一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，属于分析领域。本发明是利用4α-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸与氯甲酸对硝基苄酯反应后，所得到的衍生物具有紫外吸收的特性，然后再用高压液相色谱仪进行检测分析。本发明具有衍生时间短、能耗低、反应条件温和，操作简便、安全、高效，专属性、重复性及准确好，灵敏度高等优点。本方法适合工业化生产中4α-羟基-L-脯氨酸的快速检验。
【专利说明】—种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析领域，涉及一种4 α -羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法。
【背景技术】
[0002]4 α -羟基-L-脯氨酸是合成多个第二代碳青霉烯类抗生素及其它药物的起始原料，现行制备4 α -羟基-L-脯氨酸的生产工艺不可避免地会伴生痕量的L-脯氨酸，而L-脯氨酸会参与后续反应，产生影响最终产物含量的杂质。4 α -羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸均为环烷羧酸，结构中无紫外发色基团，因此无法直接用具紫外检测器的高压液相色谱仪检测其纯度和含量。
[0003]4 α -羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的分析检测方法主要有化学比色法、电泳法、氨基酸分析仪测定法、高效液相色谱法、液质联用法等。化学比色法、电泳法及氨基酸分析仪法操作复杂，分析时间短，分析时间长，价格昂贵。液质联用法仪器普及性不广。而柱前衍生与高效液相色谱相结合具有其操作简单、分析时间短，方法灵敏、线性范围宽，结果准确可靠及普及型广等优点，因此是分析检测4 α -羟基-L-脯氨酸的最有力工具。
[0004]高效液相色谱柱前衍生4 α -羟基-L-脯氨酸常用的衍生剂有异硫氰酸苯酯(PITC)、2，4 二硝基氟苯(DNFB)、9-芴基甲氧羟酰氯(FMOC)等。但是异硫氰酸苯酯(PITC)操作较复杂，且衍生化时间过长；2，4 二硝基氟苯(DNFB)室温下即融化，影响操作，且衍生出的副产物影响分离结果；9-芴基甲氧羟酰氯(FMOC)易水解，影响分离，效果欠佳。因此目前，对4 α -羟基L-脯氨酸的分析检测缺乏快速、准确的方法。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种4 α -羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，即一种衍生方法工时短、能耗低、工艺条件温和，操作简便、安全、高效，灵敏度高的检测4α_羟基-L-脯氨酸的新的方法。
[0006]为实现上述的发明目的，本发明采取的实施方式如下:
[0007]—种4 α -羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，其包括以下步骤:
[0008](I)取4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸对照品加水溶解，制得4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液；
[0009](2)取4 α -羟基-L-脯氨酸样品加水溶解，制得样品溶液；
[0010](3)将步骤I及步骤2所得混合标准品溶液及样品溶液分别加入氯甲酸对硝基苄酯二氯甲烷溶液，混匀，静止后分别取上层溶液稀释，得衍生化后的4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液；
[0011](4)吸取步骤3获得的衍生化后的4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4 α -轻基-L-脯氨酸样品溶液注入液相色谱仪中,进行4 α -轻基_L_脯氨酸测定，其中，色谱条件为:
[0012]流动相:0.1%磷酸水溶液:乙腈=1:1 (v/v)；
[0013]色谱柱:AgilentHC-C18, 4.6 X 250mm, 5 μ m ;
[0014]流速:1.0mL/min ；
[0015]进样量:5yL;
[0016]检测器:VWD;
[0017](5)根据步骤4所得的色谱图计算4 α -羟基_L_脯氨酸样品中4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。
[0018]具体为称取2g4 α -羟基-L-脯氨酸样品置于25ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液；取制得的4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液0.5ml，置于25ml容量瓶中，加入0.5ml50%氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烷溶液，强力振荡IOmin,再加入lmllmol/L NaOH,振荡Imin,最后加纯化水稀释至刻度,静止备用。得到对应的衍生物1-对硝基苄氧羰基-4 α -羟基-L-脯氨酸钠(痕量的1-对硝基苄氧羰基-L-脯氨酸钠)，该衍生物均具有紫外吸收，再用高压液相色谱仪进行检测分析。
[0019]本发明所涉及部分化合物的结构式:
[0020]4α-羟基-L-脯氨酸的结构式如下所示
[0021]
【权利要求】
1.一种4 α -羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，其包括以下步骤: (1)取4α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸对照品加水溶解，制得4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液； (2)取4α -羟基-L-脯氨酸样品加水溶解，制得样品溶液； (3)将步骤I及步骤2所得混合标准品溶液及样品溶液分别加入氯甲酸对硝基苄酯二氯甲烷溶液，混匀，静止后分别取上层溶液稀释，得衍生化后的4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液； (4)吸取步骤3获得的衍生化后的4α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，进行4 α -羟基-L-脯氨酸测定，其中，色谱条件为: 流动相:0.1%磷酸水溶液:乙腈=1:1 (v/v)；
色谱柱:Agilent HC-C18, 4.6 X 250mm, 5 μ m ;
流速:1.0mL/min ； 进样量:5yL ; 检测器:VWD ； (5)根据步骤4所得的 色谱图计算4α -羟基-L-脯氨酸样品中4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤I具体为称取2g4a-羟基-L-脯氨酸对照品及IOmg L-脯氨酸对照品置于25ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤2具体为称取0.8g4 α -羟基-L-脯氨酸样品置于IOml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤3具体为取步骤I制得的4 α -羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液及步骤2制得的4 α -羟基-L-脯氨酸样品溶液0.5ml，分别置于2个25ml容量瓶中，再分别加入0.5ml50%氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烧溶液，强力振荡IOmin,再分别加入lmllmol/L NaOH振荡Imin,最后加纯化水稀释至刻度，静止备用。
【文档编号】G01N30/88GK103940936SQ201410026879
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】彭久合, 吴丹, 张铁柱 申请人:天津市敬业精细化工有限公司