一种测定天然水体中胞内微囊藻毒素的预处理方法
【专利摘要】一种测定天然水体中胞内微囊藻毒素的预处理方法，其步骤为：1）过滤水样前镜检，根据水样的浑浊程度和微囊藻的检出效果确定需要的水量；2）过滤水样，将滤膜剪碎涡旋混匀后进行细胞破碎，并离心分离出上清液；3）在固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液；4）洗脱富集在固相萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待测。本发明的方法简单、灵活性高，可操作强，适用于长期测定不同季节不同区域天然水体中胞内微囊藻毒素的预处理。
【专利说明】一种测定天然水体中胞内微囊藻毒素的预处理方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环保【技术领域】，具体涉及一种长期测定不同季节、不同天然水体中常见胞内微囊藻毒素的水样预处理方法。
【背景技术】
[0002]近年来，水体的富营养化现象日趋严重，从而导致蓝藻水华频繁发生。淡水蓝藻中能产生毒素的有四十余种，其中微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是出现频率最高和造成危害最严重的蓝藻毒素，严重危害水体的生态系统健康。现已发现了 80多种微囊藻毒素的同分异构体，最常见的是MC-LR、MC-RR和MC-YR，其中以MC-LR的毒性最大。
[0003]藻毒素分为胞内藻毒素和胞外藻毒素两种，通常情况下，藻毒素都存在于藻细胞内，但在蓝藻大量繁殖的情况下，藻类代谢、衰老或者死亡会释放出藻毒素，因此，胞内藻毒素会成为严重的安全隐患。目前胞内微囊藻毒素的预处理可以利用干藻粉或者直接利用水体中的微囊藻，但天然水体中的微囊藻少，而且长期测定不同季节、不同区域天然水中的微囊藻毒素需要制备干藻粉，一方面需要很大的工作量，另一方面降低了其精准性。而现有的直接利用天然水中微囊藻的预处理需要IOL或者2L水样，一方面会导致需要水量过多而加大采样负荷、延长过滤时间，另一方面可能会导致微囊藻过少所取水量过小检不出微囊藻毒素。传统方法采用的细胞破碎时间以及离心次数一致，不适用于不同季节微囊藻含量变化幅度大的情况，精准性不高。总之，现有的测定胞内微囊藻毒素的预处理方法不适用于不同区域的天然水体，没有形成一个系统的可执行的预处理方法。
[0004]因此为了高效的测定不同天然水体中胞内微囊藻毒素的含量，其预处理方法的确定和改进是一项亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种测定天然水中胞内微囊藻毒素的预处理方法，以解决【背景技术】中存在的工作量大、精准性不高、适应性不强等问题。为实现上述目的，本发明提供的测定胞内微囊藻毒素的水样预处理方法，其步骤为:
[0006]I)过滤水样前镜检，根据水样的浑浊程度和微囊藻的检出效果确定需要的水量；
[0007]2)过滤水样，将滤膜剪碎涡旋混匀后进行细胞破碎，并离心分离出上清液；
[0008]3)在活化过的固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液，并除杂；
[0009]4)洗脱富集在固相萃取萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待测。
[0010]所述的水样预处理方法中，步骤I)的水样是用电子显微镜镜检兼目测。
[0011]所述的水样预处理方法中，步骤2)是加入5%的乙酸涡旋混匀，通过超声细胞破碎仪进行间歇破碎10-15min至无块状滤膜。
[0012]所述的水样预处理方法中，步骤2)的离心重复2-4次至离心管中颜色接近原滤膜色，每次离心前先进行涡旋混匀。
[0013]所述的预处理方法中，步骤3)的富集是用Waters HLB固相萃取小柱，流速为3mL/min ;而活化和除杂时流速为5mL/min，在除杂之前固相萃取柱中的液体不能低于上层筛片。
[0014]所述的水样预处理方法中，步骤4)是用含有0.1%三氟乙酸(TFA)的90%的甲醇溶液洗脱。
[0015]本发明的技术效果是:
[0016]本发明在过滤水样前镜检，根据水样的浑浊程度和微囊藻的检出效果确定需要的水量，节省时间，避免藻残留，提高了过滤水样的利用率，适用于测定不同季节不同区域的大批量水样；将滤膜剪碎涡旋混匀后进行细胞破碎，而且破碎时间由滤膜的破碎程度决定有助于藻细胞的彻底破碎，提高效率；进行细胞破碎及离心之前涡旋混匀，有利于微囊藻毒素的释放；离心的次数由离心管中滤膜的颜色决定，可以在最短的时间最有效地将沉淀与上清液分离，并将释放出的微囊藻毒素收集起来，减少预处理过程产生的误差固相萃取小柱中进行活化、萃取时液体不能低于上层筛片，都有助于增加小柱的活性；富集过程的流速比活化和除杂过程的流速低，使得释放的胞内微囊藻毒素更好更彻底的富集在小柱内。用含有0.1%TFA的90%甲醇溶液洗脱，能更有效地将富集在HLB小柱中的微囊藻毒素洗脱下来。
【具体实施方式】
[0017]本发明的水样预处理方法，包括如下步骤:
[0018]I)混匀水样后利用显微镜镜检，可明显检测出微囊藻存在，水样浑浊取0.5L，不浑浊取IL ;可检出微囊藻存在，水样浑浊取1L，不浑浊取1.5L ;不可检出微囊藻存在，水样浑浊取2L，不浑浊取3L，通过0.45um的GF/C滤膜过滤。
[0019]2)滤膜在_20°C下冷冻24小时解冻后剪碎至IOmL离心管中，加5%的乙酸涡旋混勻Imin后在冰浴条件下间歇破碎10-15min至离心管中无块状滤膜，每隔5min润旋混勻
0.5min,功率为50%。在4°C, 8000r/min的条件下离心12min,收集上清液。再重复离心2_4次至离心管中颜色接近原滤膜色，每次离心前加入5%的乙酸后涡旋混匀0.5min，合并上清液。
[0020]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上层筛片时再用15mL的纯净水进行活化，流速为5mL/min。然后将收集的上清液以3mL/min的流速通过萃取柱，富集结束后分别以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除杂，流速为5mL/min，在除杂之前固相萃取柱中的液体不能低于上层筛片。
[0021]4)用IOmL含有0.1%TFA的90%甲醇溶液洗脱富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速为3mL/min ;将收集的洗脱液在40°C的条件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分两次溶洗至lmL，于_20°C的条件下保存待测。
[0022]本发明采用0.1%TFA的90%甲醇溶液比0.1%的纯甲醇和90%的甲醇溶液的洗脱效果好，回收率高，重现性好，具体回收率如表I所示。
[0023]以下列举3个实施例，对本发明作进一步的说明。
[0024]实施例1
[0025]7月阳澄湖水体中三种胞内微囊藻毒素的预处理包括如下步骤:
[0026]I)水样混匀后不浑浊，镜检过程中未看到微囊藻的存在，取3L水样过滤。[0027]2)滤膜在_20°C下冷冻24小时解冻后剪碎至IOmL离心管中，加5%的乙酸涡旋混勻Imin后通过超声细胞破碎仪在冰浴条件下间歇破碎IOmin,每隔5min润旋混勻0.5min,功率为50%。在4°C，8000r/min的条件下离心12min，收集上清液。再重复离心2次，每次离心前加入5%的乙酸后涡旋混匀0.5min,合并上清液。
[0028]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上层筛片时再用15mL的纯净水进行活化，流速为5mL/min。然后将收集的上清液以3mL/min的流速通过萃取柱，富集结束后分别以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除杂，流速为5mL/min，在除杂之前固相萃取柱中的液体不能低于上层筛片。
[0029]4)用IOmL0.1%TFA的90%甲醇溶液来洗脱富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速为3mL/min，将收集的洗脱液在40°C的条件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分两次溶洗至lmL，于-20°C条件下保存待测。
[0030]实施例2
[0031]7月太湖水体中三种胞内微囊藻毒素的预处理方法
[0032]I)水样混匀后浑浊，镜检过程中可明显看到微囊藻的存在，取0.5L水样过滤。
[0033]2)滤膜在_20°C下冷冻24小时解冻后剪碎至IOmL离心管中，加5%的乙酸涡旋混勻Imin后通过超声细胞破碎仪在冰浴条件下间歇破碎15min,每隔5min润旋混勻0.5min,功率为50%。在4°C，8000r/min的条件下离心12min，收集上清液。再重复离心4次，每次离心前加入5%的乙酸后涡旋混匀0.5min,合并上清液。
[0034]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上层筛片时再用15mL的纯净水进行活化，流速为5mL/min。然后将收集的上清液以3mL/min的流速通过萃取柱，富集结束后分别以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除杂，流速为5mL/min，在除杂之前固相萃取柱中的液体不能低于上层筛片。
[0035]4)用IOmL0.1%TFA的90%甲醇溶液来洗脱富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速为3mL/min，将收集的洗脱液在40°C的条件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分两次溶洗至lmL，于-20°C条件下保存待测。
[0036]实施例3
[0037]4月太湖水体中三种胞内微囊藻毒素的预处理方法
[0038]I)水样混匀后浑浊，镜检过程中可看到微囊藻的存在，取IL水样过滤。
[0039]2)滤膜在_20°C下冷冻24小时解冻后剪碎至IOmL离心管中，加5%的乙酸涡旋混勻Imin后通过超声细胞破碎仪在冰浴条件下间歇破碎15min,每隔5min润旋混勻0.5min,功率为50%。在4°C，8000r/min的条件下离心12min，收集上清液。再重复离心3次，每次离心前加入5%的乙酸后涡旋混匀0.5min,合并上清液。
[0040]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上层筛片时再用15mL的纯净水进行活化，流速为5mL/min。然后将收集的上清液以3mL/min的流速通过萃取柱，富集结束后分别以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除杂，流速为5mL/min，在除杂之前固相萃取柱中的液体不能低于上层筛片。
[0041]4)用IOmL0.1%TFA的90%甲醇溶液来洗脱富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速为3mL/min，将收集的洗脱液在40°C的条件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分两次溶洗至lmL，于-20°C条件下保存待测。[0042]表1:不同洗脱液MC-LR、MC-RR和MC-YR回收率比较
[0043]
【权利要求】
1.一种适用于测定天然水体中胞内微囊藻毒素的预处理方法，其步骤为: 1)过滤水样前镜检，根据水样的浑浊程度和微囊藻的检出效果确定需要的水量； 2)过滤水样，将滤膜剪碎涡旋混匀后进行细胞破碎，并离心分离出上清液； 3)在活化过的固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液，并除杂； 4)洗脱富集在固相萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待测。
2.根据权利要求1所述的水样预处理方法，其中，步骤I)的水样是用电子显微镜镜检兼目测。
3.根据权利要求1所述的水样预处理方法，其中，步骤2)是加入5%的乙酸涡旋混匀，通过超声细胞破碎仪进行间歇破碎10-15min至无块状滤膜。
4.根据权利要求1所述的水样预处理方法，其中，步骤2)的离心重复2-4次至离心管中颜色接近原滤膜色，每次离心前先进行涡旋混匀。
5.根据权利要求1所述的预处理方法，其中，步骤3)的富集是用WatersHLB固相萃取小柱，流速为3mL/min ;而活化和除杂时流速为5mL/min，在除杂之前固相萃取柱中的液体不能低于上层筛片。
6.根据权利要求1所述的水样预处理方法，其中，步骤4)是用含有0.1%三氟乙酸的90%甲醇溶液洗脱。
【文档编号】G01N1/28GK103940651SQ201410155218
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】苏婧, 席北斗, 魏代春, 霍守亮, 纪丹凤, 王骥 申请人:中国环境科学研究院