同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法
【专利摘要】本发明公开了同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法，包括有以下步骤：1）配制流动相、设置色谱条件；2）制备贮备液；3）专属性考察；4）线性关系考察；5）精密度试验；6）稳定性试验；7）样品含量测定。本发明的有益效果为：本发明提供的能够同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法，具有操作简便快速、结果准确可靠、测定时间方面限制较小的优点,同样适用于其他激素类药物。
【专利说明】同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肉类品质检测领域，具体涉及同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法。
【背景技术】
[0002]当前，我国食品安全问题因三鹿奶粉中“三聚氰胺”事件而受到更极大关注。除食品加工中恶意添加外，食品中污染的化学物质更多的来自于喂养畜禽所使用的动物饲料、治病所用兽药残留及催熟植物所用的生长调节剂等。激素类药物在牛羊产业中的应用可表现在提高样的繁殖性能，免疫去势，高饲料报酬、促进生长，改善牛羊肉品质，促进泌乳牛羊的产奶量等。我们所食用的牛羊肉也不可避免的会有雌激素残留，而这些激素就会通过食物链在人体内积累，可诱发癌变，对生殖与神经等系统带来影响，还造成严重的环境问题。还能增加妇女得子宫癌的可能，使生殖道产生炎症，使女性提前发育，使男性生殖器官发生异常与病变及女性乳腺癌和子宫内膜异位发生率上升，因此，对牛羊肉的监测也是保证安全的措施之一。但是目前国家标准中只有己烯雌酚的检测方法，而其余的没有明确的测定方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法。
[0004]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法，包括有以下步骤:
1)配制流动相、设置色谱条件:
按体积比甲醇:磷酸氢二钠为80:20配制流动相，色谱条件设置为检测波长210-400nm，流速为 1.0ml/min，进样量为 10 μ I ；
2)贮备液的制备:
①准确称取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的标准品各50mg，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，制成1.0 mg/ml标准品贮备液，备用；
②取批号不同的牛羊肉样品，用甲醇超声萃取、离心，取两次离心后的上清液蒸干后加甲醇，制成供试品贮备液，备用；
3)专属性考察:
在步骤I)所述的色谱条件下，对牛羊肉样品中的苯甲酸雌二醇进行HPLC分离检测；
4)线性关系考察:
分别精密量取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的标准品贮备液，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，过滤、进样并检测，以4种混标的峰面积比与其质量浓度进行线性回归分析；
5)精密度试验:取同一批号的牛羊肉供试品贮备液，加混合标准贮备液后，过滤进样，按外标法以峰面积测定4种雌激素的含量；
6)稳定性试验:
取另一批号的牛羊肉样品溶液于室温避光放置0-72h后，分别进样测定，每份样品10μ I ；
7)样品含量测定:
将步骤2)中所述的混合标准供试品贮备液，加标准品贮备液后，按外标法以峰面积计算样品中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的含量。
[0005]本发明的有益效果为:本发明提供的能够同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法，具有操作简便快速、结果准确可靠、测定时间方面限制较小的优点，同样适用于其他激素类药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1为4种雌激素标准样品图。
[0007]图2为兰州市羊肉样品四种雌激素检出图谱。
[0008]图3为临夏州羊肉样品四种雌激素检出图谱。
[0009]图4为兰州市牛 肉样品四种雌激素检出图谱。
【具体实施方式】
[0010]实施例1:
1、材料和方法:
1.1、材料:
1.1.1试剂:
甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
磷酸二氢钠(NaH2O4.2Η20):国药集团化学试剂有限公司，上海；
0.043mol/L磷酸二氢钠溶液:3.4g磷酸二氢钠(NaH2O4.2H20)溶于水并定容在500mL容量瓶中得到；
1.1.2标准品:
雌二醇标准品:SIGMA-AL0RICH, product of Germany ；
己烯雌酚标准品:SIGMA-AL0RICH，product of USA ；
苯甲酸雌二醇标准品:中国药品生物制品检定所 戊酸雌二醇标准品:中国药品生物制品检定所。
[0011]雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇标准储备液的制备方法:
精密称取50mg雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇标准品，分别用甲醇定容在50mL容量瓶中，即得到每个单标的储备液为！!!^/!!!!^然后分别吸取〗；mL雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇标准储备液混合，再将混合储备液用甲醇分别稀释至
0.4mg/mL、0.5 mg/mL> 1.0 mg/mL,存放在冰箱中备用。
[0012]1.2、方法:
1.2.1前处理方法:分别在甘肃省兰州市、靖远县、临夏州、张掖地区采集羊肉样品20份，张掖地区牛肉样品20份。称取粉碎样品5.0g，放入20mL带盖离心管中，加甲醇10.01^，超声萃取201^11，离心10 min (10000转/min,移出上清液。残禮:中再加10.0mL甲醇,再超声萃取20 min，离心10 min (10000转/min)，合并上清液于80°C水浴蒸干。用24mL甲醇溶解残渣，经
0.22 μ m 一次性有机滤膜过滤，准备上机。
[0013]1.2.2仪器及条件:
Waters e2695高效液相色谱仪，配有2998 PAD检测器；超声波清洗器；色谱柱:C18，(^5 4 111，15(^4臟；流动相:甲醇:磷酸氢二钠=80:20 ;流速:1.0mL/min ;柱温:40°C ;检测波长:280nm。分别取雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的单个标准品及0.4mg/mL、0.5 mg /mL、L0 mg /mL的混合标样经0.45 μ m的有机滤膜过滤,取10 μ L依次注入HPLC中，先用标准品的出峰时间定性，再用混合标样做定量标准工作曲线。
[0014]1.2.3计算公式:
X=V1CAiV2 ；
式中:
X:样品中某一种雌激素的含量(mg /Kg)；
C:在标准曲线上查出来的某一种雌激素的浓度(ng)； V1:样品的最终溶解体积(mL)；
V2:进样体积(μ L); m:样品质量(g)。
[0015]2、结果显示:
如图1所示为4种雌激素标准样品检测结果。
[0016]表1为本发明方法的线性范围、相关性及检出限；
表2为4种组份峰面积(Area)测定的精密度结果；
表3为本发明样品加标回收率结果；
表4为多个地区样品测定结果。
[0017]其中，“一”表示未检出，检出量单位为mg/Kg，所测样品均为加标样品。
[0018]表1
【权利要求】
1.同时测定牛羊肉中四种雌激素残留量的方法，其特征在于，包括有以下步骤: 1)配制流动相、设置色谱条件: 按体积比甲醇:磷酸氢二钠为80:20配制流动相，色谱条件设置为检测波长210-400nm，流速为 1.0ml/min，进样量为 10 μ I ； 2)贮备液的制备: ①准确称取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的标准品各50mg，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，制成1.0 mg/ml标准品贮备液，备用； ②取批号不同的牛羊肉样品，用甲醇超声萃取、离心，取两次离心后的上清液蒸干后加甲醇，制成供试品贮备液，备用； 3)专属性考察: 在步骤I)所述的色谱条件下，对牛羊肉样品中的苯甲酸雌二醇进行HPLC分离检测； 4)线性关系考察: 分别精密量取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的标准品贮备液，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，过滤、进样并检测，以4种混标的峰面积比与其质量浓度进行线性回归分析； 5)精密度试验: 取同一批号的牛羊肉供试品贮备液，加混合标准贮备液后，过滤进样，按外标法以峰面积测定4种雌激素的含量； 6)稳定性试验: 取另一批号的牛羊肉样品溶液于室温避光放置0-72h后，分别进样测定，每份样品10μ I ； 7)样品含量测定: 将步骤2)中所述的混合标准供试品贮备液，加标准品贮备液后，按外标法以峰面积计算样品中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的含量。
【文档编号】G01N30/02GK103983708SQ201410187686
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】李维红, 高雅琴, 熊琳, 杜天庆, 牛春娥, 梁丽娜, 杨晓玲, 郭天芬 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所