一种鸭新型黄病毒bydv抗体elisa检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒以鸭新型黄病毒BYDV全病毒作为抗原包被酶标板，提高了整个体系的反应效率。实验证实，若待检血清中存在BYDV抗体，则该抗体就会与包被的全病毒抗原发生充分结合，从而阻断了酶标二抗与抗原的反应，用该病毒作为抗原建立起来的ELISA方法反应迅速，结果直观，特别适用于临床上对这种鸭黄病毒血清抗体的快速检测。本发明提供的鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒操作简单，方便易行，适于推广应用。
【专利说明】—种鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学【技术领域】，具体涉及一种检测鸭新型黄病毒BYDV抗体的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]2010年4月以来，我国浙江、江苏、山东、河北、北京等省市先后发现以产蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征的疾病。该病的主要临床症状是各个日龄的产蛋鸭突然出现群体性产蛋下降，甚至绝产。产蛋鸭发病后出现长时间(40?60天)的产蛋率低下，恢复后所产种蛋的孵化率和受精率下降。由于继发感染、或者药物治疗和饲养管理等因素致死率达到1%?15%，部分鸭场产蛋鸭的死亡率达到20%。同时由于免疫系统的病变，继发细菌感染，商品肉鸭感染后出现最高约30?80%的死淘率，而且产品的合格率明显降低。据统计，此病已经给我国的养鸭业造成了数十亿元的直接经济损失。同时，由于种鸭发病，雏鸭供应急剧下降，导致雏鸭价格升至10元以上，在推高鸭蛋价格的同时，也推高了肉鸭的价格，给消费者和社会管理造成消费压力，对公众健康及畜牧业的发展也造成了严重的影响。
[0003]研究证实引起本病的病原属于黄病毒科中的成员，是在我国东南部地区新发现的一种虫媒性黄病毒属病毒，研究人员将其命名为白洋淀病毒(BYDV)。该病毒为单股正链RNA病毒，病毒大小为55nm。分析分离的毒株基因序列，结果显示毒株与坦布苏病毒同源性最高，故也将其称为鸭坦布苏病毒。由于黄病毒属病毒所致疾病通过蚊或蜱等吸血媒介传播，大多为人畜共患疾病，并缺乏有效的治疗、预防和控制措施，因而容易导致严重的公共卫生问题，因而对疾病的预防和控制工作提出了严峻的挑战。新分离到的这种鸭黄病毒或许对人或其他动物具有潜在危害，该病毒的研究工作对于公共卫生防控方面具有较为重要的意义。目前对于鸭群中黄病毒感染常用的检测方法包括中和实验、血凝抑制实验、补体结合实验、荧光定量PCR技术等，但这些方法检测周期长、操作繁琐、对实验条件要求严格，同时也不适用于临床的大规模检测。由于本发明中所研究的鸭新型黄病毒BYDV的感染属于新发传染病，对该病毒的生物学特性、致病机制等的研究尚处于起步阶段，目前仍缺少有效的疫苗免疫和预防控制措施，而迄今应用酶联免疫吸附实验对鸭黄病毒抗体进行检测的方法也少有报道，这就使得无法在最快的时间内对该病做出检测。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的缺陷，本发明的一个目的是利用该黄病毒和辣根标记的黄病毒属特异性结合单克隆抗体制备一种用于检测BYDV抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒为鸭新型黄病毒BYDV的检测提供了一套有效的工具。
[0005]本发明还提供了用于鸭新型黄病毒BYDV的制备及纯化方法，为鸭新型黄病毒BYDV抗体检测试剂盒提供包被抗原。
[0006]本发明的再一个目的是上述ELISA试剂盒在快速检测BYDV抗体上的应用。
[0007]为实现以上目的，该发明采用如下技术方案:[0008]一种鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒，包括鸭新型黄病毒BYDV的全病毒作为抗原包被的酶标板。
[0009]上述检测试剂盒还包括酶标记黄病毒属特异性结合单克隆抗体、标准阳性对照、标准阴性对照、洗涤液、样品稀释液、底物液和终止液中的一种或多种。
[0010]所述标准阳性对照为BYDV自然感染鸭阳性血清；所述标准阴性对照为正常鸭血清;所述洗涤液优选每升中含 NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO412Η202.9g，KC10.2g，Tween200.5mL ;所述样品稀释液为含5%脱脂奶粉的洗涤液；所述底物液包括底物液A液和B液，其中底物液A每升中含3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇IOOmL ;底物液B每升中含Na2HP0414.6g,柠檬酸9.3g, 0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL ;所述终止液为2mol/L硫酸溶液。所述酶标记黄病毒属特异性结合单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记黄病毒属特异性结合单克隆抗体，该株单克隆抗体是由保藏编号为ATCC HB112的杂交瘤细胞分泌的。所述的酶标板的抗原包被量优选为600ng/孔。
[0011]本发明ELISA检测试剂盒可用于快速检测BYDV抗体，在使用时可采用如下步骤:
[0012]I)加样:向酶标板微孔中加入用样品稀释液1:10倍稀释后的待检测血清样品100 μ 1，同时设阴性对照和阳性对照，37°C恒温孵育60min ；
[0013]2)洗涤:倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250 μ 1，洗涤3次并拍干；
[0014]3)加酶标抗体:每孔中加入酶标抗体工作液100 μ 1，37°C恒温孵育60min ；
[0015]4)洗涤:倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μ 1，洗涤3次并拍干；
[0016]5)加底物液:每孔中先加入底物液Α50μ 1，再加入底物液Β50μ 1，避光显色15min ；
[001 7] 6)加终止液:每孔中加入终止液50 μ I ;
[0018]7)测定:用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光光度值(0D450值)。
[0019]本发明还提供ELISA检测试剂盒的制备方法，包括酶标板包被抗原的制备，其步骤如下:
[0020]I) BYDV 的制备
[0021]取患病鸭的卵巢组织与脑组织，将组织匀浆处理后接种鸭胚进行传代，两代以后开始在BHK-21细胞上进行传代，细胞接种病毒后每天观察，待产生90%细胞病变后反复冻融三次，收集病毒液，并用噬斑计数法测定病毒毒价；
[0022]2) BYDV 的纯化
[0023]收获的病毒液经高速离心后获得上清，沉淀用部分上清重悬后超声裂解，裂解液再按上述方法高速离心，将两次的上清液混合后再次超速离心，沉淀中即含有待纯化病毒，将该沉淀用无菌PBS溶解并再次超声裂解后，获得了纯化的BYDV病毒，分装保存于_80°C。
[0024]本发明使用的是新分离的鸭新型黄病毒BYDV作为抗原包被酶标板，提高了整个体系的反应效率。实验证实，若待检血清中存在BYDV抗体，则该抗体就会与包被的全病毒抗原发生充分结合，从而阻断了酶标二抗与抗原的反应，用该病毒作为抗原建立起来的ELISA方法反应迅速，结果直观，特别适用于临床上对这种鸭黄病毒血清抗体的快速检测。
[0025]本发明使用了可以和黄病毒属病毒发生特异性反应的单克隆抗体作为第二抗体，经过辣根过氧化物酶标记后用于与本发明中包被的抗原特异性结合。实验结果表明，该酶标单抗与包被抗原具有较高的结合特性，从而大大提高了整个反应的敏感性和特异性。[0026]本发明构建了鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒，为BYDV的抗体检测奠定了一定的基础。目前，国内外还未发现快速、简便、有效的ELISA试剂盒可用于鸭新型黄病毒BYDV抗体水平的监测，本发明探索影响因素，摸索实验条件，建立了一种检测BYDV抗体的有效方法。而本发明制备的用于检测鸭新型黄病毒抗体的ELISA试剂盒，操作简便易行，检测快速敏感，同时不需要精密的仪器设备，是一种面向基层并适用于临床大批量检测的有效方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1:本发明血清最佳稀释浓度的确定，实线表示10份阳性血清，虚线表示5份阴性血清。
[0028]图2:本发明cut-off值的确定方法。
[0029]图3:本发明特异性交叉反应试验结果。
[0030]图4:本发明灵敏度检测结果。
【具体实施方式】
[0031]以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0032]实施例1鸭新型黄病毒BYDV的制备及纯化
[0033]1.BYDV病毒的制备
[0034]取患病鸭的卵巢组织与脑组织，将组织匀浆处理后，8000r/min, 4°C离心lOmin，取上清，分别用0.45 μ m和0.22 μ m的滤器过滤除菌,滤液接种鸭胚(购自北京三江宏利种鸭有限公司)后进行传代，连续接种两代后收集尿囊液，10倍稀释后开始在BHK-21细胞上进行传代。接种病毒后每天观察细胞状态，待产生90%细胞病变后将细胞冻于_80°C冰箱内，并反复冻融三次，收集病毒液，采用噬斑计数法测得该病毒毒价为8.5X106pfu/m, _20°C保存。
[0035]2.BYDV 的纯化
[0036]收获的病毒液经4°C，IOOOOrpm高速离心45min，取上清，沉淀用部分上清重悬后超声裂解(100W，3%，超声5s，间隔10s，总时间3min)，裂解液再按上述方法高速离心。混合的总上清以4 °C，40000超速离心2.5h，将沉淀溶于适当的灭菌PBS中，再次超声裂解(100w，超声5s，间隔IOs)即获得了纯化病毒，以每管200 μ I的量分装，_80°C冻存。
[0037]使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)测定该纯化的病毒蛋白浓度，于560nm测吸光度,确定该病毒蛋白的浓度为1μ g/μ I。
[0038]实施例2鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测方法的建立
[0039]1.鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒最佳反应条件的确定
[0040]I)抗原最佳包被浓度和酶标单抗最佳工作浓度的确定
[0041]以纯化的BYD病毒为包被抗原，HRP标记的黄病毒属特异性结合单抗IgG为第二抗体，在酶标板上进行方阵滴定试验。用ΡΗ9.6的碳酸盐包被液将纯化后的BYD病毒倍比稀释至Ij 24 μ g/ml、12 μ g/ml、6 μ g/ml、3 μ g/mL、1.5 μ g/ml、0.75 μ g/ml 梯度，加入到 ELISA横向孔中，100 μ I/孔，4°C包被过夜。用含0.05%吐温-20的PBST缓冲液洗涤酶标板，洗涤3次，每次4min。洗涤后用含5%脱脂奶的包被液37°C封闭2h，再按上述方法洗涤。将酶标单抗倍比稀释为1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，纵向加入酶标板中，37 °C孵育Ih，洗涤后加入用磷酸盐配制的四甲基联苯胺底物，显色15min，读取OD45tl值。由表可以看出，当抗原浓度为6 μ g/ml，酶标单抗浓度为1:2000 (I μ g/ml)时，OD45tl值接近1，有一个较好的吸光度，而且比较节约抗原和单抗。结果如表1:
[0042]表1抗原浓度和酶标单抗工作浓度的确定
[0043]
【权利要求】
1.一种鸭新型黄病毒BYDV抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括鸭新型黄病毒BYDV的全病毒作为抗原包被的酶标板。
2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标记黄病毒属特异性结合单克隆抗体、标准阳性对照、标准阴性对照、洗涤液、样品稀释液、底物液或终止液中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性对照为BYDV自然感染鸭阳性血清；所述标准阴性对照为正常鸭血清；所述洗涤液每升中含NaC18.0g,KH2PO40.2g，Na2HP0412H202.9g，KC10.2g，Tween200.5mL ;所述样品稀释液为含 5% 脱脂奶粉的洗涤液；所述底物液包括底物液A液和B液，其中底物液A每升中含3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇IOOmL ;底物液B每升中含Na2HPO4H.6g，柠檬酸9.3g，0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL ;所述终止液为2mol/L硫酸溶液。
4.根据权利要求2或3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记黄病毒属特异性结合单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记黄病毒属特异性结合单克隆抗体。
5.根据权利要求1?3任一项所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标板的抗原包被量为600ng/孔。
【文档编号】G01N33/577GK103837682SQ201410072571
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】郑瑞峰, 苏敬良, 陈立本, 冯小宇, 章丽娇, 梅力, 靳换 申请人:北京市兽医实验诊断所