一种单细胞分析用微流控芯片和系统及单细胞分析方法
【专利摘要】本发明涉及一种单细胞分析用微流控芯片和系统及单细胞分析方法。所述单细胞分析用微流控芯片，包括由上到下依次封接的透明顶盖、微流体通道、带有微孔阵列的基板和带有腔体的底板；所述透明顶盖具有连通外界与微流体通道的流入孔和流出孔；所述基板的微孔阵列位于所述微流体通道下方并与所述微流体通道连通，所述微孔内设有电极，所述电极包括阴极和阳极，所述微孔仅能容纳单个细胞，所述微孔底部具有与所述底板的腔体相连通且横截面小于所述单个细胞大小的通道。本发明将单细胞捕获、鉴定及裂解过程集成在单块微流控芯片上，通过提供相应的操作方法，实现快速获取并精确分析单细胞内容物。
【专利说明】一种单细胞分析用微流控芯片和系统及单细胞分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及单细胞分析【技术领域】，尤其涉及一种将单细胞的捕获、鉴定和裂解集成为一体的单细胞分析用微流控芯片，以及配套系统和单细胞分析方法。
【背景技术】
[0002]获取细胞内容物是大多数分子生物学研究的基础，同时很多现代医疗诊断方法(例如基因组测序和蛋白组学分析)也都需要获取细胞内容物。传统的获取并分析细胞内容物的方法需要大量的细胞，获取某一内容物(例如核酸或蛋白质)的总含量，将该总含量除以细胞个数，就获得了单个细胞中内容物的数量。
[0003]显而易见，上述方法是非常不精确的。更重要的是，上述方法有一个必要前提，单次分析中所有的细胞的性质必须是近似均一的。但无论是在前沿研究中，还是重大疾病的早期阶段，都常常仅有个别的细胞内容物组分和其它细胞不同，这时传统的方法将会平均掉该变化，使所述个别细胞的变化无法检测。
[0004]目前的前沿生物学研究和医学研究，例如诱导干细胞研究和循环肿瘤细胞研究，都揭示了一个重要原理:即使是同一种细胞，不同细胞个体之间也可能有很大的差异，而变异最显著的细胞往往能够揭示重要生物学现象或者提示肿瘤等重大疾病。因此，准确获取变化最显著的单个或数个细胞内容物并进行精确鉴定是飞速发展的生物学和医学研究十分需要的技术。
[0005]另一方面，从大量的样本(例如血液)中获得特定的细胞，也就是对细胞的准确捕获和鉴定，也是传统技术(如流式细胞仪)难以实现的。
[0006]近年来，微流控技术的出现，为研究者们提供了一种操纵微米尺度的流体的方法。同时微加工技术的发展也提供了制造与细胞尺度相似的微结构的方法。上述技术的出现，使得控制单细胞成为可能。
[0007]目前，尚无能够将细胞捕获、鉴定及裂解集成在一起的公开技术。但分别实现细胞捕获及细胞裂解功能的微芯片技术都已有公开报道。
[0008]关于微流控芯片中的单细胞捕获有以下三类技术:(1)物理屏障，如申请号为200680020207.9的中国专利申请中，在微流控芯片中制作一些和细胞大小类似的物理屏障，当细胞流过时，就被捕获在屏障中；申请号为201110224663.8的中国专利申请中，利用磁力，通过在细胞表面粘附磁珠并用磁场捕获细胞。(2)流体力学驻点，如申请号为201210418914.0的中国专利申请中，不涉及物理屏障，利用流体力学原理，产生一些流体驻点，根据不同的细胞尺寸和密度等特性，可以使细胞被捕获在一些特定的位置。(3)电致细胞运动，如申请号为201210152137.X的中国专利申请中，在微流控通道中制作微电极，利用细胞电泳或细胞介电泳等方式，使细胞被捕获在电极附近。
[0009]关于微流控芯片中的细胞裂解主要涉及到以下两类技术:(I)利用裂解液进行化学裂解，如申请号为200710012879.1的中国专利申请中，将化学裂解液通过细胞，溶解(或部分破坏)细胞膜；这种技术会引入污染，加大对细胞内容物进行分子生物学分析(如蛋白质组学分析)的难度。(2)利用电场、声波或激光来破坏细胞膜，如申请号为201210152137.X的中国专利申请公开的技术。
[0010]目前已公开的技术中，都没有涉及到对所捕获的细胞进行鉴定，根据鉴定结果针对性的裂解其中一部分(甚至单个)细胞并获取细胞内容物的方法。也就是说，目前尚没有将单细胞的捕获、鉴定和裂解集成为一体的单细胞分析用微流控芯片的报道。
【发明内容】
[0011]针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种单细胞分析用微流控芯片，能够精确地从大量细胞中获取特定单细胞的内容物，将单细胞捕获、鉴定及裂解过程集成在单块微流控芯片上，通过提供相应的操作方法，实现快速获取并精确分析单细胞内容物。
[0012]本发明的目的还在于提供一种包括所述单细胞分析用微流控芯片的单细胞分析系统和方法。
[0013]为实现本发明的目的，采用以下技术方案:
[0014]在第一方面，本发明提供一种单细胞分析用微流控芯片，包括由上到下依次封接的透明顶盖、微流体通道、带有微孔阵列的基板和带有腔体的底板；所述透明顶盖具有连通外界与微流体通道的流入孔和流出孔；所述基板的微孔阵列位于所述微流体通道下方并与所述微流体通道连通，所述微孔内设有电极，所述电极包括阴极和阳极，所述微孔仅能容纳单个细胞，所述微孔底部具有与所述底板的腔体相连通且横截面小于所述单个细胞大小的通道。
[0015]本发明的微流控芯片包括依次密封封接但贯通的四层结构，即透明顶盖、微流体通道、带有微孔阵列的基板和带有腔体的底板，其中透明顶盖上的流入孔是流体(比如细胞悬浮液)的入口，流出孔是流体的出口 ；含有细胞的流体由流入孔流入，并进入微流体通道，由于微流体通道下方与微孔阵列连通，微孔仅能容纳单个细胞，因此单个细胞分别落入不同的微孔中，由于微孔底部的通道的横截面小于所述单个细胞大小，落入微孔中的单个细胞不会漏入下层的底板的腔体内，而是被限制在微孔内，实现单细胞捕获。通过通入细胞特异性的荧光探针(比如荧光分子标记的膜蛋白的抗体)，使荧光探针与特定细胞结合而实现单细胞鉴定。根据鉴定结果，对特定单细胞所在的微孔内的电极施加电压，在细胞两侧产生电场，使得细胞膜破裂，细胞内容物流出，通过所述微孔底部的通道，流入所述底板的腔体内，最后收集所述腔体内的细胞内容物以供后续分析，实现单细胞裂解。因此，本发明的单细胞分析用微流控芯片将单细胞捕获、鉴定及裂解过程集成在单块微流控芯片上。
[0016]本发明的微流控芯片的微流体通道可以是弯曲布置的单条通道，这种情况下仅需要一个流入孔和一个流出孔；也可以是并行布置的多条通道，每条通道均有与其连通的流入孔和流出孔。
[0017]本发明的微流控芯片的微流体通道的尺寸，由具体分析的单细胞的大小决定。一般地，宽度可以是5?100微米，例如10微米、15微米、20微米、50微米、80微米或90微米；深度可以是5?100微米，例如10微米、15微米、20微米、50微米、80微米或90微米。本领域技术人员可以根据分析的单细胞的大小设计微流体通道的尺寸。在本发明的具体实施方案中，作为应用于血液中的循环肿瘤细胞的最优条件，微流体通道的宽度和深度均为30微米。[0018]本发明的微流控芯片的微孔的尺寸，由具体分析的单细胞的大小决定。一般地，宽度可以是5?100微米，例如10微米、15微米、20微米、50微米、80微米或90微米；深度可以是5?100微米，例如10微米、15微米、20微米、50微米、80微米或90微米。本领域技术人员可以根据分析的单细胞的大小设计微流体通道的尺寸，保证每个微孔仅能容纳单个细胞即可。在本发明的具体实施方案中，作为应用于血液中的循环肿瘤细胞的最优条件，微流体通道的宽度和深度均为30微米。
[0019]作为本发明的优选方案，所述微孔为边长为5?100微米的正方体形或长方体形，或直径为5?100微米的圆柱体形。
[0020]本发明的微流控芯片的每个微孔与下层底板的腔体相连通的通道的尺寸，由具体分析的单细胞的大小决定。一般地，在通道截面为圆形的情况下，直径为I?5微米即可，因为这样既能保证单细胞不会从通道漏出，又能保证单细胞裂解后的细胞内容物由该通道流入下层底板的腔体内。
[0021]作为本发明的优选方案，所述阴极和阳极成对布置在所述微孔的侧壁上。每个微孔中都有一对电极，可以分别控制其是否通电。
[0022]本发明的微流控芯片的底板可以仅有一个腔体，用于收集所有微孔中的细胞内容物；所述底板也可具有多个腔体，每个腔体对应一个或多个微孔，用于收集一个或多个微孔中的细胞内容物，例如可以每个微孔对应一个腔体，该腔体收集对应微孔内的细胞内容物。
[0023]在第二方面，本发明提供一种单细胞分析用微流控芯片系统，包括:
[0024]如第一方面所述的单细胞分析用微流控芯片，用于单细胞的捕获、鉴定和裂解；
[0025]荧光探针，用于标记和显示细胞表面的分子；优选地，所述荧光探针为荧光分子标记的抗体或多肽，所述细胞表面的分子为细胞表面的蛋白分子；
[0026]荧光显微镜，用于观察所述微孔阵列中的细胞是否有荧光并获取图像；
[0027]图像处理设备，用于分析所述荧光显微镜获取的图像；
[0028]电压发生器，通过电缆连接所述微流控芯片的微孔内的电极，并通过电缆连接所述图像处理设备，用于根据所述图像处理设备发出的指令，控制所述微孔中的电极裂解细胞；
[0029]泵，连接所述微流控芯片的流入孔和/或流出孔，用于驱动微流体流动。
[0030]在第三方面，本发明提供一种单细胞分析方法，包括:通过泵驱动，向如第一方面所述的微流控芯片中通入细胞悬浮液；待细胞落入所述微流控芯片的微孔阵列内后，向所述微流控芯片中通入荧光探针；使用荧光显微镜从所述微流控芯片的正面观察微孔阵列内的细胞是否有荧光，并获取图像；使用图像处理设备分析所述荧光显微镜获取的图像，从而对细胞进行鉴定；根据鉴定结果，使用电压发生器对相应微孔内的电极施加电压，在细胞两侧产生电场，使得细胞膜破裂，细胞内容物流出，通过所述微孔底部的通道，流入所述底板的腔体内；最后收集所述腔体内的细胞内容物以供后续分析。后续分析比如基因测序或蛋白质组学分析等。其中，所述细胞悬浮液可以来自于活体组织、血液或体外培养的细胞悬浮液；施加的电压能够使细胞膜破裂即可，比如根据不同的细胞，施加电压IV?60V。
[0031 ] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:
[0032](I)本发明在一块微流控芯片上实现了对单细胞的捕获、原位鉴定和原位裂解:在本发明所涉及的分子生物学领域和医学诊断领域中，对单细胞的精确分析带来了几个显著的优势:首先，与现有技术相比，大大提高了分析的精确度，从而可以在大量细胞中发现极少细胞的变化；其次，本发明的原位鉴定是利用荧光探针来识别细胞表面的蛋白，不会影响细胞内容物，从而不会影响后续分子生物学研究和诊断的准确性；最后，单细胞含有的细胞内容物很少，本发明的原位裂解可以最大程度地减少在细胞内容物转移过程中的损失。
[0033](2)本发明实现了对样品的高通量快速处理:本发明利用微加工技术，制作与细胞大小相仿的微孔阵列式结构，可以同时捕获很多细胞，对这些细胞的光学分析鉴定和裂解过程也是同时完成的，相比流式细胞仪等现有技术，大大提高了处理的通量。此外，本发明利用微流控技术，可以根据需要设计多条并联的微流体通道，大大提高处理速度。
[0034](3)本发明的微流控芯片及相应的系统适用范围广，自动化程度高，对细胞内容物的干扰小:本发明的微流控芯片的微孔阵列的尺寸可以根据不同的细胞进行调整，如果需要用于尺寸差异很大的细胞(例如细菌和卵细胞之间的体积差异很大)，只需要加工不同尺寸的微孔即可，对本领域技术人员来说，这是很容易实现的且几乎不增加成本；本发明中的光学分析鉴定和电学裂解都可以通过摄像、图像分析及单片机处理等自动化手段完成，在提高处理速度的同时大大提高了准确率；本发明中的电学裂解方法，不需要引入任何化学或生物裂解液，避免了污染，提高了后续分子生物学分析的准确性。
[0035]综上所述，本发明通过微加工技术和微流控技术，开发了一种多层微流控芯片，实现了对流体中细胞的单细胞捕获、原位鉴定和原位裂解，为单细胞分析领域提供了一种不同于现有技术的方案，能够更高效、更准确、更高通量地分别获取大量细胞的内容物。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1是本发明的单细胞分析用微流控芯片的结构分解示意图，该图为示意图，未按实际比例绘制。
[0037]图2是沿图1中AA’线剖切后的立体示意图及局部放大示意图，展示了微流控芯片中微孔阵列的具体结构，该图为示意图，未按实际比例绘制。
[0038]图3是使用本发明的单细胞分析用微流控芯片进行单细胞捕获、鉴定及裂解的过程示意图，该图为示意图，未按实际比例绘制。
[0039]附图标记说明:
[0040]1-透明顶盖
[0041]11-流入孔
[0042]2-微流体通道
[0043]3-带有微孔阵列的基板
[0044]31-微孔
[0045]32-电极
[0046]33-通道
[0047]4-带有腔体的底板
[0048]41-腔体
[0049]5-细胞
【具体实施方式】[0050]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述，这些描述仅是说明性的，不应当理解为对本发明保护范围的限制。
[0051]图1为本发明的单细胞分析用微流控芯片的结构分解示意图，显示微流控芯片包括透明顶盖1、微流体通道2、带有微孔阵列的基板3和带有腔体的底板4四层结构。其中，透明顶盖I的一角有流入孔11，其对角线有流出孔(图中画出但未标号)；带有微孔阵列的基板3上有多个微孔31呈阵列状排列；带有腔体的底板4有一个腔体41。
[0052]下面对微流控芯片的每部分作详细描述:
[0053]1、透明顶盖I和微流体通道2:
[0054]由于对细胞进行鉴定时，需要光线透过顶盖，所以顶盖需要采用透明材质；同时，由于顶盖需要制作流体的流入口和流出口，所以需要能够开孔；最后，顶盖需要与微流体通道2封接在一起，并且实现密封，所以材质的选择上要考虑与微流体通道2的兼容性。优选的顶盖材料是那些可以通过蒸镀、切割及热塑成型制成特定规格及形状的材料，特别优选较薄并透明的绝缘聚合物。微流体通道2起到约束细胞流动的作用，其特征尺寸需要与细胞相匹配，所以需要采用兼容现有的微加工技术的材料。本发明的优选实施例中，透明顶盖I采用玻璃材料，而微流体通道2采用聚二甲基硅氧烷(PDMS )材料，二者采用键合的方式密封连接。当然，在其它实施例中，透明顶盖I和微流体通道2也可以采用同样的材料(例如PDMS) 一次成型，不需要分别制造再封接在一起。
[0055]透明顶盖I和微流体通道2的外廓尺寸要与带有微孔阵列的基板3相匹配。微流体通道2的宽度同样也要与微孔31的特征尺寸(边长或直径)相匹配。
[0056]在图1-3所示的优选实施例中，微流体通道2的宽度为30微米，深度为30微米，这是应用于血液中的循环肿瘤细胞的最优条件。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员根据细胞的大小，自行设计合适的微流体通道2的尺寸。
[0057]2、带有微孔阵列的基板3:
[0058]在本发明中，微孔阵列是用来容纳细胞并对其进行处理的关键结构。为了适应细胞的尺寸，需要选择能够兼容现有微加工技术的材料。在图2所示的优选实施例中，选择硅作为带有微孔阵列的基板3的材料，是因为硅可以很好的兼容基于光刻和腐蚀的微加工工艺，从而可以很容易地获得与细胞尺寸相符的微孔阵列。本领域技术人员也可以根据需求选择玻璃、PDMS等可加工的材料作为带有微孔阵列的基板3的材料。需要注意的是，最终加工完成的微孔阵列的表面需要绝缘，图2所示的优选实施例中采用对硅材料表面进行氧化以形成绝缘的二氧化硅层来满足这一要求，这一点是微流控芯片制作【技术领域】的技术人员所知晓的。
[0059]在图2所示的优选实施例中，每个微孔31都是边长为30微米的立方体，每两个微孔31之间的间距为20微米。微孔阵列的整体尺寸为长2厘米、宽I厘米，整个微孔阵列共有72000个微孔(图2中未全部画出)。上述尺寸是应用于血液中的循环肿瘤细胞的最优条件。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员根据细胞的大小，自行设计合适的微孔尺寸和数量。
[0060]如图2所示，在每个微孔31的侧壁上，都有着相对布置的电极32，分别作为阴极和阳极，用于细胞的裂解。电极32可以由适当的导电材料或这些材料的复合物来制成。电极32的优选材料为生物兼容性好的材料，例如金、钛和掺有银离子的PDMS。当采用多种材料时(例如一种导电材料如金，镀在另一种导电材料如铜上)，最外层的材料优选为生物兼容性好的材料，以便与细胞有良好的生物兼容性。在如图2所示的优选实施例中，电极32的材料为铬和金。具体做法可以是:首先，在基板上溅射(这是一种半导体加工工艺中公知的沉积金属的方法)一层厚度为0.1微米的铬，再溅射一层厚度为0.5微米的金；然后对整个基板进行光刻(同样是半导体加工工艺中公知的制作图形的方法)得到需要的电极形状；接着腐蚀掉金层和铬层上不需要的部分，最终得到所需的电极32。当然，电镀等本领域公知的加工金属的方法也可以用来制作电极32。如图2所示的优选实施例中，采用铬和金来制作电极，是由于金的生物兼容性很好，而铬增加金和基板材料之间的黏附性。在不同的需求下，其它的导电材料，例如铝、铜或者导电聚合物都可以用来制造电极32。如图2所示的优选实施例中，电极32的宽度为20微米，深度为30微米(与微孔31的深度相同)，厚度为0.6微米。
[0061]在每个微孔31的底部，都有一条与下层的带有腔体的底板4连通的通道33，该通道33起到阻挡细胞通过并让细胞内容物通过的作用，所以其特征尺寸要小于细胞的特征尺寸，在图2所示的优选实施例中，该通道33的截面为正方形，边长为5微米。这是应用于血液中的循环肿瘤细胞的最优条件，既可以保证细胞不通过，也可以保证细胞裂解液顺畅通过。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员根据细胞的大小，自行设计合适的通道尺寸。
[0062]3、带有腔体的底板4
[0063]本发明中，带有腔体的底板4有容纳细胞裂解液的腔体41。图1和图3所示的优选实施例中，带有腔体的底板4上只有一个腔体41，所有微孔31都通向该腔体41。在其它实施例中，带有腔体的底板4也可以制造多个腔体，每个腔体对应一个或多个微孔31。
[0064]在图1和图3所示的优选实施例中，带有腔体的底板4的材料是玻璃。而硅、PDMS或不锈钢亦可以很方便的用作带有腔体的底板4的材料。对于带有腔体的底板4有多个腔体的情况来说，硅和PDMS更易加工。
[0065]4、封接方法:
[0066]在图1所示的优选实施例中，透明顶盖1、微流体通道2、带有微孔阵列的基板3和带有腔体的底板4的材料分别是玻璃、PDMS、硅和玻璃。采用氧等离子辅助键合的方法可以很好的实现玻璃与PDMS、硅与PDMS之间的良好密封封接；采用阳极键合的方法可以实现硅与玻璃之间的密封封接。在其它的实施例中，可以根据透明顶盖1、微流体通道2、带有微孔阵列的基板3和带有腔体的底板4的材料来选择合适的封接方法。
[0067]下面描述单细胞分析用微流控芯片系统的结构组成。
[0068]本发明提供的单细胞分析用微流控芯片系统，包括:上述单细胞分析用微流控芯片，用于单细胞的捕获、鉴定和裂解；荧光探针，用于标记和显示细胞表面的分子；优选地，所述荧光探针为荧光分子标记的抗体或多肽，所述细胞表面的分子为细胞表面的蛋白分子；荧光显微镜，用于观察所述微孔阵列中的细胞是否有荧光并获取图像；图像处理设备，用于分析所述荧光显微镜获取的图像；电压发生器，通过电缆连接所述微流控芯片的微孔内的电极，并通过电缆连接所述图像处理设备，用于根据所述图像处理设备发出的指令，控制所述微孔中的电极裂解细胞；泵，连接所述微流控芯片的流入孔和/或流出孔，用于驱动微流体流动。[0069]在优选实施例中，可以采用标记了红色荧光的CD45抗体作为荧光探针，用来识别白细胞表面的CD45蛋白。在其它实施例中，也可以针对不同的蛋白选择不同的抗体或者多肽作为探针。
[0070]下面通过具体实施例来说明本发明的微流控芯片和系统的制作方法。发明人根据实施例1和2描述的两套不同的制作方法已经成功制作出了本发明所述的微流控芯片和系统。在此给出具体制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制作方法，而并不是对本发明所述微流控芯片的材料、尺寸和制作方法作出限定。
[0071]实施例1
[0072]透明顶盖:采用4英寸PyreX7740玻璃片(康宁公司)，按照长2厘米、宽I厘米的外形尺寸切成长方形小片，用激光在每块小片的特定位置打两个孔。
[0073]微流体通道:采用N型4英寸硅片，在光刻出微流体通道的平面形状后，使用半导体领域常用的ICP干法刻蚀(感应等离子刻蚀，即使用六氟化硫和四氟化碳的高能等离子来刻蚀硅)出30微米深的槽。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出，切除PDMS没有槽的部分，按照长2厘米、宽I厘米的外形尺寸切成长方形小片，这样就得到了微流体通道。
[0074]带有硅微孔阵列的基板:采用N型4英寸硅片，对其采用湿法氧化，在硅片表面生成一层0.5微米厚的氧化层，在硅片正面光刻出微孔的平面位置，采用氢氧化钾湿法腐蚀的方法制作30微米深的微孔。在硅片正面溅射0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层，溅射时将硅片倾斜45度并旋转，以保证金属对微孔侧壁的覆盖。对硅片正面进行真空辅助涂胶和光刻，定义出所需电极的形状，然后再使用碘化钾溶液腐蚀金层，使用硝酸铈铵腐蚀铬层，这样就得到了微孔中的电极。对硅片背面进行光刻，定义出微孔底部的通道位置，采用ICP干法刻蚀穿通该硅片，最终获得完整的硅微孔阵列。
[0075]带有腔体的底板:采用4英寸Pyrex7740玻璃片,光刻出腔体的位置,使用氢氟酸腐蚀玻璃，形成腔体。
[0076]封接:首先将硅基板(带有微孔阵列的基板)和玻璃底板(带有腔体的底板)阳极键合在一起，再按长2厘米、宽I厘米的外形尺寸切成长方形小片，使用氧等离子体处理透明顶盖的底面、微流体通道的两面、硅基板的顶面，然后将它们依次键合在一起，最终获得完整的微流控芯片。
[0077]微流控芯片系统:在微流控芯片的基础上，使用普通塑料管连接泵和透明顶盖上的流入孔和流出孔，在带有微孔阵列的基板上外露的金电极上通过超声波焊接进行电缆的引出，将电缆连接到图像处理设备和电压发生器上，再将电压发生器和图像处理设备连接在一起，并将微流控芯片放置在荧光显微镜下，即可完成整套系统的搭建。
[0078]实施例2:
[0079]透明顶盖和微流体通道:采用N型4英寸硅片，在光刻出微流体通道的平面形状后，使用ICP干法刻蚀出30微米深的槽。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出，按照长2厘米、宽I厘米的外形尺寸切成长方形小片，使用钻头在所需位置打孔，形成流入孔和流出孔，这样就得到了一体式的透明顶盖和微流体通道。
[0080]带有硅微孔阵列的基板:采用N型4英寸硅片，采用化学气相沉积(CVD)的方法，在硅片表面生成一层2微米厚的氧化层，在硅片正面光刻出微孔的平面位置，采用ICP干法刻蚀的方法将微孔腐蚀30微米深。在硅片正面溅射0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上电镀3微米厚的金层，以保证对微孔侧壁的覆盖。对硅片正面进行真空辅助涂胶和光刻，制作出所需电极的形状，然后再使用碘化钾溶液腐蚀金层，使用硝酸铈铵腐蚀铬层，这样就得到了微孔中的电极。对硅片背面进行光刻，定义出硅微孔底部的通道位置，采用激光刻蚀穿通该硅片，最终获得完整的硅微孔阵列。将4英寸硅片按照长2厘米、宽I厘米的外形尺寸切成长方形小片。
[0081]带有腔体的底板:采用不锈钢片，利用数控铣刀开出一个大腔体，并将不锈钢片切割成长2厘米、宽I厘米的长方形小片。
[0082]封接:用紫外固化粘合剂将微流体通道、硅基板(带有硅微孔阵列的基板)和不锈钢依次密封粘合在一起，就获得了完整的微流控芯片。
[0083]微流控芯片系统:在微流控芯片的基础上，使用聚四氟乙烯管连接泵和透明顶盖上的的流入孔和流出孔，在带有微孔阵列的基板上外露的金电极上通过超声波焊接进行电缆的引出，将电缆连接到电压发生器上，再将电压发生器和图像处理设备连接在一起，并将微流控芯片放置在荧光显微镜下，即可完成整套系统的搭建。
[0084]应用例I
[0085]由如下的方法已经将本发明所述微流控芯片及相应系统成功应用于单细胞分析。给出具体方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的功能及应用方法，而并不是对本发明所述系统的适用范围做出限定。
[0086]取体重为18_22g的BALB/c小鼠，在其腋下种入Hela癌细胞，待肿瘤生长到I立方厘米时，取I毫升小鼠尾血，稀释10倍，通入微流控芯片中。待细胞捕获完成后，向芯片内通入带有红色荧光的CD45抗体和带有绿色荧光的EPCAM抗体，使用荧光显微镜拍摄图像并进行处理，不发荧光的细胞不加处理；仅发红色荧光的细胞是白细胞，也不加处理；同时发红色荧光和绿色荧光的同样是白细胞，也不加处理；仅发绿色荧光的说明是血液中的循环肿瘤细胞。确认位置后，对相应细胞通电加以裂解，获取裂解液进行蛋白质组学分析。由于血液中的循环肿瘤细胞数量稀少，所以如果一块微流控芯片未能获得只发绿色荧光的细胞，则换下一块微流控芯片继续处理。
[0087] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种单细胞分析用微流控芯片，包括由上到下依次封接的透明顶盖、微流体通道、带有微孔阵列的基板和带有腔体的底板；所述透明顶盖具有连通外界与微流体通道的流入孔和流出孔；所述基板的微孔阵列位于所述微流体通道下方并与所述微流体通道连通，所述微孔内设有电极，所述电极包括阴极和阳极，所述微孔仅能容纳单个细胞，所述微孔底部具有与所述底板的腔体相连通且横截面小于所述单个细胞大小的通道。
2.根据权利要求1所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述微流体通道为弯曲布置的单条通道。
3.根据权利要求1所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述微流体通道为并行布置的多条通道，每条通道均有与其连通的流入孔和流出孔。
4.根据权利要求1-3任一项所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述微流体通道的宽度为5~100微米，深度为5~100微米。
5.根据权利要求1-4任一项所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述微孔的宽度为5~100微米，深度为5~100微米。
6.根据权利要求1-5任一项所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述微孔为边长为5~100微米的正方体形或长方体形,或直径为5~100微米的圆柱体形。
7.根据权利要求1-6任一项所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述阴极和阳极成对布置在所述微孔的侧壁上。
8.根据权利要求1 -7任一项所述的单细胞分析用微流控芯片，其特征在于，所述底板仅有一个腔体，用于收集所有微孔中的细胞内容物；或所述底板具有多个腔体，每个腔体对应一个或多个微孔，用于收集一个或多个微孔中的细胞内容物。
9.一种单细胞分析用微流控芯片系统，包括: 如权利要求1-8任一项所述的单细胞分析用微流控芯片，用于单细胞的捕获、鉴定和裂解； 荧光探针，用于标记和显示细胞表面的分子；优选地，所述荧光探针为荧光分子标记的抗体或多肽，所述细胞表面的分子为细胞表面的蛋白分子； 荧光显微镜，用于观察所述微孔阵列中的细胞是否有荧光并获取图像； 图像处理设备，用于分析所述荧光显微镜获取的图像； 电压发生器，通过电缆连接所述微流控芯片的微孔内的电极，并通过电缆连接所述图像处理设备，用于根据所述图像处理设备发出的指令，控制所述微孔中的电极裂解细胞； 泵，连接所述微流控芯片的流入孔和/或流出孔，用于驱动微流体流动。
10.一种单细胞分析方法，包括:通过泵驱动，向如权利要求1-8任一项所述的微流控芯片中通入细胞悬浮液；待细胞落入所述微流控芯片的微孔阵列内后，向所述微流控芯片中通入荧光探针；使用荧光显微镜从所述微流控芯片的正面观察微孔阵列内的细胞是否有荧光，并获取图像；使用图像处理设备分析所述荧光显微镜获取的图像，从而对细胞进行鉴定；根据鉴定结果，使用电压发生器对相应微孔内的电极施加电压，在细胞两侧产生电场，使得细胞膜破裂，细胞内容物流出，通过所述微孔底部的通道，流入所述底板的腔体内?’最后收集所述腔体内的细胞内容物以供后续分析。
【文档编号】G01N21/64GK103894248SQ201410141283
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】魏泽文, 胡志远 申请人:国家纳米科学中心