一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特点是：制作方法包括将组织细胞标本经沉淀、离心处理后，提取组织细胞标本并加入一种环保型生物合成剂，经超声波组织处理仪或医用微波炉对组织细胞标本同步进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，石蜡包埋组织切片、染色及封片。本发明的优点是快速，无污染，操作简便，染色过程可与日常工作一并进行，也可进行分子病理检测，且结果稳定。提高了病理诊断的阳性检出率及准确率。
【专利说明】一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于临床病理诊断、科研领域中对细胞学检测方法，具体说一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法。
【背景技术】
[0002]通过胸、腹水及淋巴液检测肿瘤细胞是临床病理诊断常用的检测方法之一，目前采用较多的方法有涂片法、TCT、LCT等，其制作的细胞涂片分布均匀，形态清晰，阳性诊断率较高，但由于负载的肿瘤细胞少，可出现细胞成团、重叠、挤压等现象，同时也不能满足后期的免疫组化的鉴别诊断。经细胞蜡块制作的切片细胞数量多，可连续切片，并可满足免疫组化、分子病理检测，满足了临床病理的需求。但常规制作时间需要3?5天，加上免疫组化时间往往需要5?7天才能拿到诊断报告。且在制作过程中因甲醛、二甲苯的挥发对人体产生一定的毒害。因此，目前的制作方法亟待改进。
[0003]如何提供一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，具有制作时间短，操作简便，步骤少，结果稳定，阳性检出率及准确率高，并减少污染环境。这是本发明面临的技术问题。
【发明内容】
[0004]本发明为解决现有技术存在的上述问题，提供一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，具有制作时间短，操作简便，步骤少，不易出差错，结果稳定，阳性检出率及准确率高，并减少环境污染。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，制作方法包括将组织细胞标本经沉淀、离心处理后，提取组织细胞标本并加入一种环保型生物合成剂，经超声波组织处理仪或医用微波炉对组织细胞标本同步进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，石蜡包埋组织切片、染色及封片。
[0006]对上述技术方案的一种改进:所述的组织细胞标本为胸腔积液或腹腔积液，所述提取组织细胞标本的具体步骤如下:
(1)沉淀组织细胞:将抽取的胸腔积液或腹腔积液100?500ml放入干净的器皿中，静止1-2小时，使大量的胸腔积液或腹腔积液中的组织细胞自然沉降到器皿的底部；
(2)采集组织细胞:弃去上清液，将底层的沉淀50?IOOml置于多个容积为5ml的试管中离心，离心转速为2000?2500转/分，离心时间为5-10分钟，将上清液弃去，最后将所述多个试管内的组织细胞集中至一个试管中，直到获得较多的组织细胞数量；
(3)凝固组织细胞:在最后沉淀组织细胞中加入10%中性缓冲甲醛，并用吸管将沉淀的组织细胞打散，再离心1-3分钟，至少静置15分钟后将半凝固状成团的组织细胞放入纱布中包好，放入包埋盒中。
[0007]对上述技术方案的进一步改进:对于离心后组织细胞数量少的标本:
(I)所述采集组织细胞步骤中，所述多个试管内的组织细胞集中至一个试管的形状为锥形的试管，使用锥形试管再次离心1-3分钟后，弃去上清液，加入少量的蛋白甘油，与组织细胞混合，使较少的组织细胞与蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向组织细胞中加入无水酒精，1-3分钟后取出半凝固状的组织细胞放入纱布中包好，放入包埋盒中；无水酒精与蛋白凝固将组织细胞包裹在内，起支撑固定作用。
[0008]对上述技术方案的另一种改进:所述的组织细胞标本为尿液、淋巴液或细胞悬液，具体步骤如下:
(1)离心采集组织细胞:先将大量的尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种，用大型离心机分多次离心，弃去上清液，最后将沉淀物集中到一个试管内离心，弃去上清液；淋巴液和细胞悬液因标本总量较少，但细胞含量大，可直接放入试管中离心后弃去上清液；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种组织细胞内加入熔点为45°C -52°C的5%琼脂或5%蛋白，室温下快速凝聚成团状，放入纱布中包好放入包埋盒中，起支撑作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种组织细胞内加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性缓冲甲醛，至少静置15分钟后，将已凝固的组织细胞取出放人纱布中包好放入包埋盒中。
[0009]对上述技术方案的进一步改进:所述的固定步骤之前增加预固定步骤，预固定步骤是将所述包埋盒放入装有10%中性缓冲甲醛的脱水缸中，置入超声波组织处理仪或医用微波炉中15分钟；
所述固定、脱水、透明、浸蜡步骤为:将固定好的组织细胞标本继续放入超声波组织处理仪或微波炉中，用环保型生物合成剂，温度45°C，时间12分钟，共3次；
浸蜡时间在温度为62°C条件下10分钟；使用环保型生物合成剂脱水、透明、浸蜡同时进行，以达到石蜡浸入组织细胞的目的；
所述二次包埋步骤:将纱布中的组织取出，放入盛有液状石蜡的包埋框中，将成团的组织细胞打散后均匀的平铺在底部，待冷却后制成组织细胞蜡块；如经过初次包埋的组织细胞，可将组织细胞标本周围凝固的琼脂或蛋清去除，再行石蜡包埋，已得到组织细胞数量的最大面积；
所述组织细胞切片步骤:将上述经石蜡包埋的组织细胞蜡块在组织切片机上切成3?4微米切片，温度为65°C条件下，烤片时间10?15分钟；
所述染色包括HE染色和免疫组织化染色；
所述HE染色步骤如下:
(I)先将环保透明脱蜡液放入60°C恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液2分钟；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)苏木素染色5-10分钟；
(10)自来水冲洗2分钟； (11)1%盐酸酒精分化，0.5%氨水返蓝；
(12)自来水流水冲洗10分钟；
(13)1%伊红染色I分钟；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脱水，环保透明脱蜡液2分钟，每步至少2次；
(15)环保型中性快干胶封片；
对部分无法诊断的蜡块，或科研需要的细胞悬液制成的蜡块，根据诊断需求进行免疫组织化染色，免疫组织化染色步骤如下:
(1)切片前先将环保透明脱蜡液放入58°C恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)蒸馏水I分钟；
(10)抗原修复，按第一抗体选择不同的修复液及修复方式；
(11)蒸馏水I分钟，至少3次；
(12)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；
(13)蒸馏水I分钟，至少2次，pH7.2的磷酸缓冲液，至少I次；
(14)滴加第一抗体；
(15)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(16)滴加第二抗体；
(17)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(18)DAB显色，自来水流水冲洗10分钟，
(19)苏木素浅染核后，吹风机吹干，经环保透明脱蜡液透明，中性快干胶封片。
[0010]对上述技术方案的进一步改进:所述环保型生物合成剂的主要成分为生物合成剂及脱水剂，由广东省佛山市南海钧镒医疗设备有限公司生产。
[0011]对上述技术方案的进一步改进:所述环保透明脱蜡液为无锡市江源实业技贸公司生产。
[0012]本发明与现有技术相比的优点和积极效果是:
本发明通过与普通离心涂片法、TCT法进行比较，检测肿瘤细胞三者间无显著差异，但本发明获得的肿瘤细胞比上两种方法更多，且可行免疫组织化学染色，必要时行分子病理检测，提高了临床病理诊断的准确率。与其他细胞蜡块制备方法比，染色结果无明显差异，具有环保、时间短(一般仅需2天)，操作更简便，步骤更少，制作面更广为优势，且不易出差错，经临床应用结果稳定。缩短了患者就诊时间，提高了工作效率。切片染色背景清晰，与常规HE染色无差异，免疫组织化学定位准确，提高了细胞学病理诊断的准确率，特别是科研方面对养殖细胞爬片法无法行免疫组织化学染色提供良好的帮助。应用环保型生物合成剂制作标本减少了有害物质如二甲苯等对工作环境及人体的危害。【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述:
本发明一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法的实施方式，制作方法包括将组织细胞标本经沉淀、离心处理后，提取组织细胞标本并加入一种环保型生物合成剂，经超声波组织处理仪或医用微波炉对组织细胞标本同步进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，石蜡包埋组织切片、染色及封片。
[0014]实施例1:本发明一种胸腔积液或腹腔积液细胞标本石蜡包埋的制作方法，具体步骤如下:
(1)沉淀细胞:将抽取的胸腔积液或腹腔积液IOOml放入干净的器皿中，静止I小时，使胸腔积液或腹腔积液中的细胞自然沉降到器皿的底部；
(2)采集组织细胞:弃去上清液，将底层的沉淀约50ml置于10个容积为5ml的试管中离心，离心转速为2000转/分，离心时间为10分钟，将上清液弃去，最后将所述10个试管内的组织细胞集中至一个试管中，直到获得较多的组织细胞数量；
(3)凝固组织细胞:在最后沉淀组织细胞中加入10%中性缓冲甲醛，并用吸管将沉淀的细胞打散，再离心3分钟，静置15分钟后将半凝固状成团的细胞组织取出，入纱布中包好，放入包埋盒中。
[0015]对于离心后组织细胞数量少的标本:
(1)所述采集组织细胞步骤中，所述10个试管离心后，将较少的组织细胞集中至一个形状为锥形的试管内，使用锥形试管再次离心3分钟后，弃去上清液，加入少量的蛋白甘油，与细胞混合，使较少的细胞与蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向组织细胞中加入无水酒精，3分钟后取出半凝固状的细胞组织放入纱布中包好，放入包埋盒中；无水酒精与蛋白凝固将细胞包裹在内，起支撑固定作用。
[0016]在固定步骤之前增加预固定步骤，预固定步骤是将所述包埋盒放入装有10%中性缓冲甲醛的脱水缸中，置入超声波组织处理仪或医用微波炉中15分钟；
固定、脱水、透明、浸蜡步骤为:将固定好的组织细胞标本继续放入超声波组织处理仪或微波炉中，用环保型生物合成剂，温度45°C，时间12分钟，共3次；
浸蜡时间在温度为62°C条件下10分钟；使用环保型生物合成剂脱水、透明、浸蜡同时进行，以达到石蜡浸入组织细胞的目的。
[0017]二次包埋步骤:将纱布中的组织取出，放入盛有液状石蜡的包埋框中，将成团的组织细胞打散后均匀的平铺在底部，待冷却后制成组织细胞蜡块；如经过初次包埋的组织，可将组织细胞标本周围凝固的琼脂或蛋清去除，再行石蜡包埋，以得到细胞数量的最大面积；
组织细胞切片步骤:将上述经石蜡包埋的组织细胞蜡块在组织切片 机上切成3?4微米切片，温度为65°C条件下，烤片时间10?15分钟。
[0018]所述染色包括HE染色和免疫组织化染色；
所述HE染色步骤如下:
(I)先将环保透明脱蜡液放入60°C恒温干燥箱预热； (2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液2分钟；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)苏木素染色5-10分钟；
(10)自来水冲洗2分钟；
(11)1%盐酸酒精分化，0.5%氨水返蓝；
(12)自来水流水冲洗10分钟；
(13)1%伊红染色I分钟；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脱水，环保透明脱蜡液2分钟，每步至少2次；
(15)环保型中性快干胶封片。
[0019]对部分无法诊断的蜡块，或科研需要的细胞悬液制成的蜡块，根据诊断需求进行免疫组织化染色，免疫组织化染色步骤如下:
(1)切片前先将环保透明脱蜡液放入58°c恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)蒸馏水I分钟；
(10)抗原修复，按第一抗体选择不同的修复液及修复方式；
(11)蒸馏水I分钟，至少3次；
(12)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；
(13)蒸馏水I分钟，至少2次，pH7.2的磷酸缓冲液，至少I次；
(14)滴加第一抗体；
(15)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(16)滴加第二抗体；
(17)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(18)DAB显色，自来水流水冲洗10分钟，
(19)苏木素浅染核后，吹风机吹干，经环保透明脱蜡液透明，中性快干胶封片。
[0020]实施例2:本发明一种胸腔积液或腹腔积液细胞标本石蜡包埋的制作方法，具体步骤如下:
(I)沉淀细胞:将抽取的胸腔积液或腹腔积液500ml放入干净的器皿中，静止2小时，使大量的胸腔积液或腹腔积液中的细胞自然沉降到器皿的底部； (2)采集组织细胞:弃去上清液，将底层的沉淀IOOml置于10个容积为IOml的试管中离心，离心转速为2500转/分，离心时间为5分钟，将上清液弃去，最后将所述10个试管内的组织细胞集中至一个试管中，直到获得较多的组织细胞数量；
(3)凝固组织细胞:在最后沉淀组织细胞中加入10%中性缓冲甲醛，并用吸管将沉淀的细胞打散，再离心3分钟，至少静置15分钟后将半凝固状成团的细胞组织放入纱布中包好，放入包埋盒中。
[0021]对于离心后组织细胞数量少的标本:
(1)所述采集组织细胞步骤中，所述10个试管离心后，将较少的组织细胞集中至一个形状为锥形的试管内，使用锥形试管再次离心3分钟后，弃去上清液，加入少量的蛋白甘油，与细胞混合，使较少的细胞与蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向组织细胞中加入无水酒精，3分钟后取出半凝固状的细胞组织放入纱布中包好，放入包埋盒中；无水酒精与蛋白凝固将细胞包裹在内，起支撑固定作用。
[0022]在固定步骤之前增加预固定步骤，预固定步骤是将所述包埋盒放入装有10%中性缓冲甲醛的脱水缸中，置入超声波组织处理仪或医用微波炉中15分钟；
固定、脱水、透明、浸蜡步骤为:将固定好的组织细胞标本继续放入超声波组织处理仪或微波炉中，用环保型生物合成剂，温度45°C，时间12分钟，共3次；
浸蜡时间在温度为62°C条件下10分钟；使用环保型生物合成剂脱水、透明、浸蜡同时进行，以达到石蜡浸入组织细胞的目的；
二次包埋步骤:将纱布中的组织取出，放入盛有液状石蜡的包埋框中，将成团的组织细胞打散后均匀的平铺在底部，待冷却后制成组织细胞蜡块；如经过初次包埋的组织，可将组织细胞标本周围凝固的琼脂或蛋清去除，再行石蜡包埋，以得到细胞数量的最大面积；
组织细胞切片步骤:将上述经石蜡包埋的组织细胞蜡块在组织切片机上切成3?4微米切片，温度为65°C条件下，烤片时间10?15分钟；
所述染色包括HE染色和免疫组织化染色；
所述HE染色步骤如下:
(1)先将环保透明脱蜡液放入60°C恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液2分钟；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)苏木素染色5-10分钟；
(10)自来水冲洗2分钟；
(11)1%盐酸酒精分化，0.5%氨水返蓝；
(12)自来水流水冲洗10分钟；
(13)1%伊红染色I分钟； (14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脱水，环保透明脱蜡液2分钟，每步至少2次；
(15)环保型中性快干胶封片；
对部分无法诊断的蜡块，或科研需要的细胞悬液制成的蜡块，根据诊断需求进行免疫组织化染色，免疫组织化染色步骤如下:
(1)切片前先将环保型脱蜡液放入58°C恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)蒸馏水I分钟；
(10)抗原修复，按第一抗体选择不同的修复液及修复方式；
(11)蒸馏水I分钟，至少3次；
(12)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；
(13)蒸馏水I分钟，至少2次，pH7.2的磷酸缓冲液，至少I次；
(14)滴加第一抗体；
(15)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(16)滴加第二抗体；
(17)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(18)DAB显色，自来水流水冲洗10分钟，
(19)苏木素浅染核后，吹风机吹干，经环保透明脱蜡液透明，中性快干胶封片。
[0023]实施例3:本发明一种尿液、淋巴液或细胞悬液细胞标本石蜡包埋的制作方法，具体步骤如下:
(1)离心采集组织细胞:先将大量的尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种，用50ml离心管多个，在大型离心机上离心，弃去上清液，最后将沉淀物集中到一个5ml试管内再离心，弃去上清液；淋巴液和细胞悬液因标本总量较少，但细胞含量大，可直接放入试管中离心后弃去上清液；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种组织细胞内加入熔点为45°C -52°C的5%琼脂，室温下快速凝聚成团状，放入纱布中包好放入包埋盒中，起支撑作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种组织细胞内加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性缓冲甲醛，至少静置15分钟后，将已凝固的细胞组织取出放人纱布中包好放入包埋盒中。
[0024]在固定步骤之前增加预固定步骤，预固定步骤是将所述包埋盒放入装有10%中性缓冲甲醛的脱水缸中，置入超声波组织处理仪或医用微波炉中15分钟；
固定、脱水、透明、浸蜡步骤为:将固定好的组织细胞标本继续放入超声波组织处理仪或微波炉中，用环保型生物合成剂，温度45°C，时间12分钟，共3次；
浸蜡时间在温度为62°C条件下10分钟；使用环保型生物合成剂脱水、透明、浸蜡同时进行，以达到石蜡浸入组织细胞的目的；
二次包埋步骤:将纱布中的组织取出，放入盛有液状石蜡的包埋框中，将成团的组织细胞打散后均匀的平铺在底部，待冷却后制成组织细胞蜡块；如经过初次包埋的组织，可将组织细胞标本周围凝固的琼脂或蛋清去除，再行石蜡包埋，以得到细胞数量的最大面积；组织细胞切片步骤:将上述经石蜡包埋的组织细胞蜡块在组织切片机上切成3?4微米切片，温度为65°C条件下，烤片时间10?15分钟；
所述染色包括HE染色和免疫组织化染色；
所述HE染色步骤如下:
(1)先将环保透明脱蜡液放入60°C恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液2分钟；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)苏木素染色5-10分钟；
(10)自来水冲洗2分钟；
(11)1%盐酸酒精分化，0.5%氨水返蓝；
(12)自来水流水冲洗10分钟；
(13)1%伊红染色I分钟；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脱水，环保透明脱蜡液2分钟，每步至少2次；
(15)环保型中性快干胶封片；
对部分无法诊断的蜡块，或科研需要的细胞悬液制成的蜡块，根据诊断需求进行免疫组织化染色，免疫组织化染色步骤如下:
(1)切片前先将环保透明脱蜡液放入58°C恒温干燥箱预热；
(2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟；
(3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟；
(4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟；
(5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液；
(6)95%乙醇冲洗2分钟；
(7)80%乙醇冲洗2分钟；
(8)自来水冲洗2分钟；
(9)蒸馏水I分钟；
(10)抗原修复，按第一抗体选择不同的修复液及修复方式；
(11)蒸馏水I分钟，至少3次；
(12)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；
(13)蒸馏水I分钟，至少2次，pH7.2的磷酸缓冲液，至少I次；
(14)滴加第一抗体； (15)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(16)滴加第二抗体；
(17)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次；
(18)DAB显色，自来水流水冲洗10分钟，
(19)苏木素浅染核后，吹风机吹干，经环保透明脱蜡液透明，中性快干胶封片。
[0025]上述固定、脱水、透明、浸蜡工艺所用环保型生物合成剂由广东省佛山市南海钧镒医疗设备有限公司生产，其主要成分为生物合成剂及脱水剂，不含甲醛和二甲苯，亲水性和亲脂性良好，无色无味，使用环保型生物合成剂脱水、透明、浸蜡同时进行。
[0026]上述环保透明脱蜡液为无锡市江源实业技贸公司生产。
[0027]当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明并不限于上述举例，本【技术领域】的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，制作方法包括将组织细胞标本经沉淀、离心处理后，提取组织细胞标本并加入一种环保型生物合成剂，经超声波组织处理仪或医用微波炉对组织细胞标本同步进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，石蜡包埋组织切片、染色及封片。
2.按照权利要求1所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述的组织细胞标本为胸腔积液或腹腔积液，所述提取组织细胞标本的具体步骤如下: (1)沉淀组织细胞:将抽取的胸腔积液或腹腔积液100~500ml放入干净的器皿中，静止1-2小时，使大量的胸腔积液或腹腔积液中的组织细胞自然沉降到器皿的底部； (2)采集组织细胞:弃去上清液，将底层的沉淀50~100mL置于多个容积为5ml的试管中离心，离心转速为2000~2500转/分，离心时间为5-10分钟，将上清液弃去，最后将所述多个试管内的组织细胞集中至一个试管中，直到获得较多的组织细胞数量； (3)凝固组织细胞:在最后沉淀组织细胞中加入10%中性缓冲甲醛，并用吸管将沉淀的组织细胞打散，再离心1-3分钟，至少静置15分钟后将半凝固状成团的组织细胞放入纱布中包好，放入包埋盒中。
3.按照权利要求2所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，对于离心后组织细胞数量少的标本: (1)所述采集组织细胞 步骤中，所述多个试管内的组织细胞集中至一个试管的形状为锥形的试管，使用锥形试管再次离心1-3分钟后，弃去上清液，加入少量的蛋白甘油，与组织细胞混合，使较少的组织细胞与蛋白相溶； (2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向组织细胞中加入无水酒精，1-3分钟后取出半凝固状的组织细胞放入纱布中包好，放入包埋盒中；无水酒精与蛋白凝固将组织细胞包裹在内，起支撑固定作用。
4.按照权利要求1所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述的组织细胞标本为尿液、淋巴液或细胞悬液，具体步骤如下: (1)离心采集组织细胞:先将大量的尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种，用大型离心机分多次离心，弃去上清液，最后将沉淀物集中到一个试管内离心，弃去上清液；淋巴液和细胞悬液因标本总量较少，但细胞含量大，可直接放入试管中离心后弃去上清液； (2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种组织细胞内加入熔点为45°C -52°C的5%琼脂或5%蛋白，室温下快速凝聚成团状，放入纱布中包好放入包埋盒中，起支撑作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或细胞悬液中的一种组织细胞内加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性缓冲甲醛，至少静置15分钟后，将已凝固的组织细胞取出放人纱布中包好放入包埋盒中。
5.按照权利要求3或4所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述的固定步骤之前增加预固定步骤，预固定步骤是将所述包埋盒放入装有10%中性缓冲甲醛的脱水缸中，置入超声波组织处理仪或医用微波炉中15分钟； 所述固定、脱水、透明、浸蜡步骤为:将固定好的组织细胞标本继续放入超声波组织处理仪或微波炉中，用环保型生物合成剂，温度45°C，时间12分钟，共3次； 浸蜡时间在温度为62°C条件下10分钟；使用环保型生物合成剂脱水、透明、浸蜡同时进行，以达到石蜡浸入组织细胞的目的；所述二次包埋步骤:将纱布中的组织取出，放入盛有液状石蜡的包埋框中，将成团的组织细胞打散后均匀的平铺在底部，待冷却后制成组织细胞蜡块；如经过初次包埋的组织细胞，可将组织细胞标本周围凝固的琼脂或蛋清去除，再行石蜡包埋，已得到组织细胞数量的最大面积； 所述组织细胞切片步骤:将上述经石蜡包埋的组织细胞蜡块在组织切片机上切成3~4微米切片，温度为65°C条件下，烤片时间10~15分钟； 所述染色包括HE染色和免疫组织化染色； 所述HE染色步骤如下: (1)先将环保透明脱蜡液放入60°C恒温干燥箱预热； (2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟； (3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟； (4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟； (5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液2分钟； (6)95%乙醇冲洗2分钟； (7)80%乙醇冲洗2分钟； (8)自来水冲洗2分钟； (9)苏木素染色5-10分钟； (10)自来水冲洗2分钟； (11)1%盐酸酒精分化，0.5%氨水返蓝； (12)自来水流水冲洗10分钟； (13)1%伊红染色I分钟； (14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脱水，环保透明脱蜡液2分钟，每步至少2次； (15)环保型中性快干胶封片； 对部分无法诊断的蜡块，或科研需要的细胞悬液制成的蜡块，根据诊断需求进行免疫组织化染色，免疫组织化染色步骤如下: (1)切片前先将环保透明脱蜡液放入58°C恒温干燥箱预热； (2)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第一次脱蜡2分钟； (3)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第二次脱蜡2分钟； (4)将切片浸入环保透明脱蜡液中进行第三次脱蜡2分钟； (5)无水乙醇洗去环保透明脱蜡液； (6)95%乙醇冲洗2分钟； (7)80%乙醇冲洗2分钟； (8)自来水冲洗2分钟； (9)蒸馏水I分钟； (10)抗原修复，按第一抗体选择不同的修复液及修复方式； (11)蒸馏水I分钟，至少3次； (12)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶； (13)蒸馏水I分钟，至少2次，pH7.2的磷酸缓冲液，至少I次； (14)滴加第一抗体；(15)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次； (16)滴加第二抗体； (17)pH7.2的磷酸缓冲液，2分钟，至少3次； (18)DAB显色，自来水流水冲洗10分钟， (19)苏木素浅染核后，吹风机吹干，经环保透明脱蜡液透明，中性快干胶封片。
6.按照权利要求1-4任一项所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述环保型生物合成剂的主要成分为生物合成剂及脱水剂，由广东省佛山市南海钧镒医疗设备有限公司生产。
7.按照权利要求5所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述环保型生物合成剂的主要成分为生物合成剂及脱水剂，由广东省佛山市南海钧镒医疗设备有限公司生产。
8.按照权利要求5所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述环保透明脱蜡液为无锡市江源实业技贸公司生产。
9.按照权利要求7所述的组织细胞标本石蜡包埋的制作方法，其特征在于，所述环保透明脱蜡液为无锡市 江源实业技贸公司生产。
【文档编号】G01N1/36GK103940658SQ201410141939
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】赵洁, 付海洋 申请人:青岛大学医学院附属医院