人h-fabp胶体金检测试纸及其制备方法
【专利摘要】一种人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，包括胶体金颗粒的制备、金标记抗体的制备、金标结合物垫的制备、包被硝酸纤维素膜、样品处理垫的制备及试纸的组装等步骤，本发明主要通过对检测试纸制备过程中的缓冲溶液体系进行设计，解决了现有的检测试纸存在的检测时间长、特异性差以及经济成本高等问题。本发明还公开了一种人H-FABP胶体金检测试纸及其应用。
【专利说明】人H-FABP胶体金检测试纸及其制备方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及体外诊断医学检验领域，具体涉及一种人心脏型脂肪酸结合蛋白(Heart-type Fatty Acid Binding Protein, H-FABP)胶体金检测试纸及其制备方法。
【【背景技术】】
[0002]近年来心脑血管疾病特别是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)成为了我国人群患病率极高，死亡率稳居榜首的杀手。在治疗的“黄金6h”内使患者迅速进入绿色治疗通道，能够大大降低致残率和致死率。所以对于AMI准确、快速的诊断具有重要的医学意义。
[0003]H-FABP作为早期心肌诊断的一种小分子可溶性蛋白生化标志物，它存在于心肌细胞胞浆内，含量丰富，当心肌受损时，心肌细胞膜完整性被破坏，H-FABP可快进入血液，在发病0-3h即可在血液中检测到，3-6h达到峰值，12-24h恢复正常水平，其具有心肌特异性，在心肌中浓度约为骨骼肌的210倍，且正常人血液中含量极少(<5ng/ml)，所以H-FABP作为早期AMI的检测指标有其重要意义。[0004]目前H-FABP的检测方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、光栅耦合传感器技术、时间分辨免疫荧光测定法、快速乳胶微粒增强免疫比浊法、免疫传感器技术等。虽然这些方法灵敏度高，特异性好，但是这些检测方法需要特殊大型仪器，操作复杂、检测时间较长，不利于社区基层医院推广利用。专利CN102298055A和CN102226811A公开了应用免疫胶体金技术对H-FABP进行检测的相关技术，前者应用金纳米壳颗粒代替实心金颗粒作为标记物，使检测结果易于观察，灵敏度< 7ng/ml，但是其制备工艺复杂，检测时间长达15-30min。后者通过检测尿液中的H-FABP，缩短了检测时间，具有无创性、样本无需处理的优势，但是其制备过程需用银增强法，提高了经济成本。另一发面，H-FABP在尿液中出现时间晚于静脉血，不利用患者快速进入治疗通道。因此，该等技术公开的胶体金检测技术存在检测时间长、诊断敏感度、特异性不好等问题。例如，梁晓芳等在其文章中指出，利用已上市H-FABP胶体金检测产品诊断AMI的敏感度仅为86.27%，特异性为84.91% (梁晓芳，崔建国，李春坚等，心脏型脂肪酸结合蛋白快速诊断试纸在急性心肌梗死患者中的应用研究[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2009，29(8):1133-1137)。此外，用于心肌类产品研发的主要生物原料即抗体对一般均采用进口抗体，经济成本较高，导致终端产品价位偏高，不利于POCT在社区基层医院的推广应用。
【
【发明内容】
】
[0005]本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种人H-FABP胶体金检测试纸，该检测试纸具有检测时间短、特异性好，经济成本低等优点。
[0006]本发明还提供一种所述人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法。
[0007]本发明又提供一种所述人H-FABP胶体金检测试纸在检测人血液中H-FABP的应用。[0008]本发明再提供一种所述人H-FABP胶体金检测试纸在检测人尿液中H-FABP的应用。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:1.一种人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0010](I)胶体金颗粒的制备
[0011]利用柠檬酸三钠还原法，采用磁力加热搅拌器烧制颗粒均一的直径约为40nm的胶体金颗粒，分光光度计测其最高峰在530±5nm，OD值在2.0 ± 0.2 ;
[0012](2)金标记抗体的制备
[0013]利用碳酸钾将制备好的胶体金溶液调节PH至7.5±0.05，再用双蒸水或PBS稀释标记抗体至浓度为lmg/ml，然后逐滴加入搅拌的胶体金溶液中，保持搅拌10-15min，加10% BSA至终浓度为0.2%，封闭裸露金颗粒，继续搅拌20-30min，4°C，4000r/min离心30min，利用缓冲溶液4重悬洗涤，再离心，重复2次，浓缩备用；缓冲溶液4由磷酸缓冲液和吐温-20组成，其中磷酸缓冲溶液摩尔浓度为lO-lOOmM，吐温-20质量终浓度为
0.05% -0.1% ；
[0014](3)金标结合物垫的制备
[0015]利用缓冲溶液I处理金标结合物垫，在室温、湿度< 20%的条件下过夜干燥备用，并使用喷膜仪将金标记的标记抗体喷于处理好的金标结合物垫上并真空冷冻干燥备用；缓冲溶液I由Tris-Hcl、蔗糖、BSA、柠檬酸三钠和曲拉通-100组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为lO-lOOmM，蔗糖质量终浓度为3% -10 %，BSA质量终浓度为I % _3%，柠檬酸三钠质量终浓度为0.5% -1.0%，曲拉通-100质量终浓度为0.1% -0.5% ;
[0016](4)包被硝酸纤维素膜
[0017]将捕捉抗体和羊抗鼠分别用缓冲溶液3稀释，使用划膜仪划膜包被于硝酸纤维素膜检测区和质控区，37°C干燥48小时备用；缓冲溶液3由Tris-Hcl和蔗糖组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为lO-lOOmM，蔗糖质量终浓度为1% -5% ;
[0018](5)样品处理垫的制备
[0019]利用缓冲溶液2浸泡玻璃纤维样品垫，在室温、湿度< 20%的条件下过夜干燥，切割备用；缓冲溶液2由Tris-Hcl、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、S16和吐温-20组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，BSA质量终浓度为0.5%-5%，聚乙烯吡咯烷酮质量终浓度为0.5% -5%，S16质量终浓度为0.05% -1.0%，吐温-20质量终浓度为0.01% -0.5% ;
[0020](6)试纸的组装
[0021]按样品垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，并切割，包装；
[0022]其中所述标记抗体与捕捉抗体为二株可互相形成夹心配对的抗人H-FABP抗体。
[0023]进一步地，所述的H-FABP为人血液中的H-FABP或人尿液中的H-FABP。
[0024]进一步地，所述缓冲溶液4中磷酸缓冲溶液摩尔浓度为10mM，吐温-20质量终浓度为0.1 所述缓冲溶液I中TriS-Hcl摩尔浓度为10mM，蔗糖质量终浓度为10%，BSA质量终浓度为3%，柠檬酸三钠质量终浓度为0.5%,曲拉通-100质量终浓度为0.5%;所述缓冲溶液3中Tris-Hcl摩尔浓度为10mM，蔗糖质量终浓度为5% ;所述缓冲溶液2中Tris-Hcl摩尔浓度为lOOmM，BSA质量终浓度为I %，聚乙烯吡咯烷酮质量终浓度为1%，S16质量终浓度为0.5%，吐温-20质量终浓度为0.05%。
[0025]进一步地，所述支撑底板为PVC或PS板。
[0026]进一步地，所述的金标结合物垫为玻璃纤维或聚酯膜。
[0027]本发明还提供一种利用所述的制备方法制成的人H-FABP胶体金检测试纸。
[0028]一种所述人H-FABP胶体金检测试纸在检测人血液中H-FABP的应用。
[0029]一种所述人H-FABP胶体金检测试纸在检测人尿液中H-FABP的应用。
[0030]与现有技术相比，本发明的有益效果主要有以下几个方面:
[0031](I)本发明的试剂盒检测速度快，可在IOmin左右判读结果，缩短了样本周转时间。在缓冲溶液I中去掉通常所用聚乙二醇PEG-20000等大分子交联稳定剂，添加适量的柠檬酸三钠盐，使被标记蛋白与胶体金易于形成稳定状态，同时使标记复合物能够迅速复溶释放。这是因为:PEG等作为一种大分子物质，一方面可以用来封闭未被目标蛋白完全包被的裸露的金颗粒，另一方面可以稳定胶体悬液的形成。但是由于其分子量较大，使金标记复合物极易发生交联作用，同时也使目标蛋白与胶体金颗粒结合的空间位阻变大，影响胶体金标记效果，使之成为导致金标记复合物在层析过程中出现二次释放或释放速度较慢、释放不均匀、死金等现象的重要原因之一，从而最终影响试剂灵敏度性能。本发明专利通过去掉缓冲溶液I中大分子物质，添加适量的柠檬酸三钠盐，增加缓冲溶液I的离子浓度，可以改变胶体金颗粒的zeta电位,对zeta电位扩散层起到扩充作用。当离子强度达到一定浓度范围时，达到标记最佳状态，所以改善了标记效果，促进金标复合物快速释放，缩短检测时间，但灵敏度没有降低反而有所提高，达到6ng/ml。
[0032](2)本发明试剂盒特异性强。利用常规血源性和免疫类因子以及其他心肌类标志物和8种不同型FABP等交叉干扰性物质测试本发明试剂盒均未发现交叉干扰现象，同时测试65份血清标本，只出现I例假阴性。这是因为有些样品非常具有粘性(例如血清)，它会使流速减慢，当检测体系中没有足够的活性物质来使金标沿着检测带移动时，胶体金颗粒会粘附在包被抗体带上对结果产生干扰，影响诊断的特异性。本发明专利通过对样品垫处理液即缓冲溶液2中的表面活性剂种类和使用量等的优化选择，减少了检测中交叉干扰现象，优化了展层效果，提高了试剂的特异性性能指标。
[0033](3)用于本发明的主要生物原材料即抗体对使用量大大减少，直接降低了产品的经济成本，增加了产品的市场竞争力。通过优化整个体系缓冲溶液的PH、离子强度和表面活性剂种类及用量等关键方面，使抗原抗体之间的免疫反应性达到最佳状态，层析效果最好，减少了主要生物材料即抗体对的使用量，直接降低了经济成本。现有行业内常规用于标记的抗体标记量都在IOug左右，用于包被的包被抗体的包被浓度在1.0mg/m左右，有的甚至达到2.0mg/ml、2.5mg/ml,而本发明专利中提供的试剂盒标记量为5ug,包被浓度为
0.2-0.5mg/ml，这大大降低了产品的经济成本，增强了产品的市场竞争力。这是因为抗原抗体之间的免疫反应具有特异性、比例性和可逆性的特点的原因。特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的，所以选择合适的PH值和离子强度对于维持抗原抗体空间结构具有重要作用；比例性是只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原稍过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应；可逆性是由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，溶液环境对其结合会有很大影响。所以通过优化各体系配方，就可以使抗原抗体的反应性达到最大化，即可实现检测要求，而不需要使用大量抗体，造成浪费，增加成本。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0034]图1为本发明检测试纸的结构示意图。
[0035]图2为本发明检测试纸的另一结构示意图。
【【具体实施方式】】
[0036]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0037]本发明检测试纸采用双抗体免疫夹心法检测H-FABP，将待测样品滴加到样品垫上，样品向上层析到金标结合物垫，金标抗体复溶随样品一起层析至检测区和质控区，如果待测样品里有H-FABP，在检测区和质控区将各出现一条紫红色的线；反之，则只在质控区出现紫红色线；也可能出现质控区不出线，则视为试纸条失效。
[0038]请一并结合图1和图2所示，本发明检测试纸包括设定在PVC或者PS支撑底板(未视出)上依次相连的样品垫1、金标结合物垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4 ;在所述硝酸纤维素膜3上设有检测抗体区T和质控抗体区C ;在金标结合物垫2上设有金标抗体，所述的金标结合物垫2可以为玻璃纤维或聚酯膜，所述样品垫3为玻璃纤维，所述的金标抗体为标记抗体，检测区抗体为捕捉抗体，所述标记抗体与捕捉抗体为二株可相互配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体。所述样品垫I位于支撑底板一端，该样品垫21的一端位于金标结合物垫2上，与金标结合物垫2交错重叠2mm ;所述金标结合物垫2位于硝酸纤维素膜3上，与所述硝酸纤维素膜3交错重叠2mm ;吸水垫4则在支撑底板的另一端，位于所述硝酸纤维素3上，与所述硝酸纤维素3交错重叠2-3mm。
[0039]按如下配方配制本发明检测试纸制备涉及的缓冲体系溶液:
[0040]
缓冲溶液l:Tris-HdIOmM-WOmM(摩尔浓度)
蔗糖3%-10% (质量浓度)
+血清白蛋白(BSA+)1%-3% (质量浓度)
柠檬酸三鈉0.5%-1.0% (质量浓度)
雨拉通-1000.1%-0.5% (质量浓度)
缓冲溶液21 Tris-H clI OMm-100mM(摩尔浓度)
BSA0.5%-5% (质量浓度)
聚乙烯飛咯烷晒0.5%-5% (质量浓度)
S160.05-1.0% (质量浓度)
吐温-20 (T-20)0,01%-0.5% (质量浓度)
[0041][0042]缓冲溶液3:Tris-H clIOmM-1OOmM(摩尔浓度)
[0043]蔗糖1^-5^(质量浓度)
[0044]缓冲溶液4:磷酸缓冲液IOmM-1OOmM (摩尔浓度)
[0045]吐温-200.05% -0.1% (质量浓度)
[0046]实施例1:H-FABP胶体金检测试纸的制备
[0047]在本实施例中，按如下配方配制本发明检测试纸制备涉及的缓冲体系溶液:
[0048]
【权利要求】
1.一种人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)胶体金颗粒的制备 利用柠檬酸三钠还原法，采用磁力加热搅拌器烧制颗粒均一的直径约为40nm的胶体金颗粒，分光光度计测其最高峰在530±5nm，OD值在2.0±0.2 ； (2)金标记抗体的制备 利用碳酸钾将制备好的胶体金溶液调节PH至7.5±0.05，再用双蒸水或PBS稀释标记抗体至浓度为lmg/ml，然后逐滴加入搅拌的胶体金溶液中，保持搅拌10-15min，加10% BSA至终浓度为0.2%封闭裸露金颗粒，继续搅拌20-30min，4°C，4000r/min离心30min，利用缓冲溶液4重悬洗涤，再离心，重复2次，浓缩备用；缓冲溶液4由磷酸缓冲液和吐温-20组成，其中磷酸缓冲溶液摩尔浓度为lO-lOOmM，吐温-20质量终浓度为0.05% -0.1% ； (3)金标结合物垫的制备 利用缓冲溶液I处理金标结合物垫，在室温、湿度< 20%的条件下过夜干燥备用，并使用喷膜仪将金标记的标记抗体喷于处理好的金标结合物垫上并真空冷冻干燥备用；缓冲溶液I由Tris-Hcl、蔗糖、BSA、柠檬酸三钠和曲拉通-100组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为10-100mM，蔗糖质量终浓度为3% -10 %，BSA质量终浓度为1% _3%，柠檬酸三钠质量终浓度为0.5% -1.0%，曲拉通-100质量终浓度为0.1% -0.5% ; (4)包被硝酸纤维素膜 将捕捉抗体和羊抗鼠分别用缓冲溶液3稀释，使用划膜仪划膜包被于硝酸纤维素膜检测区和质控区，37°C干燥48小时备用；缓冲溶液3由Tris-Hcl和蔗糖组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为lO-lOOmM，蔗糖质量终浓度为1% -5% ; (5)样品处理垫的制备 利用缓冲溶液2浸泡玻璃纤维样品垫，在室温、湿度< 20%的条件下过夜干燥，切割备用；缓冲溶液2由Tris-Hcl、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、S16和吐温-20组成，其中Tris-Hcl摩尔浓度为lO-lOOmM，BSA质量终浓度为0.5 % -5 %，聚乙烯吡咯烷酮质量终浓度为.0.5% _5%，S16质量终浓度为0.05% -1.0%，吐温-20质量终浓度为0.01% -0.5% ； (6)试纸的组装 按样品垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，并切割，包装； 其中所述标记抗体与捕捉抗体为二株可互相形成夹心配对的抗人H-FABP抗体。
2.如权利要求1所述的人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，所述的H-FABP为人血液中的H-FABP或人尿液中的H-FABP。
3.如权利要求1所述的人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液4中磷酸缓冲溶液摩尔浓度为10禮，吐温-20质量终浓度为0.1 所述缓冲溶液I中Tris-Hcl摩尔浓度为10禮，蔗糖质量终浓度为10%，BSA质量终浓度为3%，柠檬酸三钠质量终浓度为0.5%，曲拉通-100质量终浓度为0.5% ;所述缓冲溶液3中Tris-Hcl摩尔浓度为10mM，蔗糖质量终浓度为5% ;所述缓冲溶液2中Tris-Hcl摩尔浓度为lOOmM，BSA质量终浓度为1%，聚乙烯吡咯烷酮质量终浓度为I %，S16质量终浓度为0.5%，吐温-20质量终浓度为0.05%。
4.如权利要求1所述的人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，所述支撑底板为PVC或PS板。
5.如权利要求1所述的人H-FABP胶体金检测试纸的制备方法，其特征在于，所述的金标结合物垫为玻璃纤维或聚酯膜。
6.—种如权利要求1-5中任一项所述的制备方法制成的人H-FABP胶体金检测试纸。
7.如权利要求6所述的人H-FABP胶体金检测试纸，其特征在于，所述样品垫位于支撑底板一端，该样品垫的一端位于金标结合物垫上，与金标结合物垫交错重叠2mm ;所述金标结合物垫位于硝酸纤维素膜上，与所述硝酸纤维素膜交错重叠2mm ;吸水垫则在支撑底板的另一端，位于所述硝酸纤维素上，与所述硝酸纤维素交错重叠2-3mm。
8.一种如权利要求6所述的人H-FABP胶体金检测试纸在检测人血液中H-FABP的应用。
9.一种如权利要求6所述的人H-FABP胶体金检测试纸在检测人尿液中H-FABP的应用。
【文档编号】G01N33/544GK103901216SQ201410163289
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】黄芳芳, 金巍, 李基
申请人:上海科华生物工程股份有限公司