一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法
【专利摘要】本发明涉及1,5-脱水山梨醇检测领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于，包括：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂；所述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体由1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到。本发明的有益之处在于：1,5-脱水山梨醇免疫原的免疫原性高，制备出的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体特异性强、效价高；含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的1,5-脱水山梨醇含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现1,5-脱水山梨醇的高通量快速化测定，准确度高，特异性强。
【专利说明】一种1 ’ 5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及1，5-脱水山梨醇检测领域，具体涉及一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法。
【背景技术】
[0002]1,5-脱水山梨醇(I, 5-anhydro glue i to I, I，5-AG),结构式如式(III)所示:
[0003]
【权利要求】
1.一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，包括:抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体-1，5-脱水山梨醇复合物的指示试剂；所述抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体由1，5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到，所述1，5-脱水山梨醇免疫原的结构式如式(I)所示:
2.根据权利要求1所述的1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述的R为-(CH2)4-COO-;所述的载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
3.根据权利要求1所述的1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述指示试剂选自酶试剂，包括:酶标偶联物和酶的底物；所述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
4.根据权利要求3所述的1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与1，5-脱水山梨醇衍生物偶联形成，所述1，5-脱水山梨醇衍生物的结构式如式(II)所示:
5.根据权利要求4所述的1，5_脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，R为-(CH2)4-COO'
6.一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)权利要求4所述的1，5-脱水山梨醇衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定； (2)1，5-脱水山梨醇免疫原的合成:使1，5-脱水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，η为I至20之间的整数； (3)用1，5-脱水山梨醇免疫原免疫动物，制备并纯化抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体； (4)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备:制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活1，5-脱水山梨醇衍生物，使G6TOH与1，5-脱水山梨醇衍生物连接，纯化连接产物； (5)I, 5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂的制备: 试剂A的制备:由抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体和均相酶底物混合而成； 试剂B的制备:由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
7.根据权利要求6所述的一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，蛋白质载体为BSA, η=4,具体合成步骤如下: 1)将20mgBSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液PBS中，上述溶液置于烧杯A中； 2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解:20mgl，5-脱水山梨醇衍生物，0.35ml 二甲基酰胺，0.35ml乙醇，0.7mll0mM pH5.0的磷酸钾缓冲液，40mgl_乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟； 3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2~8°C下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷 酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-1，5-脱水山梨醇免疫原，储存于-20°C。
8.根据权利要求6所述的一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)具体过程为: O葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备: a.称取15mg 规格为 100KU 的 G6PDH,室温溶解于 12mL 含有 72.6mg (0.05M)Tris、8mgMgCl2 (3.3mM)和 IOOmgNaCl 的溶液中，该溶液 ρΗ=9.0 ； b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇； c.逐滴加入2mL二甲基亚讽； 2)I, 5-脱水山梨醇衍生物的激活 a)在无水状态下称取IOmgl,5-脱水山梨醇衍生物，溶解于600 μ LDMF中； b)使上述溶液温度降到-2~-8°C; c)加入3yL三丁胺； d)加入1.5μ L氯甲酸异丁酯； e)-2~-8°C搅拌30分钟； 3)G6PDH与1，5-脱水山梨醇衍生物的连接 a)将上述激活的1，5-脱水山梨醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中； b)2-8°C搅拌过夜； 4)纯化产物 通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8°C下储存。
9.根据权利要求6所述的一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤(5)的具体过程如下: 试剂A的制备:将4.036g (11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸G6P用lL55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为 1:100 ~1:10000 ； 试剂B的制备:将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100 ~ 1:10000。
10.利用权利要求1至5任意一项所述的1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将待测样本与抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体接触； 2)根据待测样本中1，5-脱水山梨醇与抗1，5-脱水山梨醇特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中甘胆酸的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
【文档编号】G01N33/531GK103760366SQ201410047754
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月11日 优先权日:2014年2月11日
【发明者】虞留明, 成志鹏, 王英, 张曼, 顾国浩 申请人:苏州博源医疗科技有限公司