胶原纤维负载酿酒酵母作为生物传感器识别元件快速测定bod的方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物传感器领域的以胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法。该方法包括选择胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件、制备胶原纤维负载酿酒酵母生物敏感膜的工艺、利用胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件对BOD的快速测定方法，以及固定化生物敏感膜的保存和活化方法。本发明拓宽了微生物传感器领域中微生物的固定化材料；这种微生物膜具有透水性好、传质效果好、酿酒酵母活性高、稳定性强等优点，其良好的透水性和传质性能使得BOD微生物传感器的制作成本大大降低，同时使得传感器具有较大的测量范围。由此膜组成的生化需氧量生物传感器对GGA标准液的响应范围为BOD510-250mg/L，响应时间为3-15min，微生物膜可连续使用150次以上。
【专利说明】胶原纤维负载酿酒酵母作为生物传感器识别元件快速测定BOD的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感器领域，提供了用于生化需氧量生物传感器的胶原纤维负载酿酒酵母生物敏感膜的制备及其使用方法。
【背景技术】
[0002]BOD (生化需氧量)是表示水中有机物经微生物生化作用分解时所消耗的溶解氧量，是水质监测中十分重要的一项指标。BOD值越高表示水中的有机物含量越高，水体被污染程度越严重。常规的BOD值测定方法是5日生化需氧量接种稀释法出005法)，即样品在20±1°C的条件下培养5d，测定样品培养前后的溶解氧，两者之差即为5日生化需氧量。由于此法具有分析周期长，操作复杂，重现性差，不宜现场监测等不足，国内外研究者提出了高温法、紫外光谱法、检压式库仑计法、活性污泥曝气降解法、微生物传感器法等检测水样BOD的方法，其中微生物传感器法具有测定周期短、测量精度高、重现性好、能够连续在线监测等优点。
[0003]微生物传感器主要由固定化微生物和信号转换装置组成，其中微生物敏感膜对传感器的灵敏度、稳定性、使用寿命、测量范围、响应时间等性能有着决定性的影响，是BOD微生物传感器研究的核心内容。多年来，各国学者对此做了诸多尝试，探索出了吸附法、夹层法、交联法和包埋法等微生物固定化方法，常用到的固定化材料有聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇、醋酸纤维膜、异氰酸盐、氨基硅烷等。但这些方法普遍存在着细胞渗漏、抑制细胞活性、膜堵塞等不足，从而影响了传感器的稳定性、使用寿命、测量范围等性能。
[0004]由上述材料制备的微生物膜还存在着以下两方面的问题:
其一，由于常用固定化材料的通透性较差，传感器中氧电极测量的溶解氧含量远远小于测试水样中的真实溶解氧含量，使得电信号减弱了 3-6个数量级。所以组成传感器时需要灵敏度较高的溶解氧仪器的支持，这就使得整体传感器的成本大幅上升；
其二，BOD微生物传感器的测量范围受固定化微生物细胞的数量及活性和固定微生物材料传质性能的影响。以往研究中所用的材料大多以牺牲固定化微生物细胞活性来提高固定化数量及材料的传质性能，不能很好平衡或解决它们之间的矛盾，导致传感器测量范围较窄，一般仅能到几十毫克每升，低于城市污水的BOD水平，测量时需要对被测样进行稀释。
[0005]胶原纤维是一种天然高分子材料，是牛、羊、猪等动物皮经清洗、碱处理、剖皮、脱碱、脱水、干燥、研磨等工序处理后制成，具有机械性能好、耐曝气强度高、传质效果好、透水性及持水性能好、成本低廉、生物相容性好、酸碱适应范围广等优点。经金属离子改性后，胶原纤维在保持原有优点基础上获得了较好的耐生物降解性和热稳定性。金属离子改性后的胶原纤维对微生物具有较强的吸附能力，有研究表明经改性后的胶原纤维固定化的酿酒酵母具有较游离酿酒酵母更好的发酵性能，说明胶原纤维固定化酿酒酵母具有更高的生物活性。[0006]本专利针对现有BOD生物传感器存在的问题，以胶原纤维固定化酵母细胞为响应元件制备BOD微生物传感器，经试验得到微生物敏感膜的制备技术及使用方法，并确定该传感器的测量范围、响应时间、使用寿命等性能。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种以胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在于，该方法包括选择胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件，制备胶原纤维负载酿酒酵母生物敏感膜的方法，利用胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件对BOD的快速测定方法，以及该固定化酿酒酵母的保存方法和该微生物敏感膜的活化方法;
所述胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件的原因如下:
1)胶原纤维作为一种天然高分子材料，具有机械性能好、耐曝气强度高、透水及持水性能好、传质效果好、成本低廉、生物相容性好、酸碱适应范围广等优点；
2)经金属离子改性后的胶原纤维在保持胶原纤维原有优良性能的基础上，更具备了良好的耐热性和耐生物降解性；
3)金属离子改后的胶原纤维对微生物表现出较强的吸附性能，且金属离子锆(Zr)改性后胶原纤维作为载体固定化酿酒酵母具有较游离酿酒酵母更强的发酵性能，即更高的生物活性；
4)良好的透水性使得由该材料制备的BOD微生物传感器无需高精度的溶解氧仪，可大大降低传感器的设备成本；
5)良好的传质效果使得由该材料制备的BOD微生物传感器具有较宽的测量范围，减少实际测量中的稀释过程；
6)胶原纤维负载酿酒酵母具有使用寿命长、固定化微生物保存和活化方法简单的特点。
[0008]所述金属离子锆(Zr)改性胶原纤维固定化载体(ZICF)由已有方法制备(发明专利:胶原纤维固载金属离子吸附材料及其制备方法和用途，专利号:200410040145.0)。
[0009]所述固定化酿酒酵母的制备方法:称取干重0.5g ZICF置于无菌水中浸泡5_12h。酿酒酵母经液体PDA培养基活化培养后(30°C，震荡培养30-36h)，经离心、无菌水清洗后收集细胞于生理盐水中制得菌悬液，并调节菌悬液浓度为106-109cfu/mL。将ZICF过滤后加入上述菌悬液中，震荡吸附5h后用无菌水清洗至无游离菌检出，即得胶原纤维固定化酿酒酵母。
[0010]所述生物敏感膜的制备方法:每次称量湿重为0.60-0.90g的胶原纤维固定化酿酒酵母，将固定化酿酒酵母置于两层200目尼龙网之间，使之形成一层胶原纤维膜，即微生物膜，使用时将该膜紧贴于溶解氧电极头前的半透膜上。
[0011]所述利用胶原纤维负载酿酒酵母作为生物敏感膜对BOD的快速测定方法:测量时，将附有固定化酿酒酵母的溶解氧电极头置于盛有0.07mol/L磷酸氢二钠、磷酸二氢钾缓冲液的测量杯中，以24L/h的曝气强度对缓冲液进行曝气，测量温度为30°C、pH为6，无机盐离子浓度范围为0-3.5% ;待溶解氧(DO)值达到稳定后加入样品，固定化微生物分解样品中的有机物导致水中溶解氧下降到另一个稳定值，求得前后两次溶氧值之差，通过标准曲线计算所测水样的BOD值。
[0012]所述固定化酿酒酵母的保存方法:胶原纤维固定化酿酒酵母在0.07 mol/L磷酸氢二钠、磷酸二氢钾缓冲液中，PH为6，4 °C条件下保存4个月后其活性仍然良好。
[0013]所述固定化酿酒酵母的活化方法:将存于4°C条件下的固定化酿酒酵母在30°C条件下于原溶液中放置24h。组成BOD传感器后对浓度为50mg/L的GGA溶液反复测定8_10次，DO下降值连续5次相对偏差小于5%，即完成固定化酿酒酵母的活化。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是BOD5为10-250mg/L范围的GGA溶液的标准曲线。
【具体实施方式】
[0015]实例1:以本发明提出的胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件，对不同浓度的GGA (葡萄糖谷氨酸)溶液的测定。
[0016]分别配置BOD5浓度为5、10、25、50、75、125、150、175、200、225、250、275、300mg/L
的GGA溶液，用胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件与溶解氧电极结合组成BOD微生物传感器，测定上述浓度的GGA溶液。测定条件为:温度30°C，pH=6,曝气强度24h/L，磁力搅拌子转速使溶氧显示值在4-7mg/L。
[0017]测定结果表明，DO下降值与样品BOD浓度之间具有良好的线性关系，在BOD5浓度10-250mg/L范围内，线性相关系数大于0.995，满足BOD测量的精度要求。
[0018]实例2:以本发明提出的胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件，在30°C、pH为6，曝气强度24L/h条件下对BOD5值为30mg/L、50mg/L、100 mg/L的GGA溶液进行测定，测定传感器的结果重现性，结果如表1所示:
表1传感器重现性测定结果
【权利要求】
1.一种以胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在于，该方法包括选择胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件、制备胶原纤维负载酿酒酵母生物敏感膜的工艺和利用胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件对BOD的快速测定，以及该固定化酿酒酵母的保存方法和该微生物敏感膜的活化方法。
2.权利要求1所述以胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在于，所述的微生物固定化载体为金属离子锆(Zr)改性后的胶原纤维(ZICF)。
3.权利要求1所述以胶原纤维负载酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在于，所述的固定化微生物种类为酿酒酵母。
4.权利要求1所述胶原纤维负载酿酒酵母的制备:称取干重0.5gZICF置于无菌水中浸泡5-12h ;酿酒酵母经液体PDA培养基活化培养后(30°C，震荡培养30_36h)，经离心、无菌水清洗后收集细胞于生理盐水中制得菌悬液，并调节菌悬液浓度为106-109cfu/mL ;将ZICF过滤后加入上述菌悬液中，震荡吸附5h后用无菌水清洗至无游离菌检出，即得胶原纤维固定化酿酒酵母。
5.权利要求1所述胶原纤维负载酿酒酵母生物敏感膜的制备:每次称量湿重为0.60-0.90g的胶原纤维固定化酿酒酵母，将固定化酿酒酵母置于两层200目尼龙网之间，使之形成一层胶原纤维膜，即微生物膜，使用时将该膜紧贴于溶解氧电极头前的半透膜上。
6.权利要求1所述利用胶原纤维负载酿酒酵母作为生物敏感膜对BOD的快速测定:测量时，将附有固定化酿酒酵母的溶解氧电极头置于盛有0.07mol/L磷酸氢二钠、磷酸二氢钾缓冲液的测量杯中，以24L/h的曝气强度对缓冲液进行曝气，测量温度为30°C、pH为6，无机盐离子浓度范围为0-3.5%，待溶解氧值达到稳定后加入样品，固定化微生物分解样品中的有机物导致水中溶解氧下降到另一个稳定值，求得前后两次溶氧值之差，通过标准曲线计算所测水样的BOD值。
7.权利要求1所述的胶原纤维负载酿酒酵母的保存方法，其特征在于，胶原纤维负载酿酒酵母的保存条件为0.07mol/L磷酸盐缓冲液，pH为6，温度4°C。
8.权利要求1所述的胶原纤维负载酿酒酵母的活化方法，其特征在于，胶原纤维负载酿酒酵母的活化方法为:将存于4 °C条件下的固定化酿酒酵母在30 °C条件下于原溶液中放置24h ;组成BOD传感器后对浓度为50mg/L的GGA溶液反复测定8_10次，DO下降值连续5次相对偏差小于5%，即完成固定化酿酒酵母的活化。
【文档编号】G01N27/26GK103969303SQ201410204412
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】不公告发明人 申请人:四川农业大学