适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种适合双向电泳的马尾松针叶总蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物（如色素、酚类、醌类等）成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析。本发明采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，该方法重复性和稳定性好，是良好的适用于针叶类植物总蛋白提取的分析的方法。
【专利说明】适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法。
【背景技术】
[0002]马尾松(Pinus massoniana),属于松科松亚属针叶树种，是我国南方重要的脂材两用树种，它用途广泛、经济价值高，是我国林浆纸(板)、松脂和建筑等行业的主要原料树种。其生长迅速，生产力高，适应性强，遍布于华中华南各地。但近年来，由于氮氧化物的过度排放，导致大气污染严重。这些物质在大气中氧化并随降水返回地面形成酸沉降导致马尾松冠层针叶脱落，从而进一步给马尾松林带来严重破坏。为了弄清酸性沉降危害马尾松的破坏机理，需要提取其针叶中的蛋白分析酸性沉降对其针叶细胞蛋白表达变化的影响情况。而作为高大乔木类树种，其针叶中含有大量核酸、多糖、多酚等次生代谢干扰物质，应用文献报道的蛋白提取方法不能有效的去除这些物质。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，建立适用于马尾松蛋白质组分有效分离、分析的方法，能对马尾松针叶的总蛋白质进行分离，该方法为马尾松植物及其他松柏科裸子植物材料蛋白质组学研究提供实验基础和参考。
[0004]本发明的技术解决方案是:首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物(如色素、酚类、醌类等)成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析；该提取方法具体包括以下步骤:
(1)采集马尾松针叶，用超纯水洗净，并用滤纸吸去叶面水分，迅速放入液氮中速冻，并移至-80°c冰箱保存备用；
(2)称取2g上述步骤保存的马尾松叶片迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中按1:2的质量体积比加入提取缓冲液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成匀浆液；所用提取缓冲液组成为:20 mM (m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5),250 mM蔗糖，10mM EDTA, I mM苯甲基磺酰氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT (使用前加入)，I% v/v Triton X-100 ；
(3)研磨后的匀浆液装入50ml_20°C预冷离心管中，加入同体积的ρΗ7.5的Tris-HCl饱和酹(酹提取蛋白)，放入振荡器中振荡15-30 min后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min ,取酹相；
(4)步骤(3)酚相中加入3倍体积的醋酸铵(溶剂为甲醇)，放入_20°C冰箱沉淀过夜；
(5)步骤(4)的过夜物-4°C低温离心机15000rpm离心15min,取沉淀；
(6)洗涤步骤(5)沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮(均在-20°C冰箱预冷使用，含有质量体积比为0.07%的二硫苏糖醇(DTT))，每次洗完后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min，获得沉淀，将蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪真空冷冻干燥，得到马尾松针叶全蛋白粉末，备用；
(7)步骤(6)蛋白干粉在4°C按mg蛋白400μ L裂解液的质量体积比加入裂解液裂解样品，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶10分钟，-4°C 15000 rpm离心30 min去除沉淀，得到蛋白质提取液，取上清液测量样品蛋白浓度；采用考马斯亮兰法(Bradford)测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；现用现配的裂解液由如下试剂构成-J M尿素，2 M硫脲，4% w/V 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)，2% v/v两性电解质所用的载体两性电解质为 carrier ampholytes, GE), 1% w/v DTT (使用前加入),0.5% v/v IPG 缓冲液，溶剂为水；
(8)取步骤(7)的蛋白质提取液进行第一向等电聚焦电泳:按上样量500yg，上样体积450μ1，用水化液对已定量好的蛋白样品进行稀释；将蛋白样品加入水化盘内后，再将线性 IPG 胶条(pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用IOml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；等电聚焦的参数设置如下:30伏水化，10小时；200伏(升压模式为step-n-hold), I小时；500伏(升压模式为step-n-hold), I小时；1000伏(升压模式为st印-n-hold)，l小时；8000伏(升压模式为gradiet)，4小时；8000伏(升压模式为step-n-hold),60000Vh ；500 伏(升压模式为 step-n-hold,保持)；
(9)胶条平衡处理:将步骤(8)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，第一次胶条平衡缓冲液为:每Iml胶条平衡缓冲液母液加入IOmg 二硫苏糖醇(DTT);第二次胶条平衡缓冲液为:每Iml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；每次平衡时间为15min ；二次平衡缓冲液配制如下:胶条平衡缓冲液母液:6mol/L的尿素，质量体积比2.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)，50 mmol/L的Tris-HCl (pH为6.8)，体积比30%的甘油，溶剂为水；
(10)第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳:将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶(15%分离胶，4%浓缩胶)的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封(避免产生气泡)，加入电极缓冲液(含0.001%溴酚蓝显色剂)进行SDS - PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源；
(11)电泳结束后对胶条采用考马斯亮蓝(CBBR-250)染色法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测:电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30 min;固定好的凝胶置于CBB R-250染色液中，室温下染色3小时以上；倒出染色液,加入脱色液进行脱色；15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行；固定液配方:40% v/v乙醇，10% v/v冰乙酸，溶剂为水；染色液考马斯亮蓝CBB R-250配方:0.116% w/v考马斯亮蓝(CBB)R-250，25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶剂为水；脱色液配方:25% v/v乙醇，8% v/V冰乙酸，溶剂为水。
[0005]本发明具有以下优点:
1、在马尾松针叶总蛋白提取过程中，本发明经过大量实验研究，对提取缓冲液、样品洗涤液和裂解液的组成及配比进行大量筛选，以叶片总蛋白的提取率和总蛋白中各蛋白的提取完整性为指标进行筛选，优化得到最佳配比的提取缓冲液、样品洗涤液和裂解液，采用本发明提取缓冲液液、样品洗涤液和裂解液对马尾松针叶总蛋白的提取率高，且能保证各蛋白全部提出，为后续分析和鉴定蛋白质提供有利依据。
[0006]2、以上所述的马尾松针叶蛋白质的提取和双向电泳分析方法，步骤(11)所述的质谱检测和分析，米用E1-MS或MS-MS串联质谱法分析。
[0007]3、以上所述的马尾松针叶蛋白质的提取和双向电泳分析方法中，整个过程的溶液配制用超纯水，实验过程所需的二硫叔糖醇和碘乙酰胺均需现用现加。
[0008]4、本发明所述的马尾松针叶蛋白质的提取和双向电泳分析方法，经过大量实验筛选，首先可以高效的将针叶中的蛋白质提取出来，然后根据松科植物中所含化合物的特点，在大量实验优选条件下，采用双向电泳方法不仅能将蛋白质和次生代谢物(如:色素、酚类、醌类等)成分进行分离，而且能将针叶中各蛋白质成分进行分离，实验结果表明，本发明采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经TOQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，重复性好，可在马尾松针叶蛋白质组学中直接运用，并且本发明再对分离的蛋白质采用考马斯亮蓝染色法定性分析和/或采用质谱仪对蛋白质进行定性和定量分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为实施例中温室培养2年生马尾松针叶总蛋白质双向电泳图谱。
[0010]图2为实施例中鼎湖山保护区成年植株马尾松针叶总蛋白质双向电泳图谱。
【具体实施方式】
[0011]根据下述实施例，可以更好地理解本发明的技术解决方案。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0012]以下实施例所用的离心机为高速冷冻离心机(Beckman)、双向电泳为双向电泳Ettan2~2A (GE Healthcare)。
[0013]实施例1:马尾松针叶总蛋白质的提取和双向电泳分析方法具体包括以下步骤:
(1)采集马尾松针叶，用超纯水洗净，并用滤纸吸去叶面水分，放入液氮中速冻，并移至-80°c冰箱保存备用；
(2)称取2g上述步骤保存的马尾松叶片迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入4ml提取缓冲液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成匀浆液；提取缓冲液组成为:20 mM(m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5) ,250 mM蔗糖，10 mM EDTA，I mM 苯甲基磺酰氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT (使用前加入)，I % v/v Triton X-100 ；
(3)研磨后的匀浆液装入50ml_20°C预冷离心管中，加入同体积的ρΗ7.5的Tris-HCl饱和酹(酹提取蛋白)，放入振荡器入振荡15-30 min后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min ,取酹相；
(4)步骤(3)的酚相中加入3倍体积的醋酸铵(溶剂为甲醇)，放入_20°C冰箱沉淀过夜；
(5)步骤(3)的过夜物-4°C低温离心机15000rpm离心15min,取沉淀；
(6)洗涤步骤(5)沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮(均在_20°C冰箱预冷使用，含有质量体积比为0.07%的二硫苏糖醇(DTT))，每次洗完后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min，获得沉淀，将蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪真空冷冻干燥，得到马尾松针叶全蛋白粉末，备用；
(7)步骤(6)的蛋白干粉在4°C按每mg蛋白400μ L裂解液的质量体积比加入裂解液裂解样品，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶后10分钟，_4°C下15000 rpm离心30 min去除沉淀，得到蛋白质提取液，取上清测量样品蛋白浓度；采用考马斯亮兰法(Bradford)测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；现用现配裂解液由如下试剂构成:7 M尿素，2 M硫脲，4% w/v 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)，2% v/v两性电解质所用的载体两性电解质为carrier ampholytes, GE, 1% w/v DTT (使用前加入),0.5% v/vIPG缓冲液，溶剂为水；
(8)取步骤(7)得到的蛋白质提取液进行第一向等电聚焦电泳:按上样量500yg，上样体积450μ1，用水化液对已定量好的蛋白样品进行稀释；将蛋白样品加入水化盘内后，再将线性 IPG 胶条(pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用IOml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；等电聚焦的参数设置如下:30伏水化，10小时；200伏(升压模式为step-n-hold), I小时；500伏(升压模式为step-n-hold), I小时；1000伏(升压模式为st印-n-hold)，l小时；8000伏(升压模式为gradiet)，4小时；8000伏(升压模式% step-n-hold),60000Vh ；500 伏(升压模式为 step-n-hold,保持)；
(9)胶条平衡处理:将步骤(8)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，第一次胶条平衡缓冲液为:每Iml胶条平衡缓冲液母液加入IOmg 二硫苏糖醇(DTT);第二次胶条平衡缓冲液为:每Iml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；每次平衡时间为15min ；二次平衡缓冲液配制如下:胶条平衡缓冲液母液:6mol/L的尿素，质量体积比2.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)，50 mmol/L的Tris-HCl (优选pH为6.8)，体积比30%甘油，溶剂为水；
(10)第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳:将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶(15%分离胶，4%浓缩胶)的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封(避免产生气泡)，加入电极缓冲液(含0.001%溴酚蓝显色剂)进行SDS - PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源；
(11)电泳结束后对胶条采用考马斯亮蓝(CBBR-250)染色法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测:电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30 min;固定好的凝胶置于CBB R-250染色液中，室温下染色3小时以上；倒出染色液(可以回收利用3次以上)，加入脱色液进行脱色；15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行；固定液配方:40% v/v乙醇，10% v/v冰乙酸，溶剂为水；染色液考马斯亮蓝CBB R-250配方:0.116% w/v考马斯亮蓝(CBB) R-250，25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶剂为水；脱色液配方:25% v/v乙醇,8% v/v冰乙酸,溶剂为水。
[0014]通过上述方法对温室内培养的2年生马尾松针叶总蛋白质及鼎湖山地区多年生成年马尾松针叶都进行提取和双向电泳分离，具体结果如图1和图2所示，该图表明无论幼年苗木还是成年植株，其总蛋白质样品分离效果均很好，图谱清晰，蛋白点多，无横向、纵向条纹，经I3DQuest软件点检测和分析，蛋白点多于1000个。[0015]以上实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本
【发明内容】
并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析；其特征在于包括以下具体步骤: (1)采集马尾松针叶，用超纯水洗净，并用滤纸吸去叶面水分，迅速放入液氮中速冻，并移至-80°C冰箱保存备用； (2)称取2g上述步骤保存的马尾松叶片迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中按1:2质量体积比加入提取缓冲液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成匀浆液； (3)研磨后的匀浆液装入50ml_20°C预冷离心管中，加入同体积的pH7.5Tris_HCl饱和酹(酹提取蛋白)，放入振荡器入振荡15-30 min后,-4°C低温离心机15000rpm离心15min，取酚相； (4)步骤(3)酚相中加入3倍体积的醋酸铵(溶剂为甲醇)，放入_20°C冰箱沉淀过夜； (5)步骤(4)过夜物-4°C低温离心机15000rpm离心15min,取沉淀； (6)洗涤步骤(5)沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮(均在_20°C冰箱预冷使用，含有质量体积比为0.07%的二硫苏糖醇(DTT))，每次洗完后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min，获得沉淀，将蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪真空冷冻干燥，得到马尾松针叶全蛋白粉末，备用； (7)步骤(6)蛋白干粉在4°C按每mg蛋白400μ L裂解液的质量体积比加入裂解液裂解样品，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶后10分钟，-4°C下15000 rpm离心30 min去除沉淀，得到蛋白质提取液，取上清测量样品蛋白浓度；采用考马斯亮兰法(Bradford)测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量； (8)取步骤(7)得到的蛋白质提取液进行第一向等电聚焦电泳:按上样量500yg，上样体积450μ1，用水化液对已定量好的蛋白样品进行稀释；将蛋白样品加入水化盘内后，再将线性 IPG 胶条(选 pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用IOml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦； (9)胶条平衡处理:将步骤(8)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，第一次胶条平衡缓冲液为:每1ml胶条平衡缓冲液母液加入IOmg 二硫苏糖醇(DTT);第二次胶条平衡缓冲液为:每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；每次平衡时间为15min ； (10)第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳:将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶(15%分离胶，4%浓缩胶)的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封，加入电极缓冲液(含.0.001%溴酚蓝显色剂)进行SDS - PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源； (11)电泳结束后对胶条采用考马斯亮蓝(CBBR-250)染色法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测:电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30 min ;固定好的凝胶置于CBB R-250染色液中，室温下染色3小时以上；倒出染色液,加入脱色液进行脱色；15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。
2.根据权利要求1所述的适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，其特征在于:步骤(2)所述的提样缓冲溶液由下列物质组成:20 mM (m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5),.250 mM蔗糖，10 mM EDTA，I mM苯甲基磺酰氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT(使用前加入)，I % v/v Triton X-100质量体积比10%的三氯乙酸，其余溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，其特征在于:步骤(4)中沉淀清洗由预冷甲醇和丙酮共同完成，且体系中均含有质量体积比为0.07%的二硫叔糖醇(DTT)。
4.根据权利要求1所述的适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，其特征在于:步骤(8)所述的等电聚焦的参数设置如下:30伏水化，10小时；200伏(升压模式为step-n-hold), I小时；500伏(升压模式为step-n-hold), I小时；1000伏(升压模式为step-n-hold)，l小时；8000伏(升压模式为gradiet)，4小时；8000伏(升压模式为step-n-hold), 60000Vh ；500 伏(升压模式为 step-n-hold,保持)。
5.根据权利要求1所述的适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，其特征在于:步骤(10)中电极缓冲液配制方法如下:按质量体积比0.1%的十二烷基硫酸钠，.0.025mol/L的三羟甲基氨基甲烷，0.192mol/L的甘氨酸和0.001%溴酚蓝显色剂进行配制，溶剂为水，并调制pH值为8.3。
6.根据权利要求1所述的适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，其特征在于:步骤(8)中所述的考马斯亮蓝染色分析方法程序如下: 步骤a:电泳结束后凝胶条放入盛有超纯水的染色盘中，加入固定液进行固定，时间为.30 min;固定液配方:40% v/v 乙醇，10% v/v冰乙酸,溶剂为水； 步骤b:固定好的凝胶置于CBB R-250染色液中，室温下染色3小时以上，倒出染色液；染色液考马斯亮蓝CBB R-250配方:0.116% w/v考马斯亮蓝(CBB)R_250，25% v/v乙醇，8%v/v冰乙酸，溶剂为水； 步骤c:加入脱色液进行脱色，15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；脱色液配方:25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶剂为水；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。
【文档编号】G01N1/30GK103900881SQ201410127802
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】刘廷武, 徐建明, 罗玉明, 杨立明, 杨文杰 申请人:淮阴师范学院