液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法。涉及的真菌毒素为：DON，D3G，NIV，3ADON，15ADON，FUSX及DOM等毒素。该方法采用改进的分散固相萃取法去除样品中脂类等干扰物质，然后处理后的样品通过液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行定性定量分析。本发明方法具有样品前处理简单快速经济、分析时间短、灵密度及回收率高、重现性和专属性好等优点，可适用于饲料及谷物样本中多组分真菌毒素的检测。为保障我国饲料及谷物类安全提供有效的技术支撑。
【专利说明】液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及饲料及谷物中真菌毒素测定的方法，具体涉及采用液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法。
【背景技术】
[0002]真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌产生的次级代谢产物。它们在农作物产品、食品及饲料中的污染情况日趋严重，对人和动物的健康造成了极大的危害。其中，B类单端孢霉烯族毒素是全球范围内发生率最高的一类真菌毒素。它是由镰刀菌产生且广泛污染小麦、大麦、玉米等谷物及其产品。此类毒素主要包括5种:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(D0N)，雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3AD0N)，15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15AD0N)以及镰刀菌酮-X(FUSX)。
[0003]DON能够引起动物拒食、呕吐、恶心、生长迟滞、神经内分泌紊乱和免疫抑制等症状。同时，它还具有很强细胞毒性(抑制DNA、RNA、蛋白质合成)、胚胎毒性(胚胎死亡、胎儿生长迟缓、功能发育不全)、一定致畸性、弱致癌性，并且影响人和动物的免疫系统。3AD0N及15AD0N是DON的乙酰化化合物。相较于DON的毒性，这两种毒素具有相似甚至更高的毒性。研究表明，这两种毒素在动物体内能够脱乙酰化形成D0N，潜在地增加了 DON的摄入量。目前关于NIV及FUSX的毒理学研究较少。但是少数研究发现肉鸡饲喂lmg/kg含NIV的饲料可出现轻微病理变化，而饲喂5mg/kg含DON的饲料则没有明显病变。
[0004]某些真菌毒素在植物体内酶的作用下能够结合一些极性较强的物质，如糖、氨基酸、硫酸盐等。这些结合态的毒素常规分析方法通常检测不到，因此被称为隐蔽型真菌毒素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(D3G)是近年来报道最多的隐蔽型毒素，它被广泛发现于谷物粮食类及啤酒发酵液中。研究表明，D3G毒性较低，但是人和动物摄入后在体内微生物的作用下它能够被水解为DON毒素单体而发挥毒性作用，目前饲料中隐蔽型DON的污染情况还没有报道。由于D3G潜在的健康风险，它引起了人们极大地关注。另外，脱环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DOM)是DON在体内的主要代谢产物。在自然谷物类中还没有被发现。考虑到动物源性组织可能被添加至饲料中作为蛋白质源，DOM也有必要进行检测。
[0005]欧盟于2006年颁布了猪饲料及饲料用谷物中DON的建议限量值分别为900 μ g/kg和8000 μ g/kg ;我国于2007年颁布了配合饲料中DON限量标准《GB13078.3-2007配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许量》规定:猪配合饲料、犊牛配合饲料及泌乳期动物配合饲料中最大限量为1000 μ g/kg，牛配合饲料及家禽配合饲料中最大限量为5000 μ g/kg。另夕卜，联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)在于2010年召开的第72次会议上，建议制定包含D0N、3AD0N及15AD0N毒素总量的限量标准。同时D3G被JECFA认为是潜在的DON摄入来源。对于NIV，FUSX由于缺乏相关的毒理学研究，目前还没有制定相关的限量标准。
[0006]目前谷物及食品中B类单端孢霉烯族毒素及D3G的检测方法已经有报道:《Journal of agricultural and food chemistry》，2012,46,11638 和《Mycotoxinresearch》，2012，28，181通过多功能MycoS印226或225柱净化后液相串联质谱法测定谷物、玉米及其产品中D0N，D3G，3AD0N及15AD0N的含量。此类方法前处理操作繁琐且成本较高，而且对D3G 回收率偏低(50% -60% );《Food additives and contaminants:Part A》,2009，26，507样本提取后未净化直接液相串联质谱法测定小麦和玉米中DON及D3G含量。此方法虽然前处理简单快捷，但是样品中含有的脂类等干扰物质严重减低检测灵敏度，而且长期使用对质谱离子源造成极大损坏。
[0007]目前饲料中隐蔽型DON及B类单端孢霉烯族类真菌毒素的污染情况还没有报道。同时，现有的检测此类真菌毒素的方法主要集中于食品及谷物类，未包括动物饲料。为了确保饲料安全及动物生产效率，有必要建立有效且可靠的分析方法来监控其发生及污染情况。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，而提供一种前处理方法简单经济快捷、灵敏度及准确度高的液相串联质谱法测定饲料及其谷物中B类单端孢霉烯族类及隐蔽型DON的方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案，具体包括如下步骤:
[0010](I)准确称取样品2g(精确至0.0lg)置于50mL离心管中，加入8mL乙腈/水溶液(84/16, ν/ν) ο润旋振荡2min后，超声提取0.5h。然后在4000r/min下离心5min,取2mL上清液待净化。
[0011](2)将2mL上清液转移至15mL锥形离心管中，然后加入IOOmg无水硫酸镁及ImL正己烧，剧烈润旋Imin后在4000r/min下离心5min,正己烧层去除。剩余的溶液在40°C下氮气吹干，加入500 μ L醋酸铵水溶液(5mM)剧烈涡旋，最后样品溶液过0.22 μ m尼龙滤膜待分析。
[0012](3)将步骤⑵获得的待检测样品通过液相色谱串联质谱仪进行分析，分别获得B族单端孢霉烯族类及D3G残留量的结果。
[0013](4)步骤(3)中所使用的液相分析条件具体如下:
色谱柱:Agilent Extend_C18column (150mmX 3.0mm, 3.5 μ m),柱温:40°C,流速:
0.3mL/min,进样量:5 μ L ;
流动相:Α相:5mM醋酸铵水溶液，B相:甲醇；
梯度洗脱程序:0-lmin，20 % B ； l_5min，90 % B, 5_6min90 % B, 6-6.5min, 20 % B,
6.5-8min20% B ；
[0014](5)步骤(3)中所使用的质谱分析条件具体如下:
离子源模式:正负离子模式(ESI+和ESF);喷雾电压:4.5kv(ESI+)和-3.5ky (ESF)；加热块温度:400°C ;离子传输管温度:250°C ;雾化气及干燥气流速:3mL/min和15mL/min ；7种真菌毒素的质谱参数见表I。
表I各真菌毒素的质谱参数
【权利要求】
1.一种液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤: (1)称取粉碎后饲料或谷物样品，加入提取溶液，涡旋及超声振荡提取后离心，取上清液待净化； (2)上清液转移至含有无水硫酸镁及脱脂溶剂的离心管中，涡旋振荡后，去除正己烷层；剩余溶液氮气吹干后定容； (3)定容后的样品通过液相色谱串联质谱仪进行7种真菌毒素的定性定量分析。
2.如权利要求1所述一种液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法，其特征在于所述步骤(I)中饲料及谷物样本为:猪饲料，鸡饲料及玉米。
3.如权利要求1所述液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法，其特征在于所述步骤(I)中的提取溶液为84%乙腈-水溶液，及其甲醇-水溶液。
4.如权利要求1所述一种液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法，其特征在于所述步骤(2)中脱脂剂为包括正己烷、石油醚，及其它可以去除脂类物质的有机溶剂。
5.如权利要求1所述一种液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法，其特征在于所述步骤(3)中所测真菌毒素包括:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，3_乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3AD0N)，15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15AD0N)以及镰刀菌酮-X (FUSX)，脱氧雪腐镰刀菌烯醇_3_葡萄糖苷(D3G)及脱环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DOM)。
6.如权利要求1所述一种液相色谱串联质谱法测定饲料及谷物中7种真菌毒素的方法，其特征在于所述步骤(3)中液相串联质谱中色谱柱为包括但不限于C18，C8色谱柱，流动相包括但不限于甲醇、乙腈或含水溶液。
【文档编号】G01N30/02GK103969364SQ201410152909
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】武爱波, 赵志勇, 宋素泉, 王建华, 刘娜, 聂冬霞, 杨宪立, 林善海 申请人:上海市农业科学院, 上海科立特农产品检测技术服务有限公司