRIN-1祀向药是与CAPRIN-1具有免疫反应性的抗体或其抗原结合片段。
【文档编号】G01N33/577GK104471403SQ201380038351
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2012年7月19日
【发明者】井户隆喜, 冈野文义 申请人:东丽株式会社