一种用于检测17β-雌二醇的光电适配体传感器的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测17β-雌二醇的光电适配体传感器的制备方法，所述光电适配体传感器以制备的硒化镉纳米粒子修饰二氧化钛纳米管作为基体电极，用壳聚糖和戊二醛将电极表面功能化后，将17β-雌二醇适配体滴于电极表面，制备得到17β-雌二醇的光电适配体传感器。与现有技术相比，本发明将具有特异性识别能力17β-雌二醇适配体和超灵敏的光电分析技术结合用于对环境内分泌干扰物17β-雌二醇的检测，不仅能获得了高的灵敏度，而且能抵制复杂基体环境的干扰获得高的选择性，在用于低浓度17β-雌二醇的检测中，获得了宽的工作曲线范围5×10-13-15×10-12mol/L，最低检测限可达3.3×10-14mol/L。且该17β-雌二醇传感器制备方法简单，成本低，稳定性及重现性好。
【专利说明】—种用于检测17 β -雌二醇的光电适配体传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境监测【技术领域】与纳米修饰电极，尤其是涉及一种用于检测17 β -雌二醇的光电适配体传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002]内分泌干扰物对人体和其他生物体的内分泌功能有严重的影响，近几年倍受关注，其中17 β-雌二醇被认为是对人体和动物内分泌系统危害最大的一种环境内分泌物。它是一种天然的雌性激素，主要来源于人类或家畜的排泄物，以及含有人工合成激素药物的使用和排放。当17 β-雌二醇通过食物链从外部环境进入人体和其他生物体后会，干扰正常的生理过程，影响人的生长发育，降低男性出生率，增长肿瘤的病发机会，近几年对它的研究受到全世界的广泛关注。因此，建立一种快速的，灵敏的分析方法具有非常重要的意义。
[0003]目前，测定17 β -雌二醇的方法主要有传统仪器分析方法例如HPLC，GC,这些方法具有好的灵敏度和准确性，然而分析过程往往非常复杂，费力且耗时。Seifert etal提出的酶联受体分析法(ELRA)主要利用人类的雌激素受体(hER)结合雌激素物质的特性，测定17 β-雌二醇，然而雌激素受体对其他的外源雌激素均具有强的亲和作用，所以该方法无法实现选择性检测。之后，报道了基于抗体的酶联免疫传感器对17 β -雌二醇测定，该方法的选择性比酶联受体法有了很大的提高，但是由于抗体本身需要在生物体内提取，提取纯化过程复杂、昂贵，且稳定性差，限制了其广泛地使用。
[0004]适配体，它具有类似于抗体的性质，是通过SELEX技术筛选出具有高度专一性结合靶物质的一系列短链核苷酸序列，同时它又有大量优于抗体的性质，如它可在体外化合成，合成周期短，不需要复杂的提取步骤，且稳定性好。由于其独特的性能，基于不同方法发展的适配体传感器具有广泛地应用前景。自17 β-雌二醇适配体被筛选出来后，用于17 β-雌二醇测定的适配体传感器已有大量报道。如荧光法，比色法，电化学适配体传感器等。其中荧光适配体传感器需要对适配体进行荧光基团标记来获得响应信号，然后标记过程复杂，费时且可能影响17 β-雌二醇和适配体间的亲和性。比色适配体传感器，方法简单，快速，但往往灵敏度较低。而电化学方法由于其方法简单、快速，且灵敏度高，对环境友好，宜实现在线监测等优点受到了越来越多的应用。在此基础上，发展起来的一光电分析法既具有光学方法又具有电化学方法的优点，且由于其具有光激发和电流检测不同的信号转化形式，所以它是一种超灵敏的分析方法。因此，我们设想将超灵敏的光电分析方法与具有高亲和力的17 β-雌二醇适配体结合构筑一种光电适配体传感器，用于实现高灵敏度，高选择性检测17 β-雌二醇，以此构筑的光电适配体传感器恰好满足环境水体中痕量17 β -雌二醇检测的迫切要求。
[0005]在本发明中我们选用在Ti基底上直立有序生长TiO2 NTs作为光学材料，由于TiO2NTs具有好的光电稳定性，大的比表面积，好的生物兼容性等优点，使其成为光电传感器设计的一种理想的传感材料。然而，由于TiO2 NTs具有较宽的带隙，只能吸收400纳米以下的可见光，这会使修饰在TiO2 NTs表面的生物分子失活，在某种程度上限制了它在生物光电传感器设计中的直接应用，需要用窄带的光电材料与TiO2 NTs复合以实现可见光下下的生物传感。因此我们将窄带的半导体材料CdSe通过简单的电化学沉积法一步修饰在TiO2NTs的内外，之后利用壳聚糖-戊二醛作为交联剂通过交连耦合的方法将17 β-雌二醇适配体修饰在复合的CMSe NPs-TiO2 NTs纳米材料电极上成功地构筑了光电适配体传感器。当17 β -雌二醇存在时，在传感界面形成了 17 β -雌二醇-适配体配合物，使电极表面的空间位阻增大，从而使光电流发生明显变化，实现了在可见光下对17 β -雌二醇定量测定。由此建立了一种光电适配体传感器的方法检测环境中低浓度的17 β -雌二醇。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种制备简单、成本低廉、检测速度快、高灵敏度高选择性的用于检测17 β-雌二醇的光电适配体传感器的制备方法。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
用于检测17 β-雌二醇的光电适配体传感器的制备方法，所述光电适配体传感器以硒化镉纳米粒子(CdSe NPs)修饰二氧化钛纳米管(TiO2 NTs)为基体电极，在二氧化钛纳米管内外修饰具有专一性识别能力的17 β-雌二醇适配体作为探针，并与光电分析技术结合构筑了一种简单、快速的光电适配体传感器，所述光电适配体传感器可实现高灵敏度和高选择性检测17 β -雌二醇；具体步骤如下:
(I)钛板依次用不同细度的磨砂纸机械打磨，接着将其放入二次蒸馏水和乙醇溶液中分别进行超声清洗5?10 min。然后将所得钛板用18%的HCl刻蚀10 min ;之后将其放在两电极体系中进行阳极化，钼片作阴极，钛板作阳极，两电极间间距为I cm，外加槽电压为40 V，在25°C温度时，阳极化2?3 h ;电解液采用0.3 wt% NH4F和3.0 Vo 1% H2O的乙二醇溶液。阳极化后的TiO2 NTs用二次蒸馏水冲洗并在氮气气氛中吹干。之后将其置于管式炉中在氧气气氛下500 °C烧结，得到晶形化的TiO2 NTs。
[0008](2)将步骤⑴制备得到的TiO2 NTs放入三电极体系，TiO2 NTs为工作电极，钼电极为辅助电极，饱和甘萊电极为参比电极，电解液为0.1 mol/L硫酸镉,0.1 mol/L无水硫酸钠和1.0 mmol/L 二氧化硒，在-0.7 V的恒电压下，沉积I?2 h ;将CdSe NPs均匀的沉积在TiO2 NTs的管内外，得到CdSe NPs-TiO2 NTs电极，并将CdSe NPs-TiO2 NTs电极在氮气气氛中，300 °C下烧结；
(3)将步骤⑵得到的CdSe NPs-TiO2 NTs电极留有IcmX Icm大小的电极面积，将I %乙酸的壳聚糖溶液滴在I cm2的CdSe NPs-TiO2 NTs电极上，在40 °C恒温下干燥。之后用0.1 mol/L NaOH和去离子水冲洗数次，并干燥。然后将5 %的戊二醛溶液滴在CdSeNPs-TiO2 NTs电极表面，室温下，反应30 min，用去离子水冲洗并干燥。
[0009](4)取末端氨基修饰的17 β-雌二醇适配体，滴于步骤(3)所得附有壳聚糖和戊二醛的NPs-TiO2 NTs电极表面，在4 °C下反应12?18 h。并冲洗以去除物理吸附的适配体，然后用牛血清蛋白堵塞未键合的戊二醛活性位点，以避免非特性吸附，得到17 β-雌二醇适配体修饰的CdSe NPs-TiO2 NTs的传感器，不用时，将其置于0.1 mol/L PBS (pH 7.41)的缓冲溶液。
[0010]本发明中，步骤(I)中二氧化钛纳米管烧结时的升温和冷却速率为2 V /min，步骤(2)中CdSe NPs-TiO2 NTs电极烧结时的升温和冷却速率为2 V /min。
[0011]本发明中，步骤(4)中所用的牛血清蛋白的浓度为3% (w/v)。
[0012]本发明制得的光电适配体传感器对17 β_雌二醇具有专一性的识别能力，避免了检测过程中其他内分泌物的干扰，并且该传感器具有高的灵敏度和良好的重现性。
[0013]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
(I)与现有的生物传感器相比，本发明采用CdSe NPs-TiO2 NTs为基体电极材料，不仅具有良好的生物兼容性有利于生物分子适配体的稳定负载并保持好的生物活性，而且由于其具有高度有序地纳米管阵列，能够提供大的比表面积和三维管式结构更有利于提高了适配体分子的负载量，进一步改善了传感器的灵敏度。
[0014](2)本发明将17 β -雌二醇适配体修饰在CdSe NPs-TiO2 NTs上制备得到的基于适配体的光电传感器首次用于17 β -雌二醇的检测。由于适配体对待测物质17 β -雌二醇的专一性结合能力，大大提高了传感器的选择性，使得该光电传感器能够在100倍于待测物质浓度的结构相似的内分泌干扰物质中选择性的识别出待测物质17 β -雌二醇。
[0015](3)与传统的检测17β-雌二醇的方法相比，本发明的利用了高灵敏的光电分析技术与高专一性识别能力的适配体有效地结合，首次实现了超灵敏，高专一性的检测环境中低浓度的17 β-雌二醇。
[0016](4)本发明中采用的仪器廉价便携，方法简单易行，检测限达到10_14 mol/L。适用于复杂环境体系中17 β -雌二醇的在线检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明中制备的CdSe NPs-TiO2 NTs的管式纳米结构图；
图2为本发明中制备光电适配体传感器在不同浓度的17 β-雌二醇溶液中的响应曲
线.图3为本发明中制备的光电适配体传感器在100倍浓度的干扰物存在体系中对17 β -雌二醇的高选择性图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0019]实施例1
一种高灵敏的高选择性的17 β-雌二醇光电适配体传感器，该传感器构筑在以CdSeNPs-TiO2 NTs为基体，将17 β-雌二醇的适配体修饰在CdSe NPs-TiO2 NTs的管内外。具体制作过程如下:
(I)钛板依次用不同细度的磨砂纸机械打磨，之后将其放入二次蒸馏水和乙醇溶液中分别进行超声清洗5?10 min。在阳极化之前，钛板用18%的HCl刻蚀10 min，之后将其放在两电极体系中进行阳极化，钼片作阴极，钛板作阳极，两电极间I cm，外加槽电压为40V，在温度为25 °C时，阳极化2?3 h。电解液包括0.3 wt% NH4F和3.0 Vo 1% H2O的乙二醇溶液。阳极化后的TiO2 NTs用二次蒸馏水冲洗并在氮气气氛中吹干。之后将其置于管式炉中在氧气气氛下500 °C烧结晶形化的TiO2 NTs，升温和冷却速率为2 V /min。
[0020](2)将制备的TiO2 NTs放入三电极体系，TiO2 NTs为工作电极，钼电极为辅助电极，饱和甘萊电极为参比电极，放入0.1 mol/L硫酸镉,0.1 mol/L无水硫酸钠，1.0 mmol/L二氧化硒的混合电解液中，在-0.7 V的恒电压下，沉积I~2 h.将CdSe NPs均匀的沉积在TiO2 NTs管内外(CdSe NPs-TiO2 NTs)并将电极在氮气气氛中，300 °C下烧结，升温和冷却速率为2 V /min，制备得到了晶形化的CdSe NPs-TiO2 NTs，如图1所示。
[0021](3)将上述方法制备得到的CdSe NPs-TiO2 NTs留有IcmX Icm大小的电极面积，将I %乙酸的壳聚糖溶液滴在I cm2的CdSe NPs-TiO2 NTs上，在40 °C恒温下干燥。之后用0.1 mol/L NaOH和去离子水冲洗数次，并干燥。然后将5 %的戊二醛溶液滴在电极表面，室温下，反应30 min,用去离子水冲洗并干燥。然后将20 μ L, 2 X l(T6mol/L的17 β -雌二醇适配体溶液滴涂到功能化的电极表面，在4 °C下组装12~18 h，并冲洗以去除物理吸附的适配体，然后用牛血清蛋白堵塞未键合的戊二醛活性位点，以避免非特性吸附。制备了 17 β-雌二醇适配体修饰的 CdSe NPs-TiO2 NTs，不用时置于 0.1 mol/L PBS (pH 7.41)的缓冲溶液。 [0022]实施例2
采用无水乙醇作溶剂配制I mmol/L 17 β -雌二醇的母液后，用0.1 mol/L PBS缓冲液(pH 7.41)稀释配制一系列不同浓度的17 β-雌二醇标准溶液。以0.1 mol/L PBSCpH 7.41)与0.1 mol/L抗坏血酸(AA)的缓冲液为电解液，在这里AA是作为一种电子牺牲剂。在0.0V电压下，电极与可见光源保持5 cm。以核酸适配体修饰的CdSe NPs-TiO2 NTs为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝为对电极的三电极体系中，在电化学池加入不同浓度的17 β-雌二醇时，每个样品加入需反应30 min后进行安培1-t曲线测定。由于适配体与其靶物质的专一性识别作用，17 β -雌二醇被捕获在电极表面，形成了适配体-17 β -雌二醇配合物，阻止AA向电极表面扩散，致使光电流降低。根据光电适配体传感器光电流随浓度的变化对其进行定量分析。且光电流的变化和17 β -雌二醇的浓度在5.0X 10_14~15Χ 10_12mol/L范围内成良好线性关系，相关系数0.9920.最低检测限为3.3 XlO^4 mol/L (3S/Μ)。这个最低检测限低于已报道的其他分析方法，且足以检测水体中微量存在的17β-雌二醇，如图2所示。
[0023]实施例3
将 17 β-雌二醇适配体修饰的 CdSe NPs-TiO2 NTs 放置于 0.1 mol/L PBS +0.1 mol/L AA (pH 7.41)作为电解液，将1.0X 10_12 mol/L 17 β -雌二醇分别与不同浓度的干扰物两两混合进行测定。考察了乙炔雌醇，雌三醇，壬基酚，间苯二酚，双酚Α，阿特拉津，邻苯二甲酸二乙酯六种环境内分泌干扰物对17 β -雌二醇测定的干扰实验。采用实施例2中测试条件，测定光电流响应，研究结果显示，100倍于7 β -雌二醇浓度的其他干扰物17 β -雌二醇的光电流造成的影响小于10.0%，如图3所示。可见，所制备的适配体传感器对17β-雌二醇具有高的选择性，其他结构相似或与17 β -雌二醇共存的六种环境内分泌物对它的测定并不造成干扰。
[0024]实施例4
采用光电适配体传感器对不同的环境污水中17 β-雌二醇的含量进行评估。首先选取了上海市杨浦区四个不同医院，如新华医院，曲阳医院，上海海军基地医院以及同济大学附属医院的医药废水进行分析。其次选取了同济大学校内不同景观湖水样品，由于在这些景观湖水中常有鱼，家禽类动物活动。此外还选取本实验室自来水进行分析。在实验前，所有的样品首先用普通的滤膜进行过滤，以除去颗粒物质和悬浮物质。之后用0.22 μ m的滤膜进行再次过滤。将过滤后的样品收集于棕色的玻璃瓶，并储存在4 °C冰箱。采用实例2的1-t曲线的方法，在可见光照射下，施加偏压0.0 V，将I mL样品溶液注入9 mL的0.1 mol/L PBS +0.1 mol/L AA (pH 7.41)的电解液中进行光电流测定，并根据工作曲线计算实际样品的浓度以及回收率。
【权利要求】
1.一种用于检测17β-雌二醇的光电适配体传感器的制备方法，其特征在于所述光电适配体传感器以硒化镉纳米粒子(CdSe NPs)修饰二氧化钛纳米管(TiO2 NTs)为基体电极，在二氧化钛纳米管内外修饰具有专一性识别能力的17 β -雌二醇适配体作为探针，并与光电分析技术结合构筑了一种简单、快速的光电适配体传感器，所述光电适配体传感器可实现高灵敏度和高选择性检测17 β -雌二醇；具体步骤如下: (1)钛板依次用不同细度的磨砂纸机械打磨，接着将其放入二次蒸馏水和乙醇溶液中分别进行超声清洗5~10 min ;然后将所得钛板用18%的HCl刻蚀10 min ;之后将其放在两电极体系中进行阳极化，钼片作阴极，钛板作阳极，两电极间间距为I cm，外加槽电压为40 V，在25°C温度时，阳极化2~3 h ;电解液采用0.3 wt% NH4F和3.0 Vo 1% H2O的乙二醇溶液；阳极化后的TiO2 NTs用二次蒸馏水冲洗并在氮气气氛中吹干；之后将其置于管式炉中在氧气气氛下500 °C烧结，得到晶形化的TiO2 NTs ； (2)将步骤⑴制备得到的TiO2NTs放入三电极体系，TiO2 NTs为工作电极，钼电极为辅助电极，饱和甘萊电极为参比电极，电解液为0.1 mol/L硫酸镉,0.1 mol/L无水硫酸钠和1.0 mmol/L 二氧化硒，在-0.7 V的恒电压下，沉积I~2 h ;将CdSe NPs均匀的沉积在TiO2 NTs的管内外，得到CdSe NPs-TiO2 NTs电极，并将CdSe NPs-TiO2 NTs电极在氮气气氛中，300 °C下烧结； (3)将步骤⑵得到的CdSeNPs-TiO2 NTs电极留有IcmX Icm大小的电极面积，将1%乙酸的壳聚糖溶液滴在I cm2的CdSe NPs-TiO2 NTs电极上，在40 °C恒温下干燥；之后用0.1 mol/L NaOH和去离子水冲洗数次，并干燥；然后将5 %的戊二醛溶液滴在CdSeNPs-TiO2 NTs电极表面，室温下，反应30 min，用去离子水冲洗并干燥； (4)取末端氨基修饰的17β-雌二醇适配体，滴于步骤(3)所得附有壳聚糖和戊二醛的NPs-TiO2 NTs电极表面，在4 °C下反应12~18 h ;并冲洗以去除物理吸附的适配体，然后用牛血清蛋白堵塞未键合的戊二醛活性位点，以避免非特性吸附，得到17β-雌二醇适配体修饰的CdSe NPs-TiO2 NTs的传感器，不用时，将其置于0.1 mol/L PBS (pH 7.41)的缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中二氧化钛纳米管烧结时的升温和冷却速率为2 °C/min，步骤(2)中CdSe NPs-TiO2 NTs电极烧结时的升温和冷却速率为2°C /min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所用的牛血清蛋白的浓度为3%(w/v)。
【文档编号】G01N27/26GK103940867SQ201410143464
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】赵国华, 范丽芳, 史慧杰, 刘梅川 申请人:同济大学