一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白omp18的b细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及医学检测或疫苗研究领域，一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法是基于空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位筛选来进行的并包括如下步骤：(I)采用TMpred和TMHMM软件、采用ProDom和Pfam软件、采用BepiPred软件、采用DNASTAR软件进行分析；(II)采用clustalw软件进行OMP18基因核苷酸序列同源性比较；(III)采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗，基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行检测筛选鉴定，发现三个B细胞抗原表位都能有效结合空肠弯曲菌全菌抗体。本发明建立起了空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位筛选和鉴定方法，能为后续空肠弯曲菌感染的血清学方法建立及疫苗研发提供候选抗原。
【专利说明】—种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学检测或疫苗研究领域，特别是一种通过利用生物信息学技术了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的跨膜结构、基因序列保守性、B细胞抗原表位及其抗原性等特征，并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位，能用于空肠弯曲菌感染的检测诊断，以及为后续疫苗研究提供实验依据的一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法。
【背景技术】
[0002]空肠弯曲菌是引起人类急性腹泻常见的病原体之一，是全球范围内重要的食源性人兽共患病病原菌，其感染率在世界各地普遍呈上升趋势，引发的食品安全和食源性疾病问题也日益突出。空肠弯曲菌感染可引起人类急性肠炎和格林-巴利综合症等，还可感染动物导致牛和绵羊的流产，火鸡的肝炎和蓝冠病，雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病。人们需要快速准确地检测空肠弯曲菌以便及时控制该病的暴发流行。但由于空肠弯曲菌培养营养要求高，条件特殊，传统的检测方法费时费力，严重制约了人们对于空肠弯曲菌感染的防治。另外，空肠弯曲菌全菌苗及突变株菌苗对空肠弯曲菌提供的保护性效果有限且不安全，因此人们急需寻求一种新型、安全、有效的空肠弯曲菌亚单位疫苗，这对于预防空肠弯曲菌感染具有重要的现实意义。
[0003]无论是空肠弯曲菌感染的血清学检测，还是保护性疫苗研究，筛选出特异性的保护抗原是其前提和基础。空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18是由omplS基因编码的分子质量为ISkD的外膜蛋白，该蛋白在空肠弯曲菌中普遍存在，具有高度保守性、稳定性和特异性，是理想的空肠弯曲菌单克隆抗体的筛选抗原和疫苗候选抗原。抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答和发挥免疫效应。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供的一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法，就是基于对空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18进行结构和分子特征分析，通过筛选出空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18特异性B细胞抗原表位并进行功能鉴定，对于空肠弯曲菌抗体的特异性检测和疫苗研发提供候选抗原。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
[0006]所述一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法是基于空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选来进行的，并包括如下步骤:
[0007](I)采用TMpred和TMHMM软件预测0MP18蛋白的跨膜结构域、采用ProDom和Pfam软件预测蛋白的功能结构域、采用BepiPred软件预测0MP18蛋白的线性B细胞表位、采用DNASTAR软件对0MP18蛋白中存在的二级结构、亲水性和抗原性进行分析，结果表明外膜蛋白0MP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构，存在三个线性B细胞表位，且具有良好的亲水性和抗原性；
[0008](II)采用Clustalw软件进行0MP18基因核苷酸序列同源性比较，该基因序列仅保守存在于不同空肠弯曲菌菌株中，且序列高度同源，相似度达99% ；
[0009](III)采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗，基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行检测筛选鉴定，发现三个B细胞抗原表位都能有效结合空肠弯曲菌全菌抗体；
[0010]通过上述三个步骤，建立起空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选和鉴定方法，能为后续空肠弯曲菌感染的血清学方法建立及疫苗研发提供候选抗原。
[0011]本发明的有益效果是:
[0012]通过上述步骤及结果表明:所述一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法高效实用，作为一种新方法可操作性强，能完善后续空肠弯曲菌感染的血清学方法提供实验依据，能为疫苗的研发提供候选抗原，具有新颖性及实用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]下面结合本发明的图形进一步说明:
[0014]图1是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18跨膜结构预测结果示意图；
[0015]图2是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞线性表位预测结果示意图；
[0016]图3是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18亲水性、抗原性预测结果示意图；
[0017]图4是所述空肠弯曲菌0MP18基因核苷酸序列同源性比较示意图；
[0018]图5是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞线性抗原表位ELISA筛选鉴定结果示意图。
【具体实施方式】 [0019]如图1是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18跨膜结构预测结果示意图，使用 TM pred(PredictionofTransmembraneRegionsandOrientation, www.ch.embnet.0rg/software/TMPRED-f orm.html)和 TMHMM2.0(http://cbs.dtu.dk/serves/TMHMM-2.0/)预测蛋白中存在的跨膜结构域，使用 ProDom(http://prodes.toulouse.1nra.fr/prodom/doc/blast-form.html)和 Pfam (http://plat0.wustl.edu/hmmsearch.shtml)予页测目的蛋白中存在的功能结构域。结果表明空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18中不存在跨膜结构，整个蛋白定位于菌体表面。
[0020]如图2是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞线性表位预测结果示意图，通过 http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/ 对 0MP18 蛋白中可能存在的线性 B细胞表位进行预测。表明空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18中存在三个线性B细胞表位。
[0021]如图3是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18亲水性、抗原性预测结果示意图，采用DNASTAR/protean软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18中存在的二级结构、亲水性和抗原性进行分析。表明三个线性B细胞表位具有良好的亲水性和抗原性。
[0022]如图4是所述空肠弯曲菌0MP18基因核苷酸序列同源性比较示意图，采用http://www.ch.embnet.0rg/software/BottomBLAST.html ? (EMBnet-CH/SIB)(Switzerland)数据库对空肠弯曲菌0MP18基因编码的蛋白序列进行比对,参数选择:Protein database,Non redundant, Blosum62。筛选出与其相似性较高的氨基酸序列在http://www.eb1.ac.uk/clustalw/进行同源性分析。该基因序列仅保守存在于不同空肠弯曲菌菌株中。空肠弯曲菌 00-2425,3488, NCTCl1168, S3, IA3902, ICDCCJ07001, M1，81116，81-176，doylei269.97株中均存在ompl8基因，且序列高度同源，相似度达99%。
[0023]如图5是所述空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞线性抗原表位ELISA筛选鉴定结果示意图，由相应生物技术公司合成0MP18线性B细胞表位多肽，并采用HPLC技术对合成多肽进行纯度分析。将合成的各表位多肽稀释至10ug/ml包被96孔板，以兔抗空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗(Pierce公司)，HRP标记羊抗兔IgG抗体为二抗(Abeam公司)，对各表位多肽与全菌抗体的结合反应力进行检测分析。结果发现三个表位抗原都能有效结合空肠弯曲菌全 菌抗体，其中抗原表位多肽3对抗体亲和力最强，为优势线性B细胞抗原表位。
[0024]所述一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法是基于空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选来进行的，并包括如下步骤:
[0025](I)采用TMpred和TMHMM软件预测0MP18蛋白的跨膜结构域、采用ProDom和Pfam软件预测蛋白的功能结构域、采用BepiPred软件预测0MP18蛋白的线性B细胞表位、采用DNASTAR软件对0MP18蛋白中存在的二级结构、亲水性和抗原性进行分析，结果表明外膜蛋白0MP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构，存在三个线性B细胞表位，且具有良好的亲水性和抗原性。
[0026]使用 TMpred (Prediction of Transmembrane Regions and Orientation, www.ch.embnet.0rg/sof iware/TMPRED-form.html)和 TMHMM2.0 (http://cbs.dtu.dk/serves/TMHMM-2.0/)预测蛋白中可存在的跨膜结构域，使用ProDom(http://prodes.toulouse.1nra.fr/prodom/doc/blast-form.html)和 Pfam(http://plat0.wustl.edu/hmmsearch.shtml)预测目的蛋白中存在的功能结构域。通过http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/对0MP18蛋白中可能存在的线性B细胞表位进行预测。采用DNASTAR/protean软件对目的蛋白中存在的二级结构、亲水性和抗原性进行分析。结果发现，空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18中不存在跨膜结构，整个蛋白定位于菌体表面。蛋白功能结构域预测发现0MP18蛋白中存在OmpA结构域，与病原菌的粘附能力密切相关。二级结构分析发现，0MP18蛋白中存在3个线性B细胞表位，且具有良好的亲水性和抗原性。
[0027](II)采用Clustalw软件进行0MP18基因核苷酸序列同源性比较，该基因序列仅保守存在于不同空肠弯曲菌菌株中，且序列高度同源，相似度达99% ；
[0028]用http://www.ch.embnet.0rg/software/BottomBLAST.html ? (EMBnet-CH/SIB) (Switzer land)数据库对空肠弯曲菌ompl8基因编码的蛋白序列进行比对,参数选择:Protein database,Non redundant,Blosum62。筛选出与其相似性较高的氨基酸序列在http://www.eb1.ac.uk/clustalw/进行同源性分析。结果发现，该基因序列仅保守存在于不同空肠弯曲菌菌株中。空肠弯曲菌 00-2425，3488，NCTC11168，S3，IA3902，ICDCCJ07001，M1，81116，81-176，doylei269.97株中均存在ompl8基因，且序列高度同源，相似度达99%;
[0029](III)采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗，基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行检测筛选鉴定，发现三个B细胞抗原表位都能有效结合空肠弯曲菌全菌抗体。
[0030]B细胞线性表位鉴定的具体实施中，包被:在微孔条上包被100 μ g/ml浓度的蛋白抗原100ul，4°C过夜。封闭:倒去包被液，加入200ul封闭液，37°C温育2小时。洗涤:小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。加样:分别在相应孔中加入一抗，对一抗进行2倍稀释作了 6个梯度，从400-12.5 μ g/ml (40ug/ml效果最好)，加一副孔，轻轻震荡混匀。温育:用封板膜封板后，置37°C温育I小时洗涤:小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。加酶:每孔加入二抗(I: 3000稀释)100ul，空白孔除外，轻轻震荡混匀。温育:操作同上。洗涤:操作同上。显色:每孔加入显色剂lOOul，轻轻震荡混匀，37°C避光显色30分钟。测定:每孔加终止液50ul，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果，设定酶标仪波长于450nm处(用双波长450nm/630nm检测)。
[0031]0MP18蛋白结构分析结果显示该蛋白定位于细菌外表面，存在三个明显的B细胞线性表位，且具有显著的抗原性。基于ELISA技术，采用空肠弯曲菌全菌抗体对预测表位进行鉴定发现三个表位多肽都能与全菌抗体有效结合，但结合力存在差异，这说明本发明所使用的结构分析技术可靠，在表位预测方面准确率很高，能为后续空肠弯曲菌感染的血清学方法建立及疫苗研发提供候选抗原。
【权利要求】
1.一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法，其特征在于:所述一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法是基于空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选来进行的，并包括如下步骤: (I)采用TMpred和TMHMM软件预测0MP18蛋白的跨膜结构域、采用ProDom和Pfam软件预测蛋白的功能结构域、采用BepiPred软件预测0MP18蛋白的线性B细胞表位、采用DNASTAR软件对0MP18蛋白中存在的二级结构、亲水性和抗原性进行分析，结果表明外膜蛋白0MP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构，存在三个线性B细胞表位，且具有良好的亲水性和抗原性； (II)采用clustalw软件进行0MP18基因核苷酸序列同源性比较，该基因序列仅保守存在于不同空肠弯曲菌菌株中，且序列高度同源，相似度达99% ； (III)采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗，基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行检测筛选鉴定，发现三个B细胞抗原表位都能有效结合空肠弯曲菌全菌抗体； 通过上述三个步骤，建立起空肠弯曲菌主要外膜蛋白0MP18的B细胞抗原表位筛选和鉴定方法，能为后续空肠弯曲菌感染的血清学方法建立及疫苗研发提供候选抗原。
【文档编号】G01N33/68GK103941018SQ201410131891
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】楼宏强, 单小云, 宋春涵, 胡野, 盛秀胜, 王岚 申请人:金华职业技术学院