一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法
【专利摘要】一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入的卷烟烟气细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：1）溶液的配制，2）细胞接种，3）卷烟烟气染毒及BrdU掺入，4）BrdU掺入量的测定，5）结果与分析。本发明具有以下特点：（1）本发明通过烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液的制备，可分别考察烟气粒相物、气相物的细胞毒性。（2）通过细胞适用性验证步骤，本发明可能适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察卷烟烟气对不同细胞系的细胞增殖毒性。（3）通过BrdU掺入时间和细胞膜通透液浓度的优化提高检测灵敏度。（4）并通过卷烟烟气染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
【专利说明】一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法【技术领域】
[0001]本发明涉及卷烟烟气体外细胞毒性的测定，具体说是基于溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入原理分析卷烟烟气粒相物或气相物染毒后细胞增殖毒性的定量测定方法。
【背景技术】
[0002]开展体外毒理学实验是评价吸烟对健康危害的重要方法。其中，细胞毒性在包括癌症、炎症等许多病理过程中起到重要作用，细胞毒性试验是了解化合物与细胞和组织之间作用机理的重要途径。如何科学准确地评价卷烟产品以及烟草添加剂的危害性，目前国际上还没有统一的方法和程序。检测细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示卷烟烟气细胞毒性的作用机理。
[0003]细胞增殖周期包括G1、S、G2、M四个时期，其中S期是DNA合成期。BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物(其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替)，当细胞处于DNA合成期时，BrdU可通过与胸腺嘧啶竞争，掺入新合成的DNA中。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU抗体的特异性识别进行检测。BrdU对细胞无明显毒性，可应用于细胞DNA合成和细胞增殖的跟踪检测。因此，通过检测细胞样本中的BrdU掺入量可考察化合物对细胞增殖的影响，定量评价不同化合物的细胞增殖毒性。
[0004]目前，进行卷烟烟气细胞毒性评价时采用的方法大多基于细胞存活率测定的原理，考察卷烟烟气染毒对细胞增殖毒性的影响还研究较少，亟需建立基于BrdU掺入的卷烟烟气细胞增殖毒性评价方法，定量准确评价卷烟烟气粒相物和的细胞毒性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，并基于BrdU掺入原理，建立的一种卷烟烟气体外细胞增殖毒性的测定方法。当细胞处于DNA合成期时，BrdU可通过与胸腺嘧啶竞争，掺入新合成的DNA中。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU抗体的特异性识别进行检测。通过检测细胞样本中的BrdU掺入量可考察卷烟烟气的增殖毒性。该测定方法具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，是基于BrdU掺入原理，通过检测不同浓度卷烟烟气染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，利用BrdU抗体对掺入DNA的BrdU的特异性识别进行检测，进而考察评价卷烟烟气的增殖毒性，具体步骤如下:
I)溶剂的制备:
(I)磷酸盐缓冲液PBS:用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制(pH=6.7)； (2)封闭液:有PBS缓冲液配制1%BSA (质量百分比)作为封闭液；
(3)HRP酶标记的BrdU抗体:-20 °C保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制；
(4)细胞固定液:4%多聚甲醛或70%乙醇；
(5)2M的盐酸HCl溶液:使用去离子水配制2M的HCl溶液；
(6)细胞膜通透液:曲拉通100(Triton-100)，使用PBS溶液稀释配制；
(7)0.1M四硼酸钠(Na2B4O7):用PBS溶液配制；
(8)HRP酶显色底物:3，3’ μ，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液；
(9)卷烟烟气染毒溶液的制备:卷烟样品于温度(22±1)°C和相对湿度60%±3%条件下平衡48 h ;然后使用转盘式吸烟机抽吸卷烟，烟气总粒相物用剑桥滤片收集，根据烟气总粒相物质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，使用前在一 70 V以下储存；在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶(冰浴)中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与烟气粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过0.2 μ m的滤膜除菌后，得到最终浓度与烟气粒相物萃取液相当的烟气气相物吸收液，且必须在制备后半小时内使用。本发明中卷烟烟气染毒溶液可为烟气粒相物萃取液、烟气气相物吸收液，分别用于评价卷烟烟气粒相物、气相物成分的细胞毒性。
[0007](10)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml。
[0008]2)细胞样本的处理:
(1)细胞接种:选用贴壁细胞，向96孔板(除最外周36个孔)中分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100 μ I细胞悬液，于37 °C、5% C02条件下培养24 h ；
(2)卷烟烟气染毒及BrdU掺入:细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为空白对照组和卷烟烟气染毒组，空白对照组中每孔加入100 μ I细胞培养基、卷烟烟气染毒组中每孔加入100 μ I卷烟烟气染毒溶液，于37 °C、5%CO2条件下培养22 h，每孔加入10 μ I的BrdU染料，继续孵育2h ；
(3)BrdU掺入量的测定:
a、吸除培养板中的溶液，每孔加入100μ I的4%多聚甲醛或70%乙醇，于室温下固定20-30分钟；
b、吸除溶液后，每孔使用200μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
C、每孔加入100 μ I的2MHC1，室温下放置15分钟；
d、每孔使用200μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
e、每孔加入100μ I 0.1M四硼酸钠(Na2B4O7),室温下放置15分钟；
f、每孔使用200μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
g、每孔加入100μ I的0.l%Triton 100溶液进行细胞膜通透,反应l_2min ；
h、为减少抗体的非特异性吸附,每孔加入100μ I的1%BSA中封闭lh，
1、每孔加入100μ I的HRP酶标记的BrdU抗体，4度过夜；
j、每孔使用200 μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
k、加入HRP酶常用TMB显色底物进行显色反应，并在450nm处检测相应吸光度值。
[0009](4)数据处理 吸光值 A:A = A450 nmA g自5(?!! =6个平彳丁孔的吸光度平均值 Am =6个平行孔的吸光度平均值
细胞增殖抑制率(％)= 1-A染毒组/ A空自对照组。
[0010]在本发明中，所述贴壁细胞为中国仓鼠卵巢细胞CH0、人肺癌细胞A549或人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞。由于不同细胞系的增殖速率不同，对不同种类细胞系的细胞接种密度进行了优化。CHO细胞和A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。实验前需开展所用细胞系的非特异性吸附背景测试，判断该细胞系是否可用于基于BrdU掺入的细胞增殖毒性评价实验。
[0011]开展细胞毒性评价前，需对所用细胞株的适用性进行评价，细胞非特异性吸附的吸光度值应小于等于0.2。评价的具体方法为:向96孔板中分别接种最佳接种密度的100 μ I细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。然后按照BrdU掺入量的测定步骤进行实验，最后使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光值，当吸光度值小于等于0.2时，证明细胞对BrdU抗体的非特异性吸附较小，可以进行基于BrdU掺入的细胞增殖毒性评价实验。若吸光度值高于0.2时，证明细胞本身非特异性吸附BrdU抗体，会引起较高的检测背景，不适用于基于BrdU掺入的细胞增殖毒性评价实验。
[0012]本发明中，需要使用BrdU抗体对细胞中掺入BrdU进行特异性识别，由于抗体大分子难以穿透细胞膜，因此需要使用细胞膜通透液提高细胞膜通透程度，对细胞膜通透液的浓度进行了优化。采用100 μ g/ml卷烟样品I粒相物萃取液对CHO细胞染毒22h，BrdU掺入时间2h，然后在BrdU掺入量测定步骤中选择不同浓度的Triton 100进行细胞膜通透。如图2所知，当通透液浓度低于0.5%时，细胞膜通透程度差，影响抗体大分子进入细胞与目标物结合，检测信号较低。当Triton 100的浓度高于0.5%时，影响了细胞形态，导致检测信号的降低。因此，本发明中选择细胞膜通透液Triton 100的浓度为0.5%。
[0013]对BrdU掺入时间进行优化，如图3可知，当BrdU掺入时间为Ih时，细胞中BrdU掺入量较少，响应信号较低。当BrdU掺入时间为2h时，不同染毒浓度下细胞中BrdU的掺入量有明显的剂量效应关系。而当BrdU掺入时间为4h以上时，由于细胞增殖时间较长，不同染毒浓度下细胞中BrdU掺入量增加，响应信号均有所提高，但不同染毒浓度间剂量效应关系变差。因此，本发明选择BrdU掺入时间为2h。
[0014]为得到卷烟烟气细胞增殖毒性的剂量-效应曲线，本发明中对卷烟烟气的染毒浓度进行了优化，图4所示为CHO细胞分别用卷烟样品I的烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液染毒所得到的剂量效应曲线，如图可知，当烟气粒相物萃取液染毒浓度为50 μ g/ml-250 μ g/ml时，烟气粒相物对CHO细胞的细胞增殖抑制率由低到高，当烟气气相物吸收液染毒浓度为100 μ g/ml-400 μ g/ml时，卷烟烟气粒相物对CHO细胞的细胞增殖抑制率由低到高，有很好的剂量效应关系，因此考察烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液细胞增殖毒性浓度的染毒区间应分别包括50 μ g/ml-250 μ g/ml和100 μ g/ml-400 μ g/ml范围。
[0015]本发明建立了一种基于BrdU掺入的卷烟烟气细胞增殖毒性评价方法，根据细胞DNA合成的BrdU掺入量，准确定量评价卷烟烟气的细胞增殖毒性。本发明具有以下特点:
(I)通过烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液的制备，可分别考察烟气粒相物、气相物的细胞毒性。(2)通过细胞适用性验证步骤，本发明可能适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察卷烟烟气对不同细胞系的细胞毒性。(3)通过BrdU掺入时间和细胞膜通透液浓度的优化提高检测灵敏度。(4)并通过卷烟烟气染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1.本发明分析方法流程图。
[0017]图2.细胞膜通透液Triton 100的浓度优化。
[0018]图3.不同BrdU掺入时间下卷烟烟气细胞毒性的剂量-效应关系曲线。
[0019]图4.烟气染毒溶液浓度优化。
[0020]图5.卷烟样品2粒相物对A549细胞增殖毒性的剂量-效应关系曲线。
【具体实施方式】
[0021]本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0022]为考察卷烟样品2烟气粒相物染毒对A549细胞的细胞增殖毒性，开展以下实验: 一、溶液配制
(I)卷烟烟气染毒溶液:
采用转盘式20H型吸烟机(德国，Borgwaldt公司)对卷烟样品进行抽吸，抽吸模式参照ISO的要求，用剑桥滤片捕集卷烟的粒相物成分。通过20支卷烟的抽吸共捕集到烟气粒相物182mg，取出剑桥滤片后加入18.2mL的二甲亚砜(DMS0)，震荡萃取半小时，得到最终浓度为10 mg/mL的烟气粒相物萃取液。用细胞培养液稀释，配制一系列不同浓度的烟气染毒溶液。
[0023](2)磷酸盐缓冲液PBS:用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制(ρΗ=6.7)。
[0024](3)封闭液:有PBS缓冲液配制1% BSA (质量百分比)作为封闭液。
[0025](4)HRP酶标记的BrdU抗体:_20 °C保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制，可按照抗体说明书的推荐浓度使用。
[0026](5)细胞固定液:4%多聚甲醛或70%乙醇。
[0027](6) 2M的盐酸HCl溶液:使用去离子水配制2M的HCl溶液。
[0028](7)细胞膜通透液:0.5%曲拉通100 (Triton-1OO)0使用PBS溶液稀释配制。
[0029](8)0.1M四硼酸钠(Na2B4O7):用PBS溶液配制。
[0030](9) HRP酶显色底物:3，3’，5，5’_四甲基联苯胺(TMB )溶液。
[0031](10)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml。
[0032]二、细胞样本处理
首先向细胞培养板中接种A549细胞，最佳接种密度为10000个/孔，设置6平行。将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时，不进行卷烟烟气染毒步骤，直接开展BrdU掺入量的测定，检测得到A450nm吸光度值为0.09，证明该细胞系不会对BrdU抗体产生非特异性吸附，适合用于评价卷烟烟气的细胞增殖毒性。
[0033]经扩增培养的A549细胞进行消化以后，制备细胞悬液(IXlO5个/ml)。96孔板的每孔(除最外周36个孔)加入100 μ I细胞悬液，接种密度为10000个/孔，于37 °C、5%CO2条件下培养24 h。细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为空白对照组、8个不同剂量(25，50，100，125，150，175，200，250 μ g/ml)的烟气粒相物萃取液染毒组，空白对照组每孔分别加入100 μ I细胞培养基、烟气染毒组每孔加入100 μ I卷烟烟气粒相物染毒溶液。最外周36个孔中，选择6孔加入100 μ I细胞培养基作为培养基对照。于37 °C、5% CO2条件下培养22h。然后每孔加入10μ I的BrdU染液，继续于37 °C、5% CO2条件下培养2h后，进行BrdU掺入量的测量。根据450nm处的吸光度值，计算卷烟烟气染毒对A549细胞的增殖抑制率。
[0034]图5所示为卷烟样品2粒相物染毒浓度与细胞增殖抑制率之间的剂量效应关系。如图5可知，卷烟烟气粒相物染毒浓度与A549细胞增殖抑制率有很好的剂量效应关系，可通过公式计算IC50值。
【权利要求】
1.一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于:该方法是基于BrdU掺入原理，通过检测不同浓度卷烟烟气染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，利用BrdU抗体对掺入DNA的BrdU的特异性识别进行检测，进而考察评价卷烟烟气的增殖毒性，具体步骤如下: 1)溶液的制备: (1)磷酸盐缓冲液PBS:用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制(pH=6.7)； (2)封闭液:有PBS缓冲液配制1%BSA (质量百分比)作为封闭液； (3)HRP酶标记的BrdU抗体:-20 °C保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制； (4)细胞固定液:4%多聚甲醛或70%乙醇； (5)2M的盐酸HCl溶液:使用去离子水配制2M的HCl溶液； (6)细胞膜通透液:曲拉通100(Triton-100)，使用PBS溶液稀释配制； (7)0.1M四硼酸钠(Na2B407):用PBS溶液配制； (8)HRP酶显色底物:3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液； (9)卷烟烟气染毒溶液的制备:包括烟气粒相物萃取液、烟气气相物吸收液； (10)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L_谷氨酰胺的浓度为2 mM,青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml ； 2)细胞样本的处理: (1)细胞接种:选用贴壁细胞，向96孔板(除最外周36个孔)中分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100 μ I细胞悬液，于37 °C、5% C02条件下培养24 h ； (2)卷烟烟气染毒及BrdU掺入:细胞培养24h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为空白对照组和卷烟烟气染毒组，空白对照组中每孔加入100 μ I细胞培养基、卷烟烟气染毒组中每孔加入100 μ I卷烟烟气染毒溶液，于37 °C、5%C02条件下培养22 h，每孔加入10 μ I的BrdU染料，继续孵育； (3)BrdU掺入量的测定: a、吸除培养板中的溶液，每孔加入100μ I的4%多聚甲醛或70%乙醇，于室温下固定20-30分钟； b、吸除溶液后，每孔使用200μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟； C、每孔加入100 μ I的2MHC1，室温下放置15分钟； d、每孔使用200μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟； e、每孔加入100μ I 0.1M四硼酸钠(Na2B4O7),室温下放置15分钟； f、每孔使用200μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟； g、每孔加入100μ I的0.l%Triton 100溶液进行细胞膜通透,反应l_2min ； h、为减少抗体的非特异性吸附,每孔加入100μ I的1%BSA中封闭lh， 1、每孔加入100μ I的HRP酶标记的BrdU抗体，4度过夜； j、每孔使用200 μ I的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟； k、加入HRP酶常用TMB显色底物进行显色反应，并在450nm处检测相应吸光度值； (4)数据处理
吸光值 A:A = A450 nm A g自5(?!! =6个平彳丁 孔的吸光度平均值Am =6个平行孔的吸光度平均值 细胞增殖抑制率(％)= 1-A染毒组/ A空自对照组。
2.根据权利要求1所述的基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于:所述贴壁细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO、人肺癌细胞A549或人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞，CHO细胞和A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。
3.根据权利要求1所述的基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于:开展细胞毒性评价前，需对所用细胞株的适用性进行评价，细胞非特异性吸附的吸光度值应小于等于0.2。
4.根据权利要求1所述的基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于:所述卷烟烟气染毒组包括烟气粒相物萃取液染毒和烟气气相物吸收液染毒，烟气粒相物萃取液染毒和烟气气相物吸收液染毒的细胞增殖毒性浓度的染毒区间应分别包括 50 μ g/ml_ 250 μ g/ml 和 100 μ g/ml-400 μ g/ml 范围。
5.根据权利要求1所述的基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于=BrdU掺入后继续孵育2h。
6.根据权利要求1所述的基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于:细胞膜 通透液Triton 100的浓度为0.5%。
【文档编号】G01N33/53GK103808919SQ201410094987
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月16日 优先权日:2014年3月16日
【发明者】陈欢, 刘彤, 韩书磊, 吴帅宾, 付立伟, 张小涛, 石龙凯, 侯宏卫, 胡清源 申请人:国家烟草质量监督检验中心