基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法

基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法
【专利摘要】基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法，属于分析化学【技术领域】；其特征在于利用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗的残留量；检测步骤包括：金纳米粒子（AuNPs）的制备；通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应；运用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗并进行实际样品的检测，该方法可简单、快速、灵敏的检测盐酸克伦特罗，并且有很高的灵敏度，为以后的研究、生产、监管等提供了方便。
【专利说明】基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法
【技术领域】
[0001]基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法，属于分析化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]盐酸克伦特罗又称“瘦肉精”，是一种中毒蓄积性平喘药，是肾上腺类神经兴奋剂。美国一家公司曾意外发现，盐酸克仑特罗可明显促进动物生长，并增加瘦肉率。这一新发现很快被一些国家用于养殖业，在饲料中添加盐酸克仑特罗后，可使猪等畜禽生长速率、饲料转化率、胴体瘦肉率提高。由于瘦肉的价格高于肥肉，养殖户便愿意使用瘦肉精来养殖生猪，以提高瘦肉率。
[0003]但是，如果含有“盐酸克伦特罗”的猪肉如果被人食用后，会有急性中毒症状，若不及时抢救有可能导致心率失常而猝死。
[0004]2011年3月，媒体曝光了双汇“瘦肉精”事件，河南省孟州市等地养猪场采用违禁动物药品“瘦肉精”饲养生猪，有毒猪肉流入济源双汇食品有限公司。事件经相关媒体曝光后，引发广泛关注。瘦肉精有着较强的毒性，长期使用有可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。
[0005]然而，早在2002年9月10日，农业部、卫生部、国家药品监督管理局发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》，盐酸克仑特罗等7种“瘦肉精”列为禁用药品。非法添加物严重影响了人类健康，这一事件的发生又一次敲响了重视食品安全的警钟。
[0006]目前，盐酸克伦特罗的检测手段主要包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、酶联免疫法(ELISA)等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测盐酸克伦特罗。

【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种基于荧光共振能量转移利用罗丹明B和金纳米粒子快速检测盐酸克伦特罗的方法，以快速、简单、灵敏的检测盐酸克伦特罗的残留量。
[0008]技术问题:基于荧光共振能量转移利用罗丹明B和金纳米粒子快速检测盐酸克伦特罗的方法基于以下原理:
[0009]金纳米粒子的最大吸收波长在522nm，其光谱较宽；在510nm激发下，罗丹明B的荧光发射波长在573nm，两者的光谱具有较好的重叠。罗丹明在510nm被激发后，可在573nm左右发射荧光。罗丹明B在pH小于6时带正电荷，而柠檬酸根修饰的金纳米粒子带负电荷，在金纳米粒子体系中加入罗丹明B时，罗丹明B和金纳米粒子之间的静电作用将两者间的距离拉近，罗丹明B发射的荧光被金纳米粒子吸收，能量从供体(罗丹明B)向受体(金纳米粒子)转移，实现了荧光猝灭。
[0010]当在体系中添加盐酸克伦特罗之后，研究发现盐酸克伦特罗对罗丹明B的荧光没有影响。但是，盐酸克伦特罗可以竞争性的与金纳米粒子结合，通过盐酸克伦特罗之间的氢键作用，使金纳米粒子发生团聚，干扰了罗丹明B和金纳米粒子之间的荧光共振能量转移，从而实现了罗丹明B的荧光恢复。
[0011]本发明的技术方案:
[0012]包括以下步骤:金纳米粒子(AuNPs)的制备；分别对AuNPs和AuNPs、盐酸克伦特罗体系进行透射电镜表征；通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应；运用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗并进行实际样品的检测。
[0013](I)金纳米粒子(AuNPs)的制备
[0014]制备时，向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入lmmol/L的氯金酸IOOmL，在磁力搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL，边加热边搅拌，待溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，4°C保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。
[0015](2)分别对AuNPs和AuNPs、盐酸克伦特罗体系进行透射电镜表征
[0016]①样品制备
[0017]吸取13nm金纳米粒子200yL，娃哈哈纯净水800yL于2mL离心管中，作为对照，另一离心管中分别吸取13nm金纳米粒子200 μ L，娃哈哈纯净水700 μ L和1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100μ L，在25°C下同时培养IOmin ;将两种样品分别滴于两个铜网上，室温晾干备用;
[0018]②参数
[0019]用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
[0020](3)通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应
[0021]取五个2.0mL的离心管，编号为a, b，c，d，e，分别依次加入，a管(0.4μΜ罗丹明Β20 μ L，980 μ L娃哈哈纯净水)，b管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，880 μ L娃哈哈纯净水)，c管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，680 μ L娃哈哈纯净水)，d管(1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，700 μ L娃哈哈纯净水)，e管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，780 μ L娃哈哈纯净水)，然后将混合物在25°C下培养lOmin，测紫外吸收图。
[0022]另取四个2.0mL的离心管，编号为a, b，c，d，分别依次加入，a管(0.4μΜ罗丹明Β20 μ L，980 μ L娃哈哈纯净水)，b管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，880 μ L娃哈哈纯净水)，c管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，680 μ L娃哈哈纯净水)，d管，(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，780 μ L娃哈哈纯净水)，然后将混合物在25°C下培养lOmin，测荧光吸收光谱。
[0023](4)检测盐酸克伦特罗所用体系的制备:
[0024]实验组中，向含有200 μ L13nm金纳米粒子(6.62nM，pH=6.5)的体系中，分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液，室温反应IOmin后，在体系中加入20 μ L0.4 μ M的罗丹明B;根据[(Fc1-FVFtl]与盐酸克伦特罗的浓度建立标准曲线。对照组中，不添加盐酸克伦特罗，其它试剂与实验组相同。
[0025]所用盐酸克伦特罗标准品的浓度依次为:0.2,0.4,0.6,0.8,1.1,1.4,1.5,1.8yg -1iir10本发明中，盐酸克伦特罗的检出限为3.96X 10_3 μ g/mL,线性范围为0.2 μ g/mT,-1.8 μ g/mL。
[0026](5)实际样品检测:取仔猪饲料进行实际样品检测。
[0027]称取Ig饲料加入25mL离心管中，加入3mL丙酮和lmol/L氢氧化钠混合溶液(体积比为9:1),超声5min,混合样品在IOOOOr, 5°C离心IOmin,重复3次,收集上清液,旋转蒸发至干，溶解在ImL娃哈哈纯净水中，再加入ImL正己烷除去脂肪，5°C，IOOOOr离心5min，剩余的水溶液用于分析。分析中，将提取的水溶液稀释20倍，等分为10份，如权利要求5所述的方法，加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液进行测定。
[0028]本发明的有益效果:
[0029]本发明制备了金纳米粒子，并建立了一个简单、快速、灵敏的基于荧光共振能量转移原理的方法，能够快速检测盐酸克伦特罗，为今后的监管提供了方便。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1透射电镜图:金纳米粒子；
[0031]图2透射电镜图:1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗与金纳米粒子的混合体系；
[0032]图3 不同体系的突光光谱图:a, RB; b; RB and clenbuterol; c, mixture ofRB-AuNPs and clenbuterol;d, RB and AuNPs0 RB, 0.4 μ M;AuNPs, 6.62nM;clenbuterol, 1.6 μ g.mL_1 ；
[0033]图4 不同体系的紫外吸收光谱图:a, RB;b, RB and clenbuterol; c, mixture ofRB-AuNPs and clenbuterol;d, AuNPs and clenbuterol;e, RB and AuNPs ;RB,0.4 μ M;AuNPs,6.62nM;clenbuterol, I μ g.mL1 ；
[0034]图5含有不同浓度的盐酸克伦特罗(0.2，(λ4，(λ6，(λ8，1.1,1.4,1.5,
1.8 μ g.mL—1)的RB-AuNPs体系的荧光光谱图以及以RB-AuNPs体系为参照的盐酸克伦特罗的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0035]金纳米粒子AuNPs的制备
[0036]材料/试剂:氯金酸和柠檬酸三钠购自北京化工厂。
[0037]方法:制备时，向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入lmmol/L的氯金酸IOOmL,在磁力搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL，边加热边搅拌，待溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，4 C保减。
[0038]结果:经透射电镜表征，所制得的金纳米粒子粒径为13nm，且分散性良好，粒径均匀。
[0039]由于实验所用的体系受到金纳米粒子浓度的影响，所以需要研究金纳米粒子浓度对反应体系的影响。
[0040]材料/试剂:13nm的金纳米粒子；罗丹明B购自生工生物(上海)公司。[0041]方法:取编号为a，b, c的三组洁净的2.0mL试管(每组10个)，每组试管编号依次为1-10，a组中分别依次加入5.0lnM的金纳米粒子200 μ L，再依次加入不同浓度的盐酸克伦特罗(0.2,0.4,0.6,0.8，1.1，1.4，1.5，1.8,2,2.3μ g.mL-1) 100 μ L，将混合物在 25。。下培养lOmin，然后，再依次加入0.4μΜ RB20 μ L，并用娃哈哈纯净水将体系稀释到lmL，测荧光光谱图；b组中所用金纳米粒子的浓度为6.62nM，c组为7.82nM，其它操作同a组。
[0042]结果:结果表明，体系中选用金纳米粒子浓度6.62nM为最佳。
[0043]该方法用于盐酸克伦特罗检测
[0044]材料/试剂:13nm的金纳米粒子；罗丹明B购自生工生物(上海)公司；宰猪饲料购自于当地市场。
[0045]方法:
[0046](I)金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗:向含有200μ L13nm金纳米粒子(6.62nM，pH=6.5)的体系中，分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液，室温反应10min后，在体系中加入20 μ L0.4 μ M的罗丹明B，罗丹明B的荧光强度抑制程度将随着盐酸克伦特罗浓度的不同而不同。
[0047](2)所用盐酸克伦特罗标准品的浓度依次为:0.2,0.4,0.6,0.8,1.1,1.4,1.5,1.8yg.πι?Λ通过测定对照组和实验组的荧光光谱，计算(Ftl-F)AV其中，F0为对照组的荧光值，F为加入盐酸克伦特罗之后的荧光值。
[0048](3)实际样品检测:取仔猪饲料进行实际样品检测。
[0049]称取Ig饲料加入25mL离心管中，加入3mL丙酮和lmol/L氢氧化钠混合溶液(体积比为9:1),超声5min,混合样品在1000Or, 5°C离心IOmin,重复3次,收集上清液,旋转蒸发至干，溶解在ImL娃哈哈纯净水中，再加入ImL正己烷除去脂肪，5°C，1000Or离心5min，剩余的水溶液用于分析。分析中，将提取的水溶液稀释20倍，等分为10份，如权利要求5所述的方法，加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液进行测定。
[0050]结果:根据[(Ftl-FVFci]与盐酸克伦特罗的浓度建立标准曲线，盐酸克伦特罗的检出限为3.96 X 10_3 μ g/mL,线性范围为0.2 μ g/mL-1.8 μ g/mL,加标回收试验结果见下表。
[0051]
【权利要求】
1.基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法，其特征在于利用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗的残留量，包括以下步骤:金纳米粒子(AuNPs)的制备；通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应；运用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗并进行实际样品的检测。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述金纳米粒子(AuNPs)的制备和透射电镜表征步骤如下: 制备时，向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入lmmol/L的氯金酸IOOmL,在磁力搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL，边加热边搅拌，待溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，4°C保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm ； ①样品制备 吸取13nm金纳米粒子200 μ L，娃哈哈纯净水800 μ L于2mL离心管中，作为对照，另一离心管中分别吸取13nm金纳米粒子200 μ L，娃哈哈纯净水700 μ L和1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗10(^匕在251:下同时培养IOmin ;将两种样品分别滴于两个铜网上，室温晾干备用； ②参数 用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
3.如权利要求1所述的方 法，其中所述通过测定紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应的步骤如下: 取五个2.0mL的离心管，编号为a，b，c，d，e，分别依次加入，a管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，980 μ L娃哈哈纯净水)，b管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，880 μ L娃哈哈纯净水)，C管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，680 μ L娃哈哈纯净水)，d管(1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，700 μ L娃哈哈纯净水)，e管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，780 μ L娃哈哈纯净水)，然后将混合物在25°C下培养lOmin，测紫外吸收图。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述通过测定荧光光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应的步骤如下: 取四个2.0mL的离心管，编号为a, b, c, d，分别依次加入，a管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，980 μ L娃哈哈纯净水)，b管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，880 μ L娃哈哈纯净水)，c管(0.4 μ M罗丹明Β20 μ L，1.6 μ g/mL的盐酸克伦特罗100 μ L，13nm的金纳米粒子200 μ L，680 μ L娃哈哈纯净水)，d管(0.4μΜ罗丹明B20yL，13nm的金纳米粒子200 μ L，780 μ L娃哈哈纯净水)，然后将混合物在25°C下培养lOmin，测荧光吸收光谱。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗的步骤如下: 向含有200yL13nm金纳米粒子(6.62nM, pH=6.5)的体系中，分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液，室温反应10min后，在体系中加入20 μ L0.4 μ M的罗丹明B，罗丹明B的荧光强度抑制程度将随着盐酸克伦特罗浓度的不同而不同。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述实际样品的检测是取仔猪饲料进行的:称取1g饲料加入25mL离心管中，加入3mL丙酮和lmol/L氢氧化钠混合溶液(体积比为9:1)，超声5min,混合样品在10000r, 5°C离心10min,重复3次,收集上清液,旋转蒸发至干,溶解在1mL娃哈哈纯净水中，再加入ImL正己烷除去脂肪，5°C，10000r离心5min，剩余的水溶液用于分析；分析中，将提取的水溶液稀释20倍，等分为10份，如权利要求5所述的方法，加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液进行测定；根据[(Fc1-FVFtl]与盐酸克伦特罗的浓度建立标准曲线，盐酸克伦特罗的检出限为3.96X 10_3 μ g/mL,线性范围为0.2 μ g/mL-1.8 μ g/mL0
【文档编号】G01N21/64GK103808704SQ201410088724
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】孙春燕, 许景月, 李莹, 郭佳佳, 曹先一, 罗叶丽, 沈斐 申请人:吉林大学