一种测定杭白芍花粉活力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定杭白芍花粉活力的方法，包括：收集杭白芍的花粉；将所述的花粉置于培养基的表面进行离体培养；离体培养结束后统计花粉萌发率；所述培养基的组成为：蔗糖80～150g/L，硼酸15～30mg/L，琼脂8～10g/L；所述离体培养的时间为2.5～3.5h。本发明对药用杭白芍花粉的离体培养条件进行了探索，为其花粉活力的测定提供了一种简单、快速、可行、可靠的方法，为将药用杭白芍和北方观赏芍药进行杂交，培育出具备浙江特色、适应浙江气候的观赏芍药新品种起到了铺垫和促进作用。
【专利说明】一种测定杭白芍花粉活力的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物花粉活力测定领域，尤其涉及一种测定杭白芍花粉活力的方法。【背景技术】
[0002]芍药是中国传统花卉，栽培历史已近4000年，早在《诗经?郑风》中便有记载:“维士与女，伊其相谑，赠之以勺药”。芍药被誉为“花相”，和“花王”牡丹相齐名，具有很好的观赏价值和药用价值。芍药性喜光照和冷凉，不耐高温和潮湿，故我国华北地区的菏泽、洛阳等地是芍药、牡丹之乡，观赏品种众多，花型、花色、株型丰富多彩，可广泛用于花境、盆栽或切花观赏。
[0003]浙江省因气候湿热，本土观赏芍药品种培育几乎为零，即使引进北方品种，也多因气候不适及病虫害严重导致观赏效果大打折扣。但浙江省自古便有种植药用芍药的记载，如现今的金华市磐安县等地生产的杭白芍属于著名的中药材“浙八味”之一，其根状茎品质好，具备补血柔肝、平肝止痛、敛阴收汗等功效；杭白芍的花朵为紫红、粉红、粉白或纯白色，也具备很好的观赏价值；同时，杭白芍在浙江本地栽培历史悠久，对浙江省的湿热气候具一定的适应性。
[0004]传统观赏芍药很多品种的花型极度重瓣，雄蕊多瓣化，无花药，更无花粉；也有部分品种具备花药，但花粉量很少，这些都为利用人工杂交授粉培育新品种带来阻碍。相比较而言，杭白芍在各方面形态特征和生态习性上更接近芍药的野生原种。例如，因其根状茎长期供作药用，花型的筛选多不被重视，多为单瓣型或荷花型，雄蕊和花药清晰，花粉量极大，是很好的父本材料。因此，将药用杭白芍作为父本，北方观赏芍药品种作为母本，有望培育出既具备良好的观赏价值、又能够适应浙江省湿热气候的观赏芍药新品种，从而解决浙江地区观赏芍药品种极度匮乏的窘状。
[0005]具较高花粉生活力，是选择父本的重要指标。杭白苟的花粉活力不详，有关其测量工作至今未有报道。因此，建立一套有效测定杭白芍花粉活力测定的方法，可为浙江杭白芍和北方观赏芍药的杂交育种工作带来很大的促进效应。
[0006]目前对于花粉活力的测定主要有3类方法，分别为花粉染色法、田间授粉法、花粉离体萌发法。花粉染色法是使用化学试剂对花粉进行染色，根据染色后花粉颜色的深浅判断活力状况，方法快速、简便，主要有K2-KI染色法、醋酸洋红染色法、TTC染色法等。在《芍药花粉生活力测定与杂交亲本选择初步研究》、《芍药花粉活力测定方法的研究》、《芍药花粉活力和柱头可授性的研究》、《长期储藏芍药花粉生活力测定方法研究》等文献中，便已记载利用染色法来测定不同花型观赏芍药品种的花粉活力。但能够被染色的花粉却未必能够萌发，不一定会伸出花粉管，因此能够被染色却又无法生出花粉管的花粉，在杂交授粉后也未必能够受精结实，故染色法测定的花粉活力往往偏高。田间授粉法是直接在田间进行杂交育种实验，待果实成熟后计算结实率。该方法最为原始、直接和可靠，但也最为费时费工，受季节和天气影响较大，难以满足培育新品种的迫切需求。
[0007]人工给予花粉萌发的条件，让其能够生长花粉管，根据萌发比率来测定花粉活力，是可靠、便捷的方法，这就是花粉的离体萌发法。已多有论文报道利用离体萌发法来测量北方观赏芍药品种的花粉活力，如《长期储藏芍药花粉生活力测定方法研究》、《不同花型芍药的花粉生活力测定和比较研究》、《培养基成分对芍药花粉萌发及花粉管生长的影响》、《三种贮藏温度条件下芍药花粉的储藏特性》、《不同条件下芍药花粉的贮藏寿命》、《芍药花粉超低温保存4年后的生活力检测》、《芍药花粉离体萌发培养基组分的优化》等。这些报道涉及到培养基的固态或液态形式、不同的成分配比等，但研究材料基本都是北方的观赏芍药品种，有关南方地区药用型芍药的花粉活力报道从未出现。
[0008] 申请人:通过花粉活力观测的实践发现，杭白芍花粉萌发的培养基成分配比和有效观测时间等，与传统的观赏芍药品种相比具有差异，且花粉在培养过程中存在着较为严重的下陷现象，这在以往的报道中未见到涉及。因此，建立一套适合杭白芍花粉活力测定的科学方法，具显著的理论和实践意义，可更好的推动浙江本土的药用杭白芍与北方观赏芍药品种的杂交育种工作，以求能够早日获得具备自主知识产权和浙江地域特色的观赏芍药新品种。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种测定杭白芍花粉活力的方法，可以快速、准确地测定杭白芍的花粉活力。
[0010]—种测定杭白苟花粉活力的方法,包括:收集杭白苟的花粉；将所述的花粉置于培养基的表面进行离体培养；离体培养结束后统计花粉萌发率；
[0011]所述培养基的组成为:鹿糖80?150g/L,硼酸15?30mg/L,琼脂8?10g/L ；
[0012]所述离体培养的时间为2.5?3.5h。
[0013]花粉的离体萌发法是测定花粉活力的有效方法，结果可重复性高，一般包括如下步骤:收集花粉，将花粉置于培养基上进行离体培养，在显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉萌发率。
[0014]花粉的萌发能力是反映花粉活力的指标之一，因花粉只有萌发并长出花粉管，才能穿过花柱，进入子房，完成受精作用。花粉的萌发能力通常以花粉萌发率来表示，通过统计花粉的萌发率可以测定花粉的活力。
[0015]离体培养的培养基、培养时间是影响测定准确率的主要因素，不同种、品种的植物，其花粉所适宜的培养基的成分往往差异很大，本发明培养基为固体培养基，有利于后续显微镜的观察，且由水、蔗糖、硼酸和琼脂组成。其中，蔗糖为花粉萌发的主要营养物质来源，硼酸则能够促进花粉的萌发和花粉管的持续伸长，而蔗糖和硼酸只有在适宜的浓度范围内，才能够使花粉良好的萌发。优选的，所述蔗糖的浓度为100g/L，所述硼酸的浓度为20g/L。
[0016]其次，本发明针对杭白芍的花粉在培养过程中存在的下陷现象，对离体培养的培养基中的琼脂含量以及培养时间进行控制，来提高花粉活力测定的准确性。所述离体培养的时间优选为3h，培养基中，所述琼脂的浓度优选为8g/L。另外，本发明的离体培养时间还兼顾了花粉萌发的群体效应，如果培养时间较短，则花粉萌发量少，不能够如实反映花粉活力。在本发明的离体培养时间内，杭白芍的花粉萌发率趋于稳定。此外本发明所述的杭白芍产自浙江省金华市磐安县。[0017]所述收集花粉的方法为:采集杭白芍的花药，置于干燥的器皿中干燥24?48小时，直至花粉完全开裂，然后收集花粉，其中，所述的花药最好取自内层花瓣略绽开、花药隐约可见时的杭白芍的花朵。
[0018]离体培养时，可将未凝固的培养基加入到凹形载玻片的球形凹面内，为对焦清晰，提高统计的准确性，应尽可能保持培养基的表面平整，待培养基凝固后，再将花粉接种至培养基的表面即可。
[0019]适宜的培养温度有利于杭白芍花粉快速的萌发，优选的，所述离体培养的温度为23?28 °C，更优选为25 °C。
[0020]在花粉的离体培养过程中，为了防止所述培养基中水分的蒸发影响花粉的萌发，离体培养时，保持环境的相对湿度为80%?85%，优选为80%。
[0021]花粉离体培养一段时间后，将负载花粉的载玻片置于显微镜下观察，以花粉管长度达到花粉粒直径的I倍及以上的花粉视为萌发，统计萌发率。所述的显微镜具体可采用Olympus BH-2荧光显微镜，更有利于统计杭白芍花粉的萌发率。
[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0023]本发明的方法测定结果稳定可靠，探明了杭白芍花粉萌发的较为适合的培养基、培养条件、培养时间、观测条件等，首次为供于制药的杭白芍提供了测定花粉活力的快速、可靠方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为适合采集杭白芍花粉、观测花粉活力时的花瓣张开程度。
[0025]图2为利用3种琼脂粉含量的培养基对杭白芍花粉进行培养，其花粉接种后随时间进程的萌发率变化图。
[0026]图3为杭白芍花粉接种后随时间进程的萌发图；
[0027]A:接种Ih后的花粉萌发情况；B:接种3h后的花粉萌发情况；
[0028]C:接种5h后的花粉萌发情况；D:接种6h后的花粉萌发情况。
[0029]图4为将杭白芍的花粉接种在用培养皿盛放的培养基上，在解剖镜下观测花粉萌发的图像；
[0030]A:培养皿底部没有垫黑布时的观测；B:培养皿底部垫有黑布时的观测。
[0031]图5为凹面载玻片的培养基上表面为平面和凸起球面时，杭白芍花粉萌发观测的对应图；
[0032]A:凹面载玻片上培养基为平面时的剖面图；B:凹面载玻片上培养基为凸起球面时的剖面图；C为A图情况下所对应的杭白芍花粉萌发观测图；D为B图情况下所对应的杭白芍花粉萌发观测图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合【具体实施方式】进一步阐释本发明。
[0034]I杭白芍花药的采集
[0035]选取植株健壮、无病虫害的杭白芍为采集对象(本试验所选择的杭白芍产地为浙江省金华市磐安县)，在其内层花瓣略微绽开、隐约可见内部金黄色花药时为采集时间(图I)。选择4月中下旬无风晴天上午9~10时采集花药，用尖嘴镊子夹紧若干雄蕊的花丝，取下花药，将花药放入硫酸纸袋内储存。
[0036]2花粉的干燥
[0037]将硫酸纸摊开置于干燥洁净的培养皿中，通过挤压将硫酸纸与培养皿内壁紧密接触。将花药均匀撒在硫酸纸上，避免花药之间的垛叠。将培养皿置于盛有变色硅胶的密封干燥器中，干燥24~48小时，花粉散出待用。
[0038]3花粉萌发培养基的建立
[0039]选择蔗糖100g/L和硼酸20mg/L，以蒸馏水作为溶剂。琼脂粉的使用量和无水氯化钙的使用与否，会在很大程度上影响萌发效果和观测，故需确立该二者的配比。
[0040]3.1琼脂粉使用量的选择
[0041]在培养基中分别加入琼脂粉5g/L、8g/L和10g/L，在后期的花粉萌发中发现:加5g/L琼脂粉的培养基质地较软，花粉粒在培养2.5h后开始下陷，花粉粒和花粉管均逐渐被培养基表层覆盖，导致花粉生活力还没有达到稳定值时，便已经看不清部分花粉萌发出的花粉管，从而使得花粉萌发率的统计值较真实值而偏小(图2)。
[0042]加8g/L和10g/L琼脂粉的培养基较为结实，可以将下陷时间延后至花粉接种的4h之后，从而使得花粉粒和花粉管在花粉萌发率较为稳定的3h左右可以保持清晰可辨，易于观测和计数(图3中B)。但在5h后，花粉粒和花粉管依旧会下陷，逐渐被培养基表层覆盖，看不清花粉管的萌发，较难观测；同时花粉管过长而出现盘结纠缠，已经不适宜于观测萌发率(图3中C);6h后花粉粒和 花粉管明显被培养基覆盖，仍然位于培养基表面的花粉管伸长更长，且部分花粉出现干缩缢裂，不适合观测(图3中D)。
[0043]因此，5g/L的琼脂粉用量过少，而加8g/L和10g/L琼脂粉是较为合适的，且二者的培养基在花粉下陷时间和程度上无明显差距。以节约为原则，选择8g/L的琼脂粉最合适。
[0044]3.2无水氯化钙的选择与否
[0045]部分研究表明，钙离子能够在一定程度上促进花粉管的萌发，故在一些植物的花粉活力测定的培养基中会加入钙离子，多为硝酸钙或氯化钙。在培养基中加入25mg/L的无水氯化钙和不加入氯化钙，对比结果发现:不加无水氯化钙的培养基中花粉具备较高且稳定的萌发率，为前述的63.301%。加入无水氯化钙的培养基中，花粉萌发率反而很低，即使在观测值最高的时刻，即接种后的3h，萌发率也仅为21.057%，其余时间均在20%以下(表1)。
[0046]表1钙离子的使用对杭白芍花粉萌发率的影响
[0047]
【权利要求】
1.一种测定杭白芍花粉活力的方法，包括:收集杭白芍的花粉；将所述的花粉置于培养基的表面进行离体培养；离体培养结束后统计花粉萌发率；其特征在于， 所述培养基的组成为:鹿糖80?150g/L,硼酸15?30mg/L,琼脂8?10g/L ； 所述离体培养的时间为2.5?3.5h。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杭白芍产自浙江省金华市磐安县。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为100g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硼酸的浓度为20mg/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琼脂的浓度为8g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，离体培养的温度为23?28°C。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，离体培养时，保持环境的相对湿度为80?85%。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离体培养的时间为3h。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基处于凹面载玻片的球形凹面内，所述培养基的上表面保持平整。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，统计花粉萌发率时，采用OlympusBH-2光学显微镜观察花粉萌发情况。
【文档编号】G01N21/84GK103837534SQ201410064915
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】夏宜平, 张佳平, 吴昀, 李丹青, 王冠群, 阮婷立 申请人:浙江大学